大黄结合型蒽醌与大黄鞣质的分离方法

摘要

本发明公开了一种大黄结合型蒽醌与大黄鞣质的分离方法，属于蒽醌的分离。本发明按重量份数比称取中药材大黄个子货1份，加入4-15份沸水煎煮，收集药液；大黄个子货切片后用沸水提取3-4次，每次加水量10-25份，过滤，合并全部药液；将大豆蛋白粉0.1-0.5份加入药液中，静置、60-80目筛过滤，将沉淀物低温干燥得大黄鞣酸蛋白提取物，实现大黄鞣质分离；取上清液通过已处理好的大孔树脂，用50％-90％浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得大黄结合型蒽醌提取物。由于大豆蛋白是一种食品成分，无毒无害。因此，本发明一举两得，分别获得大黄结合型蒽醌提取物和大黄鞣酸蛋白提取物。

说明书

技术领域

本发明涉及蒽醌的分离，具体是大黄结合型蒽醌与大黄鞣质的分离方法。

技术背景

大黄来源蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Baill.)的干燥根及根茎，功效为泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经。

大黄成分主要有：蒽醌类、二苯乙烯苷类、色酮类、萘酚苷类、鞣质等，其中蒽醌类含量为3％-5％，分为结合型蒽醌和游离型蒽醌，游离型蒽醌包括有大黄酸(rhein)、大黄素(emodin)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄素甲醚(physcion)、异大黄素(isoe modin)、大黄酚(chysophanol)等，结合型蒽醌主要包括蒽醌苷和双蒽醌酮苷。大黄中的蒽醌类衍生物成分主要有泻下作用、抗菌作用、止血活血、退热作用、抗炎作用、防治肠源性肺损伤等作用。

鞣质在大黄中含量为5％左右，具有收敛作用，故在致泻后可产生继发性便秘。大黄鞣质可降低血管的通透性，改善脆性、兴奋胃肠道的局部血管，提高离体血管条的收缩力和自发节律性，同时也显著增加纤维蛋白原活性，使凝血时间与出血时间明显缩短，有助止血；另外，鞣质还能降低抗凝血酶？的活性，升高？巨球蛋白的含量，竞争性地抑制纤溶酶及纤溶酶原活化素的活力，使纤溶酶活力降低，并增加血小板的粘附性和聚集能力，从而加速止血，说明大黄鞣质是大黄祛瘀止血的有效成分。

根据大黄的理化性质，其结合型蒽醌易溶于水，受热易分解为游离型蒽醌。大黄传统的炮制方法，用冷水闷润浸透再切片，在浸润过程中，一部分结合型蒽醌流失，一部分由于长时间闷润分解，因此，饮片的结合型蒽醌含量比原净制后的大黄根或根茎(又称个子货)含量减少很多。为了增强大黄的泻下作用，汤剂入药一般后下，这样既可避免结合型蒽醌分解，也可相对较少提取出鞣质成分。即使这样，由于鞣质极易溶于水，大量的大黄鞣质仍可伴随着结合型蒽醌一起提取出来。

目前除去药用植物中的鞣质的方法有热处理、冷放置法、石灰乳-硫酸沉淀法、明胶沉淀法、聚酰胺吸附法、酸性及碱性醇沉法、铅盐沉淀法等。但是鞣质的除去是中药制剂中的一个难题，有些除鞣质的方法在除去鞣质的同时大量有效成分也被除去，有些方法还将引入其它杂质。

鞣质为大分子多元酚类混合物，有与蛋白结合成不溶性鞣酸蛋白的性质，曾有利用这个性质用明胶除鞣质。

大豆制品在慢性肾功能衰竭中的应用曾受到严格限制，近年来的研究发现大豆蛋白对延缓慢性肾衰竭有一定的有益作用。试验中观察到补充大豆蛋白的膳食干预，可使收缩压下降4.23mmHg，舒张压下降3mmHg，显示大豆蛋白可以预防高血压，美国FDA也认可大豆蛋白具有降胆固醇的作用。

