检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及其PCR扩增方法

摘要

一种改进的检测脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及方法，其特点是采用专门设计的特殊引物，通过特殊的PCR程序将ATXN3基因内含有CAG重复序列的DNA片段量扩增至凝胶电泳可观察的程度，利用凝胶电泳观察PCR扩增产物片段大小并估算ATXN3基因中CAG动态突变的重复次数。本发明的优点是：1.简单经济，不需测序，一般分子生物学实验室或检验室就可操作，从而建立了一个简便易行的扩增CAG重复序列的检测方法。2.灵敏度及可靠性高，25ng基因组DNA就足够检测ATXN3基因中CAG动态突变的重复次数，为临床诊断脊髓小脑共济失调提供可靠的依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域中的临床检测技术，具体涉及一种新的检测脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及PCR扩增方法，该检测结果可用于临床辅助诊断脊髓小脑共济失调。

背景技术

脊髓小脑共济失调(Spinocerebeller Ataxia，SCA)是一组以进行性平衡和协调障碍为特点的中枢神经系统慢性退行性疾病，以前曾被称为常染色体显性共济失调(Autosomal Dominant Cerebellar Ataxias，ADCAs)。脊髓小脑共济失调的主要病变部位在脊髓、小脑和脑干，其他组织如脊神经、脑神经、交感神经、基底节、丘脑、丘脑下部和大脑皮质均可受累，还可伴有其他系统异常，如骨骼畸形，眼部病症，前庭及听力障碍，心脏、内分泌及皮肤病变等。由于病变部位多样化及损害程度轻重不等，故症状复杂，临床和病理分类也甚混乱。1983年英国神经病学家Harding按神经病理标准分类将ADCAs分为3种类型：I型除小脑共济失调外还包括眼球运动障碍、慢眼运动、视神经萎缩、锥体束征、肌萎缩、周围神经病和痴呆；II型以小脑共济失调伴视网膜色素变性为特征；III型为单纯小脑共济失调。

随分子生物学技术的发展，1993年SCA的第一个亚型SCA1的易感基因被定位克隆，随后许多SCA的致病基因被识别出来，于是按照各亚型发现的先后顺序依次命名为SCA1～SCA27等，这种分子遗传学分类已经成为国际上惯用的分类方法。SCA具有遗传异质性，其最具特征的基因缺陷是编码多聚谷氨酰胺的CAG三核苷酸重复序列的延长，这导致相关蛋白的构象变化并在神经元内形成聚集体，最终导致神经元的缺失。其他突变类型包括CTG三核苷酸(SCA8)、ATTCT五核苷酸(SCA10)重复序列扩增以及某些基因的点突变。由CAG重复序列异常扩增引起的SCA的症状往往与CAG重复序列的大小有关，一般而言，重复次数越大，病情愈重。

临床上通常根据共济失调、构音障碍、锥体束征等典型共同症状，以及伴眼肌麻痹、锥体外系症状及视网膜色素变性等表现，结合MRI检查发现小脑、脑干萎缩，排除其他累及小脑和脑干变性病可进行初步诊断。然而，仅根据各亚型特征性症状、体征确诊仍不准确(SCA7除外)，最终确诊需要进行基因诊断，具体是检测相应基因内CAG的重复次数，以准确判定亚型。

SCA3又称为约瑟夫氏病(MJD)，是我国最常见的SCA亚型，相关基因ATXN3位于14q24.3-q32.2，编码960个氨基酸残基组成ataxin-3蛋白。CAG重复序列位于4号外显子，正常人的重复次数在12-41之间，而患者的重复次数为61-89。于是可以通过PCR方法检测CAG重复序列的大小来判断该基因是否突变。然而，该基因内CAG重复序列的GC含量高达67％，极大地增加了该序列PCR扩增的难度。现有技术采用序列表SEQ ID No.1中所示的正向引物碱基序列和序列表SEQ ID No.2中所示的反向引物碱基序列作为一对引物进行PCR扩增，得到的结果如附图1的左侧所示，特异性不高。

