限制性核酸内切酶增强的多态序列检测

摘要

本发明提供一种检测混合DNA群体中的特异性多态等位基因的改良方法。所述方法包含使通过PCR呈指数扩增的指定多态等位基因的相对百分比富集化。本发明还提供选择性地富集目标核酸(例如，母体样品中的胎儿核酸)的方法。在检测母体样品中的胎儿核酸的情形中，引入可辨别多态位点的等位基因的限制性内切酶。优选地，母源等位基因被消化且包含父源等位基因的核酸被相对地富集。

说明书

技术领域

本文提供用于检测混合核酸样品中的特异性等位基因的方法。所述方法可用于检测母体样品中是否存在胎儿核酸。

背景技术

人们已经揭露了循环核酸分析在许多临床状况的非侵入性诊断、监测和预测中的应用。举例来说，就产前应用来说，已经检测到循环胎儿特异性序列且其构成母体血浆中的全部DNA的一部分。循环DNA分析的诊断可靠性取决于目标序列的浓度分数、分析灵敏度和特异性。循环DNA物种之间的序列差异(例如，单核苷酸多态性或SNP)的稳定可靠辨别在技术上具有挑战性且要求采用具有高灵敏度及特异性的分析方法。

用以检测DNA样品中的序列差异的当前技术包括等位基因特异性PCR、限制性内切酶切消化及南方印迹杂交(Southern blot hybridization)、限制性核酸内切酶介导的选择性PCR(REMS-PCR)及涉及荧光检测探针使用的竞争性PCR方法。当前可利用的技术存在若干缺点。就等位基因特异性PCR来说，经常难以设计具有高度等位基因特异性的检验(内斯(Nasis)等人，临床化学(Clin Chem.)2004年4月；50(4)：694-701)。限制性内切酶切消化/南方印迹方法与本文所提供方法相比需要更大量的DNA模板且对于检测包含低相对比例的总DNA的多态序列缺乏灵敏性。限制性核酸内切酶介导的选择性PCR(REMS-PCR)具有需要可切断野生型等位基因的热稳定性限制性内切酶的缺陷。REMS-PCR阐述于美国专利第6,261,768号中，所述案件以引用方式并入本文中。所述技术的使用并非总是可行的且此需求限制了REMS-PCR方法的通用性。竞争性PCR对于检测包含低相对比例(＜5％)的总DNA的多态序列缺乏灵敏性。用等位基因特异性荧光探针的竞争性PCR缺乏以单管格式实施多于2-3次检验的多重检验的能力。

另外，利用DNA物种之间的甲基化差异的类似方法(举例来说，标题为“用于产前染色体异常诊断的方法(Methods for prenatal diagnosis of chromosomalabnormalities)”的美国专利公开申请案第20070059707号，所述案件以引用方式并入本文中)在低拷贝数基因组DNA下无效。

发明内容

本发明部分提供用以选择性地富集特定目标核酸的核酸序列特异性切断。多态基因座应经选择以使得在所述多态基因座处只有一种等位基因被指定切断试剂(例如，限制性核酸内切酶)切断。经设计以在多态性两侧的寡核苷酸引物对允许通过扩增(例如，PCR)来扩增所述多态区域或扩增子。在扩增之前或期间，将核酸样品与指定限制性核酸内切酶一起培育。在优选实施例中，在扩增之前引入所述切断试剂。如果此等位基因存在，那么此实施例会切断可被所述限制性核酸内切酶识别的多态等位基因或包含所述多态等位基因的序列。在扩增子序列内(即，在引物对之间)的任何模板核酸切断均可阻止此模板的PCR扩增。因此，如果仅多态性的一种等位基因被所述切断试剂识别且对应核酸序列被所述限制性核酸内切酶切断，那么可扩增的交替多态等位基因的相对百分比会以取决于限制性核酸内切酶活性的效率和特异性的方式增加。在扩增后，经扩增多态等位基因可经基因定型或者可通过所属领域已知的任何方法(例如，使用西克诺(Sequenom)的技术或通过RT-PCR)来检测或辨别。

