一种用冻干法制备注射用还原型谷胱甘肽时的预冻方法

摘要

本发明公开了一种用冻干法制备注射用还原型谷胱甘肽时的预冻方法，其包含下列步骤：(1)将还原型谷胱甘肽溶液按最终产品的规格定量分装于各管制瓶中，在1.5～2小时内降至－40℃以下，并保温1小时，得到还原型谷胱甘肽溶液冻结体；(2)将步骤(1)所得的还原型谷胱甘肽溶液冻结体在2小时内升温至－17℃，并保温1小时；(3)将步骤(2)所得的还原型谷胱甘肽溶液冻结体在1～1.5小时内降温至－40℃以下，并保温1小时，即可。采用本发明的预冻方法所得物质进行升华干燥后得到的产品的外观为白色疏松块状物，表面无外观缺陷；本发明的预冻方法制得的产品在生产过程中也极少出现喷瓶现象，最终的产品质量符合国家标准。

说明书

技术领域

本发明具体地涉及一种用冻干法制备注射用还原型谷胱甘肽时的预冻方法。

背景技术

还原型谷胱甘肽(GSH)广泛分布于哺乳动物、植物及微生物细胞内，是生化系统重要的抗氧化成分，在维持细胞生物功能中起重要作用。常用于化疗患者、放射治疗患者、各种低氧血症、肝脏疾病及其它化学物质毒性引起的肝脏损害等。

还原型谷胱甘肽在水中不稳定且对热敏感，故一般采用冻干法制成粉针剂应用于临床。

冻干法制备粉针剂的过程一般分为二个阶段：首先，将需要冻干的产品分装在合适的容器内，放入与冻干箱尺寸相适应的金属盘上，然后将产品放入冻干箱内冷却到-40℃左右，此谓预冻。预冻过程主要目的有二个，一是将产品冻结，其次是让溶液在冻结过程中形成晶体骨架，保证在升华阶段溶剂能顺畅地从冻结体中升华释出，获得干燥产品。预冻结束，进入第二阶段即升华干燥阶段，操作步骤为先抽空，待真空度达到一定数值后，对箱内产品进行加热升华，数小时后，即可结束操作，获得相关冻干产品。

现有技术制备冻干粉针剂有二种方法，一种是先将原料药冻干后进行粉碎，再按规格进行无菌分装。此法冻干操控比较容易，冻干成本较低，但该法制备的产品在粉碎过程中易吸潮、氧化分解且有被微生物污染的风险，装量亦不易控制，产品质量不易保证。另一种方法是定量灌装法，即将产品先配成溶液，定量灌装于管制瓶后直接进行冻干，免去了后续的粉碎和分装，可以较好地解决第一种方法生产时具有的质量风险，提高了用药安全。

然而，采用现有的第二种方法生产注射用还原型谷胱甘肽这个产品时效果不好，业界普遍感到操控非常困难，产品外观不佳，质量不稳定，工业化生产中废品率很高。究其原因主要是因为还原型谷胱甘肽原料取自生物发酵后所获得的产品，水溶液黏度很大，一般的预冻方式或预冻程序控制不好，还原型谷胱甘肽在冻结过程中就不能形成晶体，组成并保持完整稳定的骨架结构，在后续升华干燥过程中，冻结体体态会坍塌和萎缩，表面亦会融化形成玻璃体，水分不易从中顺畅升华，产品因此会呈网状或泡状，无法形成美观的块状物，影响产品外观和质量。因此，有的生产者不得不采用第一种方法，即先将产品干燥后再粉碎分装来制备还原型谷胱甘肽冻干粉针。重庆药友制药有限责任公司即是如此(发明专利申请号200610054295.6)。

显然，在预冻阶段获得完整和稳定的晶体骨架结构，是采用第二种方法即定量灌装法生产外形美观、质量稳定的还原型谷胱甘肽冻干粉针的关键和基础。

为解决上述问题，现有技术一般采用在还原型谷胱甘肽溶液中添加晶体骨架支撑剂，如甘露醇、葡萄糖、山梨醇、右旋糖酐等的方法来促成和保持晶体的形成并保证晶体骨架结构的稳定。山东绿叶制药有限公司即采用了这一方法(发明专利申请号200510123876.6)。