中国专利1349966公开了“大黄总蒽醌的提取纯化方法及其在制备治疗肾衰药品中的应用”，提取方法包括如下步骤：(1)将大黄饮片和浓乙醇按1∶4-8的重量比混合，按回流法提取三次；(2)滤过提取液，回收乙醇，将滤液制成浸膏；(3)将浸膏加入大孔吸附树脂柱，用重量为大黄饮片8-16倍的稀乙醇冲洗，弃去冲洗液，继续用浓乙醇冲洗；(4)取洗脱液，回收乙醇至无醇味后将洗脱液的pH值调至酸性；(5)滤过洗脱液，将沉淀得到的固体物质干燥即成。以大黄总蒽醌为有效成份的治疗肾衰的药品，其中大黄总蒽醌的含量应在50％以上。本发明提取大黄总蒽醌的工艺简单、成本低廉、且无环境污染问题，提取出的大黄总蒽醌对肾衰有明显的疗效。

中国专利1810756公开了“一种超临界二氧化碳萃取大黄总蒽醌的方法”，在本发明中，大黄粉末直接或经不同浓度酸溶液处理后用乙醇等溶液对其进行浸润，放入萃取釜中以超临界状态的二氧化碳为萃取溶剂，以乙醇为夹带剂和溶剂进行提取，萃取环境为压力20～60Mpa、温度30～60℃的条件下萃取0.5～3小时，分离釜中在温度15～45℃下减压解析分离，收集含大黄总蒽醌的乙醇溶液，经减压浓缩干燥后得到总蒽醌提取物。

《时珍国医国药》2005年第16卷第8期756-758，公开的“大黄总蒽醌提取与醇化工艺的研究”，它是用大黄加水重沸煎煮3次，每次加水15倍量，20min/次，有效成分可提取完全。通过大孔吸附树脂富集与醇化，用70％乙醇洗脱，总蒽醌得洗脱收率在80％以上，总固物收率明显降低至6.45％。

发明内容

本发明的目的是提供一种大黄结合型蒽醌与大黄鞣质的分离方法。

本发明是按照如下技术方案实现：

一种大黄结合型蒽醌与大黄鞣质的分离方法，按重量份数比称取净制后的中药材大黄个子货1份，加入4-15份沸水煎煮15-35min，60-80目筛过滤，收集药液；大黄个子货切片后用沸水提取3-4次，每次加水量10-25份，时间10-40分钟，过滤，合并全部药液；将大豆蛋白粉0.1-0.5份加入药液中，静置24小时，60-80目筛过滤，将沉淀物低温干燥得大黄鞣酸蛋白提取物，实现大黄鞣质分离；取上清液通过已处理好的大孔树脂，用50％-90％浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得大黄结合型蒽醌提取物。

由于在本发明中使用的是大豆蛋白粉，大豆蛋白是一种食品成分，无毒无害，可以将大黄有效成分蒽醌类成分及有效成分大黄鞣质分离。后者是与大豆蛋白结合成大黄鞣酸蛋白，除分离得到的有效成分大黄蒽醌外，所得的大黄鞣酸蛋白也具有较高的利用价值。使用大豆蛋白沉淀大黄提取液，既对蒽醌类成分几乎没有什么影响，也可以吸附大部分鞣质，使提取物中的鞣质含量显著减少。因此，通过本发明可以一举两得，分别获得大黄结合型蒽醌提取物和大黄鞣酸蛋白提取物。

附图说明

图1是大黄水提取原液高效液相色谱图谱；

图2是大黄水提取液经大豆蛋白沉淀后的上清液高效液相色谱图谱；

图3是大黄洗脱液高效液相色谱图谱。

具体实施方式

实施例1：

(1)挑选、洗净的中药材大黄个子货(根或根茎)1kg，加沸水15kg，煎煮30分钟，80目筛过滤，收集药液；大黄个子货切成0.5mm-2mm的薄片，分别加10kg沸水提取3次，每次20分钟，合并全部药液，加大豆蛋白粉222g，静置24小时，80目筛过滤，将沉淀物低温干燥得大黄鞣酸蛋白提取物，实现大黄鞣质分离；上清液通过已处理好的大孔树脂，用70％浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得大黄结合型蒽醌提取物。

(2)含量测定方法：大黄结合型蒽醌含量测定，参考发明专利申请200510094530.8“治疗肠源性内毒素血症复方药物颗粒及其制备方法”中“结合型蒽醌的含量测定”方法。鞣质含量测定方法参考中国药典2005年版一部附录XB“鞣质含量测定法”测定。