发明内容

本发明提供一种检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及其PCR扩增方法，目的是解决现有PCR扩增ATXN3基因CAG重复序列特异性不高的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物，采用以下一对引物(5’→3’)：

正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG；

反向引物：CATGATGAATGGTGAGCAGG。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的PCR扩增方法，

(1)PCR扩增采用以下一对引物(5’→3’)：

正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG；

反向引物：CATGATGAATGGTGAGCAGG；

(2)PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成：

第一阶段由30～40次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为94℃～98℃；

退火：起始温度为70℃，每两次扩增循环温度递减1℃，直至扩增循环结束；

延伸：温度为68℃～72℃；

第二阶段由10～20次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为94℃～98℃；

退火：温度为53℃～55℃；

延伸：温度为68℃～72℃。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，PCR(polymerase chain reaction)扩增是一种体外扩增DNA片段的方法，即聚合酶链式反应方法。采用这种方法，在反应系统中只要有一个拷贝的待扩增DNA片段，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段。该方法广泛应用于基因检测。

PCR扩增的基本原理是：模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列退火复性、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。一般反应过程是：1、将反应体系加热至90～98℃，模板双链DNA变性成为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板；2、降温至37～60℃，使两种引物分别与模板DNA链的互补序列退火复性；3、升温至70～75℃，在耐热性DNA聚合酶催化下，四种脱氧核糖核酸按与模板碱基配对原则沿引物5’→3’方向延伸，合成模板DNA链的互补链。重复以上过程，就可以出现待扩增的特异性DNA片段。由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍，因此PCR经过n次循环后，理论上，待扩增的特异性DNA片段可达到2n个拷贝数。

2、上述方案中，在PCR扩增的第一阶段，退火温度：第一和第二扩增循环为70℃，第三和第四扩增循环69℃，每两次递减1℃，以此类推。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：

1、本发明采用特殊设计的引物，其PCR产物特异性非常高。利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物的数量和大小来判断脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变情况。

2、本发明采用特殊的PCR程序，PCR效率和灵敏度高，可以检测微量DDNA样本中脊髓小脑共济失调ATXN3基因中CAG重复序列动态突变，为临床诊断脊髓小脑共济失调提供可靠的依据。

3、本发明经济，不需测序。

4、本发明操作简单，一般分子生物学实验室或检验室就可操作。

5、本发明建立了一个的简便易行的扩增CAG重复序列的PCR方法，为提高生物样本临床检测水平，及其推广应用奠定基础。

附图说明

附图1为采用现有引物和本发明的PCR扩增方法得到的DNA扩增体系凝胶电泳图；

附图2为采用本发明的引物和现有PCR扩增方法得到的DNA扩增体系凝胶电泳图；

附图3为采用本发明的引物和本发明的PCR扩增方法得到的DNA扩增体系凝胶电泳图；

附图4为CAG重复序列测序结果。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：一种检测脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物，采用以下一对引物(5’→3’)：

正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG；

反向引物：CATGATGAATGGTGAGCAGG。

本实施例可以通过上述一对引物检测脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变。

实施例二：一种检测脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变的PCR扩增方法，包括下列步骤：

第一步：准备DNA

(1)、从人体抽取血液样本。

(2)、从血液样本中获取DNA，即血液样本中白细胞基因组DNA样品准备。

试剂准备：

抗凝剂：每100ml抗凝剂含0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖。

红细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCl，pH 7.6；

              5mmol/L MgCl₂；

              10mmol/L NaCl；

白细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCl，pH 7.6；

              10mmol/L EDTA(pH 8.0)