需要指出的是，中国药典2005年版二部附录I制剂通则规定：配制注射剂时，可根据药物的性质加入适宜的附加剂，所用附加剂应不影响药物疗效，避免对检验产生干扰，使用浓度不得引起毒性或过度的刺激。也就是说，若在还原型谷胱甘肽冻干粉针剂生产中，添加诸如甘露醇等辅料作为晶体骨架支撑剂，需符合相关规定，进行相应的生化试验、稳定性试验等并报国家有关部门批准后方可进行，因此，实际应用并不容易，而且，更严重的问题是存在因添加辅料而带来的产品质量风险。

上海复旦复华药业有限公司在不添加晶体骨架支撑剂情况下，用定量灌装法在预冻阶段采用回温方式，使还原型谷胱甘肽自身在其溶液冻结过程中形成晶体并组成和保持稳定的晶体骨架结构，为后续升华干燥打好基础，从而获得了外观及内在质量都符合国家标准的产品(发明专利申请号200610023149.7)。其公开的预冻操作工艺为：a.将装有药液的瓶子摆入冷冻干燥机内；b.以每小时25～35℃的速率将冷冻干燥机搁板温度降至-38～-42℃；c.当制品温度降至-32～-37℃，保温0.5～1小时；d.将搁板温度回升，使制品温度升至-15～-20℃，保温1～2小时，然后执行升华操作。

本发明人在生产中发现，上述预冻工艺存在以下不足：1、步骤b.和c.中，因为存在搁板温度和制品温度二个控制点，实际生产中操控比较困难；2、检验发现预冻阶段制品温度高于-40℃时，还原型谷胱甘肽氧化变性成氧化型谷胱甘肽(业内通常称为有关物质)的速率较高，即产品易于氧化分解，造成有关物质指标不好；3、回温阶段(步骤d.)，公开技术是回温到-15～-20℃，结果发现晶体骨架尚不完美和稳定，影响后续升华干燥。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：1、克服现有的还原型谷胱甘肽冻干粉针剂制备过程中，需要先将原料冻干后进行粉碎，再按规格进行无菌分装，造成产品外观不好、质量不稳定、废品率高的缺陷；2、克服现有技术中，制备还原型谷胱甘肽冻干粉针剂需要添加辅料作为晶体骨架支撑剂所带来的质量风险的缺陷；3、克服现有技术中，制备还原型谷胱甘肽冻干粉针剂预冻阶段需控制搁板和制品二个温度，造成操控困难的缺陷，发现了还原型谷胱甘肽晶体形成并组成骨架结构的关键控制参数，以及控制还原型谷胱甘肽预冻阶段氧化变性形成的氧化型谷胱甘肽，即有关物质升高的关键因素，从而提供了一种用冻干法制备注射用还原型谷胱甘肽时的预冻方法，使操控指标明晰、易控；提高了产品质量，保证用药安全。采用本发明的预冻方法所得物质进行升华干燥后得到的产品的外观为白色疏松块状物，表面无坍塌、萎缩或玻璃体结晶，柱体无裂纹或泡状等外观缺陷；本发明的预冻方法制得的产品在生产过程中也极少出现喷瓶现象，最终制得的产品质量符合国家标准。

发明人经过大量的实验研究以及各种对比试验得以证实，可以采用定量灌装法制备注射用还原型谷胱甘肽，克服了现有技术(发明专利申请号200610054295.6)需将原料冻干后粉碎再进行分装造成产品外观、质量、成品率不佳的缺陷；并且可以不添加晶体骨架支撑剂，通过特定的回温预冻方法，使还原型谷胱甘肽自身形成晶体并组成和保持稳定的晶体骨架结构，获得外观及内在质量都符合国家标准的产品，克服了现有技术(发明专利申请号200510123876.6)，因添加辅料所带来的质量风险。