结合型蒽醌的含量测定：精密吸取相当于大黄药材0.1g的提取液于圆底烧瓶中，烘干，加乙醚30ml于40℃水浴回流提取30分钟，取出，放至室温，小心吸出乙醚液，第二次加乙醚20ml于40℃水浴回流提取20分钟，取出，放至室温，小心吸出乙醚液，第三次加乙醚20ml于40℃水浴回流提取15分钟，取出，放至室温，小心吸出乙醚液；残渣挥干乙醚，加20％硫酸溶液2.5ml，室温振摇5分钟，加氯仿50ml于80℃水浴回流水解60分钟，取出，放至室温，分取氯仿液；第二次加氯仿30ml，振摇，稍静置，分取氯仿液：第三次加氯仿液20ml，振摇，稍静置，分取氯仿液；合并氯仿液，加适量无水硫酸钠脱水，滤过，并用少量氯仿洗涤残渣，回收溶剂至干，残渣加甲醉定容至25ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。以大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的甲醇溶液为对照，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶1％高氯酸之比85∶15为流动相；检测波长254nm。

鞣质的含量测定：

对照品溶液的制备：

精密称取没食子酸对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号0831？501)54.1mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.0541mg)。

标准曲线的制备：

精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应的试剂为空白，用紫外可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，曲线方程为：C＝8.6061×A-0.3763。

供试品溶液的制备：

精密量取相当于约40mg药材的提取液或洗脱液，加入50ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法-总酚：

精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

-不被吸附的多酚：

精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

按下式计算鞣质含量：

鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量

大黄鞣酸蛋白含量：

大黄鞣酸蛋白含量＝大黄提取液鞣质含量-蛋白吸附后上清液中鞣质含量

(3)未经大豆蛋白粉吸附沉淀鞣质的提取液通过大孔树脂吸附后的结合型蒽醌含量6.005mg/g，鞣质含量20.96mg/g。而本发明所述结合型蒽醌含量5.966mg/g，且与未经吸附沉淀鞣质的大黄提取物中结合型蒽醌图谱一致(见附图)，含量基本没有损失，鞣质含量7.59mg/g，减少了63.8％。

(4)比较未经大豆蛋白吸附工艺的提取物与本发明所述的大黄提取物的泻下作用，主要药理实验为小鼠小肠炭末推进法。经数据统计，有泻下作用增强的趋势，平均推进率由69.2％延长至76.3％。

(5)本发明通过大豆蛋白吸附鞣质及大孔树脂富集精制，即减小了提取物的体积，又增强了其泻下药理作用，其副产品大黄鞣酸蛋白也具有开发价值。

实施例2：

挑选、洗净的中药材大黄个子货(根或根茎)1kg，加10kg沸水，煎煮20分钟，80目筛过滤，收集药液；大黄个子货切成0.5mm-2mm的薄片，分别加15kg沸水提取4次，每次15分钟，合并全部药液，加大豆蛋白粉125g，静置24小时，80目筛过滤，将沉淀物低温干燥得大黄鞣酸蛋白提取物，实现大黄鞣质分离；上清液通过已处理好的大孔树脂，用60％浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得大黄结合型蒽醌提取物。

实施例3：

挑选、洗净的中药材大黄个子货(根或根茎)1kg，加4kg沸水，煎煮15分钟，80目筛过滤，收集药液；大黄个子货切成0.5mm-2mm的薄片，分别加20kg沸水提取3次，每次30分钟，合并全部药液，加大豆蛋白粉333g，静置24小时，80目筛过滤，将沉淀物低温干燥得大黄鞣酸蛋白提取物，实现大黄鞣质分离；上清液通过已处理好的大孔树脂，用80％浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得大黄结合型蒽醌提取物。

实施例4；

挑选、洗净的中药材大黄个子货(根或根茎)1kg，加5kg沸水，煎煮20分钟，80目筛过滤，收集药液；大黄个子货切成0.5mm-2mm的薄片，分别加15kg沸水提取4次，每次20分钟，合并全部药液；加大豆蛋白粉166g，静置24小时，80目筛过滤，将沉淀物低温干燥得大黄鞣酸蛋白提取物，实现大黄鞣质分离；取上清液通过已处理好的大孔树脂，用85％浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得大黄结合型蒽醌提取物。

实施例1-4中所述大豆蛋白粉购自河南安阳漫天雪蛋白有限公司，所用全溶解大豆蛋白粉中蛋白质含量≥90％。