在一个实施例中，本发明部分提供一种用于检测在样品中在多态基因座处是否存在目标等位基因的方法，其中所述样品含有核酸，所述方法包含：用可识别并切断非目标等位基因的切断试剂切断包含位于所述多态基因座处或其附近的非目标等位基因的核酸而不是切断目标等位基因；扩增未切断核酸而不是切断核酸；及分析来自先前步骤的扩增产物以确定是否存在所述目标等位基因。在相关实施例中，所述方法还包含首先获得疑为包含具有目标等位基因和非目标等位基因的核酸的样品。在优选实施例中，所述方法用于区别两个个体，举例来说，母亲与胎儿，其中所述样品包含母体核酸和胎儿核酸。任选地，所述方法可用于相对于所述非目标核酸定量所述目标核酸。

本发明部分提供用于富集目标核酸的方法，所述方法包含用可识别包含非目标等位基因而不是目标等位基因的核酸的限制性核酸内切酶切断包含所述非目标等位基因的核酸；及扩增未切断核酸而不是切断核酸，其中所述未切断经扩增核酸代表相对于非目标核酸富集的目标核酸。在一个实施例中，所述方法可用于测定在非目标核酸背景中是否存在目标核酸。在相关实施例中，可分析所述扩增产物以诊断、监测或预测临床状况。同样，可分析所述扩增产物以助于诊断、预测或监测临床状况或染色体异常。可选择核酸以使其包含易被(例如)切断试剂选择性地消化且具有多态位点的等位基因。

所述方法可用于分析核酸，包括但不限于DNA、RNA、mRNA、寡聚核小体、线粒体、经后生修饰的单链、双链、环形质粒、粘粒、酵母人工染色体、人工或人造DNA(包括独特DNA序列)、和自RNA样品逆转录的DNA(例如，cDNA)、和其组合。在一个实施例中，所述方法用于检测或选择性地富集RNA。

所述核酸还可表征为目标核酸或非目标核酸，其中目标核酸包含所述目标等位基因且非目标核酸包含所述非目标等位基因。在一个实施例中，所述目标核酸包含父源等位基因且所述非目标核酸包含母源等位基因。在一些实施例中，所述核酸是无细胞核酸或部分无细胞核酸。在某些实施例中，所述目标核酸是凋亡细胞核酸或部分凋亡细胞核酸。在某些实施例中，所述目标核酸的长度为小于2000个、1200个、1100个、1000个、900个、800个、700个、600个、500个、400个、300个、200个、100个、80个、70个、60个、50个、40个或更少的碱基对。

所述方法可用于检测存于生物样品中的目标核酸。优选地，所述生物样品来自动物，优选地，来自人类。在相关实施例中，所述生物样品选自由下述组成的群组：全血、血清、血浆、脐带血、绒膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、洗出液、活组织检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、母乳(breast milk)、乳汁(breast fluid)、胚胎细胞和胎儿细胞、及其混合物。在一个实施例中，所述样品是来自犯罪现场(例如，用于法医分析)。在某些实施例中，所述生物样品是经由非侵入性方式获得，举例来说，自怀孕女性抽取的血液。在另一优选实施例中，所述生物样品是无细胞样品。在某些实施例中，所述样品是预先分离的核酸样品。

在一个实施例中，本发明部分提供一种用于检测母体样品中是否存在胎儿核酸的方法，其中所述样品含有核酸，所述方法包含：用可识别并切断包含母源等位基因而不识别并切断父源等位基因的核酸的限制性核酸内切酶切断包含母源等位基因的核酸；扩增未切断核酸而不是切断核酸；及分析来自先前步骤的扩增产物以测定是否存在胎儿核酸。在某些实施例中，所述样品包含若干核酸的混合物。举例来说，所述混合物可包含来自不同物种或来自不同个体的核酸。在一个实施例中，所述样品来自怀孕女性。样品可自孕育胎儿1-4周、4-8周、8-12周、12-16周、16-20周、20-24周、24-28周、28-32周、32-36周、36-40周、或40-44周(且优选地，孕育胎儿5-28周)的人类女性收集得。在某些实施例中，所述方法可用于检测是否存在胎儿Y-染色体核酸，借此确定胎儿的性别。