本发明的方法针对公开技术(专利申请号200610023149.7)中存在的各方面不足，优化了各工艺条件：1、在整个预冻阶段即公开技术步骤b.～d.中，可以将制品温度作为温度控制的惟一参数，不必同时参照和控制搁板温度，由制品温度和相关时间组成的预冻控制方案，能更有效和完满地操控整个预冻过程，克服了公开技术中需同时控制搁板和制品二个温度而造成操控困难的不足；2、发明人经过检验发现，公开技术步骤b.～c.中，制品温度在-32～-37℃时，冻结体中还原型谷胱甘肽氧化变性成氧化型谷胱甘肽的速率较大，平均含量超过2％；若将制品温度控制在-40℃以下，则氧化变性速率明显下降，氧化型谷胱甘肽含量可控制在2％以下，提高了产品质量，进一步保证用药安全。此温度控制点的发现，找到了控制还原型谷胱甘肽预冻阶段氧化变性的关键；3、发明人研究发现，公开技术步骤d.中，制品温度在-15℃～-16℃时，冻结体融解过快，还原型谷胱甘肽在冻结体中析出晶体的同时又会融解，不能形成完满的晶体骨架结构，已经形成的晶体骨架也会萎缩和坍塌；制品温度为-18℃～-20℃时，因冻结体温度较低，冻结体中细小晶粒转化为较大晶体形成晶体骨架的速率较慢，不易形成完美和稳定的晶体骨架；若将制品温度控制在-17℃，则既不至于让冻结体融解过快又可让还原型谷胱甘肽保持一定的速率完成晶体转化，形成更为满意的晶体骨架，为后续升华干燥提供良好基础，此温度点的发现，找到了还原型谷胱甘肽晶体形成并组成骨架结构的关键控制参数，克服了公开技术中，晶体转化不充分、晶体骨架结构不完满的不足。

发明人将上述发现优化后得到的预冻方法替代上海复旦复华药业有限公司已公开技术(申请号200610023149.7)中的预冻工艺，再经相同的后续升华干燥，得到的最终产品的外观、水分、有关物质及含量等指标均明显提高。

因此本发明涉及一种用冻干法制备注射用还原型谷胱甘肽时的预冻方法，其包含下列步骤：

(1)将还原型谷胱甘肽溶液按最终产品的规格定量分装于各管制瓶中，将还原型谷胱甘肽溶液降温，降温过程为：在1.5～2小时内降至-40℃以下，并保温1小时，得到还原型谷胱甘肽溶液冻结体；

(2)将步骤(1)所得的还原型谷胱甘肽溶液冻结体升温，升温过程为：在2小时内升温至-17℃，并保温1小时；

(3)将步骤(2)所得的还原型谷胱甘肽溶液冻结体降温，降温过程为：在1～1.5小时内降温至-40℃以下，并保温1小时，即可。

步骤(1)之前，所述的预冻方法较佳的还包含下列步骤：先将处方量的药用级还原型谷胱甘肽溶解或悬浮于40℃以下注射用水中，然后加入药用级无机碱，使药物溶解至溶液澄清，并调节pH值为4.8～5.8，然后定量分装于各管制瓶中；其中，所述的药用级无机碱优选质量分数为10％的氢氧化钠水溶液，所述的pH值优选5.1～5.2。此步骤的目的是为了得到装量较为精准的还原型谷胱甘肽水溶液，为获得装量精准的注射用还原型谷胱甘肽打好基础。

步骤(1)中，所述的降温过程较佳的为在1.5小时内降至-40℃以下。

步骤(3)中，所述的降温过程较佳的为在1小时内降温至-40℃以下。

步骤(1)～步骤(3)较佳的均在冷冻干燥机中进行。

步骤(1)～步骤(3)中，控温的过程一般是通过冷冻干燥机的搁板对管制瓶中的还原型谷胱甘肽进行热量传递，通过安置在管制瓶溶液中的温度测量元件对管制瓶中的还原型谷胱甘肽的温度进行测量，从而对其降温或升温。所述的温度测量元件较佳的为热电阻测温元件。