              50mmol/L NaCl

10mg/ml蛋白酶K(Protease K)：10mg Protease K溶于1ml ddH₂O(双蒸水)，分装，于-20℃保存。使用时，在4℃融化。

从血样中获取DNA过程：

①、取3ml新鲜血液加0.5ml抗凝剂，混匀，1500rpm离心10min，小心吸取红细胞与血清之间呈一层乳白色的白细胞到一个新的15ml离心管。

②、加10ml红细胞裂解液，轻轻混匀，放置10min，并经常对溶液进行混匀以充分裂解红细胞。

③、1500rpm离心10min，弃上清，沉淀为白细胞。

④、加白细胞裂解液3ml，加50μl10％SDS和50μl的10mg/ml蛋白酶K，50℃温育过夜。

⑤、加等体积苯酚∶氯仿(1∶1)，轻柔混匀15次，5000rpm离心10min，取上层水溶液。

⑥、加60μl 5mol/L NaCl，轻轻混匀。再加2/3体积异丙醇，轻轻混匀5min，可见白色絮状沉淀即基因组DNA。

⑦、8000rpm离心10min，弃上清。

⑧、加体积浓度为70％的乙醇10ml，轻轻旋转离心管，使管壁都充分接触到乙醇。

⑨、8000rpm离心5min，弃上清，室温风干明显的乙醇液滴，不要使白色沉淀干透，否则基因组DNA难溶于水。

⑩、加无菌去离子水500μl，置于摇床，室温轻轻摇2h。之后，4℃过夜，使其充分溶解。

第二步：对DNA进行扩增

利用PCR扩增方法，以第一步获取的基因组DNA为模板，采用以下一对引物(5’→3’)进行扩增：

正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG

反向引物：CATGATGAATGGTGAGCAGG

具体操作为：

①、将上述一对引物分别与获取的DNA、4种碱基、MgCl₂溶液、PCR反应缓冲液、耐热性DNA聚合酶、去离子水按一定比例混合构成单独的反应体系，具体见下表：

  ddH₂O  14μl  10×PCR Buffer  2μl  dNTP(各2.5mM)  1.6μl  MgCl₂(25mM)  1μl  一对引物(各10mM)  各0.4μl  Taq DNA聚合酶(5U/μl)  0.3μl  基因组DNA(约50ng/μl)  0.5μl

②、对上述反应体系进行PCR循环，扩增含CAG重复序列的DNA片段。PCR循环条件见下表：

第三步：凝胶电泳

采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳；得到的凝胶电泳图如附图3所示。CAG重复序列测序结构如图4所示。

第四步：观测结果

根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变情况，具体判断方法如下：

(1)、如果观察到对应泳带中出现一条DNA条带，则该对等位基因CAG重复数相同；如果观察到对应泳带中出现两条DNA条带，该对等位基因CAG重复数目不同；

(2)、当PCR扩增采用如上所述一对引物时，若DNA条带大于417个碱基时，则CAG重复数目大于60，具体重复次数X计算公式为：

X＝(N_bp-237)/3，

其中N_bp为电泳显示的条带长度。

对比例一：

采用以下一对引物(5’→3’)：

正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG

反向引物：TGGCCTTTCACATGGATGTGAA

PCR扩增方法同实施例一，

得到的PCR扩增体系凝胶电泳图如附图1所示。

对比例二：

采用以下一对引物(5’→3’)进行扩增：

正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG

反向引物：CATGATGAATGGTGAGCAGG

PCR方法采用现有技术方法(即退火温度不递减)。

得到的PCR扩增体系凝胶电泳图如附图2所示。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

Organization Applicant

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     Street：工业园区仁爱路199号苏州大学医学部药理学系

     City：苏州市

     State：江苏省

     Country：中国

     PostalCode：215123

     PhoneNumber：0512-65880406

     FaxNumber：

     EmailAddress：

<110>OrganizationName：苏州大学

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<120>Title：检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及其PCR扩增方法

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CCAGTGACTA CTTTGATTCG                                                    20

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TGGCCTTTCA CATGGATGTG AA                                    22

<212>Type：DNA

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     SequenceName：现有技术反向引物

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<210>SEQ ID No.3

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     SequenceName：本专利申请的正向引物

     SequenceDescription：

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     SequenceName：本专利申请的反向引物

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