上述各优选条件可任意组合，即制得本发明的各较佳实例。

本发明中，步骤(1)的目的首先是为了保证管制瓶中的还原型谷胱甘肽与水形成融合、均质的溶液冻结体，不出现分层、溶质和溶剂分别析出等现象，确保溶液冻结完全；其次是为了保证管制瓶中的还原型谷胱甘肽氧化变性的速率保持在较低的水平。步骤(2)的目的是使还原型谷胱甘肽在溶液冻结体中析出晶体并逐渐成长、有序转换并最终形成支撑骨架；保持温度1小时的目的是使其转换充分。此步骤中的升温速度、控温点及保持时间皆为关键控制点。因为发明人发现冻结体在常压和较高温度下，时间稍长晶体会融化，形成的晶体骨架会坍塌；温度太低或保温时间太短，冻结体中细小晶粒尚不能充分转化为较大晶体并形成晶体骨架。步骤(3)的目的是为了保证已形成的晶体骨架能完整保存下来并得以固化，还原型谷胱甘肽氧化变性的速率也能保持在较低的水平。倘若降温不及时，晶体骨架会因融化而坍塌；若温度降低不够、保温时间不足，则晶体骨架冻结不牢，在预冻之后的抽真空过程中晶体骨架也会坍塌，同时也会因还原型谷胱甘肽氧化变性的速率加快而影响产品质量。

在经过上述预冻过程后，将步骤(3)所得的还原型谷胱甘肽溶液冻结体升华干燥即可得最终的注射用还原型谷胱甘肽，其中，所述的升华干燥方法和步骤均可为本领域冷冻干燥的常规方法和步骤，较佳的操作方案为：先抽真空，再启动升温，直至产品干燥。

本发明的还原型谷胱甘肽原料均可通过市售得到，较佳的购自日本Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd，并符合进口药品注册标准JX20030297要求。

除特殊说明外，本发明涉及的原料和试剂均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明的预冻方法制得的产品经过升华干燥后，制得的最终产品为按产品的规格定量冻干于管制瓶中的产品，其外观为白色疏松柱体块状物，表面无坍塌、萎缩或玻璃体结晶，柱体无裂纹、网状或泡状等外观缺陷；并且本发明的预冻方法制得的产品在后续的抽真空过程中也极少出现喷瓶现象，产品质量符合国家标准。

(2)本发明的预冻方法不必添加晶体骨架支撑剂等辅料，预冻后的产品经升华干燥即能得到装量和外观均符合规定的最终产品，排除了因添加辅料而带来的产品质量风险，提高了用药安全。

(3)本发明的预冻方法免去了在升华干燥后的粉碎和分装操作，较好地解决了产品在粉碎和分装过程中易吸潮、氧化分解和被微生物污染的问题。

(4)本发明的预冻方法工艺参数简单、易控，产品质量稳定，适宜标准化工业生产，经过后续的升华干燥后制得的最终产品的水分(干燥失重)、有关物质(氧化型谷胱甘肽)等指标均比现有技术所得产品下降，含量指标有所提高。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

以下各实施例、对比实施例中的还原型谷胱甘肽原料均购自日本KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd，产品批号为：089244，经检验符合进口药品注册标准JX20030297要求。

实施例1

灭菌配液锅中先加注射用水约25L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽4.1Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约5.4L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量82L，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶0.1g/2ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。在1.5～2小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；在2小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽0.1g。

实施例2

灭菌配液锅中先加注射用水约30L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽12.3Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约16.2L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量82L，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶0.3g/2ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。在1.5～2小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；在2小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽0.3g。

实施例3

灭菌配液锅中先加注射用水约30L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽24.6Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约32.4L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量82L，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶0.6g/2ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。在1.5～2小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；在2小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽0.6g。

实施例4

灭菌配液锅中先加注射用水约40L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽36.9Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约48.6L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量123L，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶0.9g/3ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。在1.5～2小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；在2小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽0.9g。

实施例5

灭菌配液锅中先加注射用水约55L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽49.2Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约64.8L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量164L，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶1.2g/4ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。在1.5～2小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；在2小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽1.2g。

实施例6

灭菌配液锅中先加注射用水约55L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽49.2Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约64.8L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量164L，调节pH值至5.1～5.2，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶1.2g/4ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。1.5小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；1小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽1.2g。

实施例7

灭菌配液锅中先加注射用水约55L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽49.2Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约64.8L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量164L，调节pH值至5.1～5.2，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶1.2g/4ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。2小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；1.5小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽1.2g。

实施例8

灭菌配液锅中先加注射用水约55L，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽49.2Kg，搅拌均匀，加质量分数10％氢氧化钠约64.8L，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量164L，调节pH值至5.1～5.2，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶1.2g/4ml，每半小时抽查装量的准确度。灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门。1.7小时内将制品温度从室温降至-40℃，保温1小时；2小时内将制品温度从-40℃升至-17℃，保温1小时；1.2小时内将制品温度再降至-40℃，保温1小时后开始抽真空并升温至45～50℃，保温10小时左右出箱、轧盖、灯检、包装。每瓶：含还原型谷胱甘肽1.2g。

效果实施例本发明的预冻方法制得的产品经升华干燥后得到的注射用还原型谷胱甘肽的质量检验

检验依据国家食品药品监督管理局《注射用还原型谷胱甘肽》标准(试行)进行(YBH08792003)，具体标准如下：

1.性状：本品为白色冻干块状物或粉末。

2.鉴别：

(1)取本品约2mg，加水2ml使溶解，加茚三酮约2mg，加热，溶液显蓝紫色。

(2)取本品约0.1g，加10％氢氧化钠溶液2ml溶解后，加醋酸铅试液1ml，置水浴中加热1～2分钟，渐产生黑色沉淀。

(3)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致，RSD不超过3％。

3.检查：

溶液的澄清度与颜色：取本品5支，分别加水60ml溶解，溶液应澄清无色。

酸度：取本品1支，加水60ml溶解，依法测定(中国药典2005年版二部附录VI H)，pH值应为4.8～5.8。

干燥失重：取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％。(中国药典2005年版二部附录VIII L)。

氧化型谷胱甘肽：精密称取本品约25mg，置50ml的容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；另精密称取氧化型谷胱甘肽对照品约25mg，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得贮备液(0.25mg/ml)。再精密吸取贮备液2ml，置25ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得(20μg/ml)，作为对照品溶液，照含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl分别注入液相色谱仪，并记录色谱图。供试品溶液如显示与氧化型谷胱甘肽对照品溶液相应的色谱峰，其含量不得过4.0％。

细菌内毒素：取本品，照细菌内毒素检查法检查(中国药典2005年版二部附录XI E)，每1mg还原型谷胱甘肽中含内毒素量应小于0.03EU。

无菌：取本品，加入稀释液使溶解，用薄膜过滤法处理后，依法检查(中国药典2005年版二部附录XI H)，应符合规定。

装量差异：取供试品5瓶(支)，除去标签，铝盖，容器外壁用乙醇洗净，干燥，开启时注意避免玻璃屑等异物落入容器中，分别迅速精密称定，倾出内容物，容器可用水、乙醇洗净，在适宜条件下干燥后(70℃，1小时)，再分别精密称定每一容器的重量，求出每1瓶(支)的装量与平均装量。每1瓶(支)中的装量与平均装量相比较，装量差异限度应为±5％，如有1瓶(支)不合格，应另取10瓶(支)复试，均应符合规定。

可见异物：照可见异物检查法(中国药典2005版二部附录IX H)检查，应符合规定。

不溶性微粒：照不溶性微粒检查法(中国药典2005版二部附录IX C)检查，应符合规定。

5.含量限度：

本品为还原型谷胱甘肽的无菌冻干品。含还原型谷胱甘肽(C₁₀H₁₇N₃O₆S)应为标示量的90.0～110.0％。

6.含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VD)测定。

色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液(取庚烷磺酸钠2.2g和磷酸二氢钾6.8g，加水1000ml溶解后，加磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(97∶3)为流动相，检测波长为210nm，理论塔板数按还原型谷胱甘肽峰计算不低于1000。

测定法：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取25mg，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取经105℃干燥1小时的还原型谷胱甘肽对照品约25mg，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

计算公式如下：

其中，As为供试品溶液的峰面积，Ar为对照品溶液的峰面积，Ws为供试品的称量(g)，Wr为对照品的称量(g)。

检验结果如表1所示：

表1

经检验，上述各实施例所得样品各项检验指标均符合国家标准。

对比实施例1

发明人用上述实施例1～5的溶液配制方法，配制了5种浓度规格的还原型谷胱甘肽溶液，具体配制过程如下：

5种浓度规格的还原型谷胱甘肽溶液的配制：

规格1. 0.1g还原型谷胱甘肽/瓶

烧杯中先加注射用水约25ml，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽4.1g，搅拌均匀，加10％氢氧化钠约5.4ml，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量82ml，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶2ml。

规格2. 0.3g还原型谷胱甘肽/瓶

烧杯中先加注射用水约30ml，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽12.3g，搅拌均匀，加10％氢氧化钠约16.2ml，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量82ml，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶2ml。

规格3. 0.6g还原型谷胱甘肽/瓶

烧杯中先加注射用水约30ml，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽24.6g，搅拌均匀，加10％氢氧化钠约32.4ml，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量82ml，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶2ml。

规格4. 0.9g还原型谷胱甘肽/瓶

烧杯中先加注射用水约40ml，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽36.9g，搅拌均匀，加10％氢氧化钠约48.6ml，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量123ml，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶3ml。

规格5. 1.2g还原型谷胱甘肽/瓶

烧杯中先加注射用水约55ml，控制水温在40℃以下，加还原型谷胱甘肽49.2g，搅拌均匀，加10％氢氧化钠约64.8ml，同时搅拌使溶解澄清，加注射用水至总量164ml，调节pH值至4.8～5.8，分析合格后，药液先用0.45μm滤器过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液检查可见异物合格后，分装于10ml管制瓶内，每瓶4ml。

将上述规格的样品分别采用重庆药友制药有限责任公司公开的预冻技术(专利申请号200610054295.6)(工艺I)、上海复旦复华药业有限公司公开的预冻技术(专利申请号200610023149.7)(工艺II)及本发明工艺的预冻技术(工艺III)进行预冻，预冻结束后，采用上海复旦复华药业有限公司公开的升华干燥技术(专利申请号200610023149.7)制得最终的注射用还原型谷胱甘肽，产品按国家食品药品监督管理局《注射用还原型谷胱甘肽》标准(试行)进行(YBH08792003)检验，结果如表2所示。

工艺I～工艺III的具体方法如下，其中各工艺进行对比实施的样品均为规格为规格1.～规格5.的五种样品，每种规格的样品为1000瓶。

(工艺I)

预冻工艺：a.将装有药液的瓶子摆入冷冻干燥机内；b.先在-20℃保持3小时，再在2小时内升温到-5℃，-5℃保持1小时；c.在1.5小时内降到-42℃，保持2小时。(此步骤完全参照重庆药友的专利申请200610054295.6中的实施例1的具体条件)

升华干燥工艺：a.开始抽真空，当真空达到6Pa后，启动升温；b.将搁板温度一步升至-10℃，直至制品温度-8℃后，保温2小时；c.再将搁板温度一步升至0℃，直至制品温度0℃后，保持2小时；d.将搁板温度一步升至50℃，直至制品温度45℃后，保持2小时；e.压塞，出箱。(升华干燥工艺完全参照上海复旦复华药业有限公司的专利申请200610023149.7中实施例1的具体条件)

(工艺II)

预冻工艺：a.将装有药液的瓶子摆入冷冻干燥机内；b.以每小时30℃的速率将冷冻干燥机搁板温度降至-40℃；c.当制品温度降至-35℃，保温1小时；d.将搁板温度回升到-20℃，保温1小时；e.再将搁板温度降至-40℃，使制品温度降至-35℃，保持2小时。(预冻工艺完全参照上海复旦复华药业有限公司的专利申请200610023149.7中实施例1的具体条件)

升华干燥工艺：a.开始抽真空，当真空达到6Pa后，启动升温；b.将搁板温度一步升至-10℃后，直至制品温度-8℃后，保温2小时；c.再将搁板温度一步升至0℃，直至制品温度0℃后，保持2小时；d.将搁板温度一步升至50℃，直至制品温度45℃后，保持2小时；e.压塞，出箱。(升华干燥工艺完全参照上海复旦复华药业有限公司的专利申请200610023149.7中实施例1的具体条件)

(工艺III)

预冻工艺：a.将装有药液的瓶子摆入冷冻干燥机内；b.在1.5～2小时内降至-40℃以下，保温1小时；c.在2小时内升温至-17℃，保温1小时；d.在1～1.5小时内降温至-40℃以下，保温1小时。

升华干燥工艺：a.开始抽真空，当真空达到6Pa后，启动升温；b.将搁板温度一步升至-10℃后，直至制品温度-8℃后，保温2小时；c.再将搁板温度一步升至0℃，直至制品温度0℃后，保持2小时；d.将搁板温度一步升至50℃，直至制品温度45℃后，保持2小时；e.压塞，出箱。(升华干燥工艺完全参照上海复旦复华药业有限公司的专利申请200610023149.7中实施例1的具体条件)

表2

由表2可知，采用本发明工艺所得产品的各项指标明显好于对比工艺。

对比实施例2

采用重庆药友制药有限责任公司公开的专利申请的方法(专利申请号200610054295.6)配制药液后，定量灌装在各管制瓶中，然后采用专利申请200610054295.6中的预冻方法预冻后，再按照专利申请200610054295.6的方法进行后续操作制备产品，此过程即为以下的工艺(A)。最后产品按国家食品药品监督管理局《注射用还原型谷胱甘肽》标准(试行)进行(YBH08792003)检验。

各步骤的方法同上所述，仅在预冻步骤采用本发明的预冻方法，此过程即为工艺(B)，最后产品按国家食品药品监督管理局《注射用还原型谷胱甘肽》标准(试行)进行(YBH08792003)检验。

工艺(A)：

取0.36kg氢氧化钠，加入适量冷却注射用水配制成氢氧化钠溶液。取适量注射用水，冷却，通入无菌氮气15～20分钟后加入2.7kg还原型谷胱甘肽成悬浮液。在氢氧化钠溶液及悬浮液均通入无菌氮气且密闭的条件下，将氢氧化钠溶液缓缓加入谷胱甘肽悬浮液中，调节溶液pH值至5.2～5.4。加注射用水至全量，继续通入无菌氮气，搅拌均匀，无菌过滤。灌装于10ml管制瓶内，分别灌装2ml(0.6g还原型谷胱甘肽/瓶)、3ml(0.9g还原型谷胱甘肽/瓶)、4ml(1.2g还原型谷胱甘肽/瓶)三种规格，每种规格灌装1000瓶。先在-30℃保持3小时，再在2小时内升到-5℃，-5℃保持1小时，然后在1.5小时内再降到-42℃，保持2小时，抽真空，升温50～53℃后，保持13～14小时，冻干结束，通入干燥的无菌氮气复压出箱。

工艺(B)：

取0.36kg氢氧化钠，加入适量冷却注射用水配制成氢氧化钠溶液。取适量注射用水，冷却，通入无菌氮气15～20分钟后加入2.7kg还原型谷胱甘肽成悬浮液。在氢氧化钠溶液及悬浮液均通入无菌氮气且密闭的条件下，将氢氧化钠溶液缓缓加入谷胱甘肽悬浮液中，调节溶液pH值至5.2～5.4。加注射用水至全量，继续通入无菌氮气，搅拌均匀，无菌过滤。灌装于10ml管制瓶内，分别灌装2ml(0.6g还原型谷胱甘肽/瓶)、3ml(0.9g还原型谷胱甘肽/瓶)、4ml(1.2g还原型谷胱甘肽/瓶)三种规格，每种规格灌装1000瓶。在1.5～2小时内降至-40℃以下，保温1小时；在2小时内升温至-17℃，保温1小时；在1～1.5小时内降温至-40℃以下，保温1小时。抽真空，升温50～53℃后，保持13～14小时，冻干结束，通入干燥的无菌氮气复压出箱。

表3(每种规格1000瓶)

由表3可知，采用本发明工艺所得产品的各项指标明显好于对比工艺制得的产品。