在某些实施例中，所述目标核酸包含父源等位基因。在某些实施例中，母亲在所述多态位点处为纯合型且胎儿在所述多态位点处为杂合型。在母亲于所述多态位点处为纯合型且胎儿于所述多态位点处为杂合型的情形中，所述多态位点被视为可提供信息(关于可提供信息和不可提供信息的情形的实例，参见图5A)。在相关实施例中，结合本文所提供方法测定母体基因型。在相关实施例中，首先对母亲实施基因定型(举例来说，使用来自母体全血液样品的外周血单核细胞(PBMC))以确定可被所述切断试剂识别及切断的非目标等位基因。当所述方法用于法医目的时，可首先对罪犯实施基因定型以确定可被所述切断试剂识别及切断的非目标等位基因。同样，当用于器官移植相关应用时，可首先对移植接受者实施基因定型以确定可被所述切断试剂识别及切断的非目标等位基因。

在一些实施例中，所述样品含有来自两个不同个体的核酸。这些情况包括但不限于器官移植接受者、输血接受者和法医应用。

在某些实施例中，所述样品是来自疑为患有疾病的个体且所述非目标等位基因是可经选择性地切断以便富集与疾病相关的点突变的野生型等位基因。在相关实施例中，所述疾病为癌症。ras原致癌基因，K-ras、N-ras和H-ras及p53肿瘤抑制基因是在人类癌症中经常发生突变的基因的实例。在这些基因中的特异性突变会激活或增加转化潜能。

本发明部分提供用于检测罕见的等位基因或低拷贝数的等位基因的方法。在一个实施例中，如果所述非目标等位基因没有经选择性地切断，那么通过常规或未经修饰基因定型方法不能检测到所述目标等位基因。在相关实施例中，所述目标等位基因除非经选择性地富集，否则通过(例如)本文所提供方法不能检测到。在某些实施例中，相对于非目标等位基因的浓度来说，目标等位基因的浓度(例如，在样品中的等位基因浓度)为小于0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％20％、25％、30％。在某些实施例中，所述目标核酸的数目是小于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000。在某些实施例中，所述目标等位基因是突变体且所述非目标等位基因是野生型等位基因。在相关实施例中，所述目标等位基因可为体细胞突变体或种细胞突变体。在某些实施例中，在与所述多态基因座相同的扩增子中可检测到另一等位基因或序列标识符。举例来说，可使用本文所提供方法来选择性地富集包含目标等位基因的序列且可通过所属领域已知的任何方法来检测另一序列标识符。

在一些实施例中，在所述扩增子内没有可被所述切断试剂识别的其它多态基因座。

在某些实施例中，所述方法任选地包含首先从所述样品分离核酸。可使用所属领域的技术人员已知的任何方法自怀孕母亲的血液、血浆或血清分离DNA。任何标准DNA分离技术可用于分离胎儿DNA与母体DNA，包括但不限于由QIAGEN提供的QIAamp DNA Blood Midi试剂盒。其它标准DNA分离方法阐述于(例如)(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子生物学(Molecular Biology)：实验室方法(A laboratoryApproach)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，N.Y.1989；奥苏贝尔(Ausubel)等人，最新分子生物学实验方法汇编(Current protocols in Molecular Biology)，格林出版社出版(Greene Publishing)，Y，1995)中。一种用于分离血浆DNA的优选方法阐述于邱(Chiu)等人，2001，临床化学(Clin.Chem.)47：1607-1613中，所述文献的全文以引用方式并入本文中。其它适宜方法提供于在2006年9月1日提出申请的PCT国际公开申请案第2007/028155号的实例2中。

本文所述方法容许使用能够区别两不同序列并在扩增子序列内切断进而阻止所述切断序列扩增的任何切断试剂。所述序列之间的差异可能由在所述序列内位于一个或多个多态位点处的不同等位基因造成。在另一实例中，所述序列之间的差异可能由两同源序列造成的，举例来说，由两共生同源基因或两高度同源基因造成的，例如，编码D多肽的RhD基因与编码CcEe多肽的RHCE基因。切断试剂的一个实例是限制性内切酶，也称作限制性核酸内切酶。可选择多种可响应适当序列差异的限制性核酸内切酶(可自各种销售商获得)。在优选实施例中，所述限制性内切酶是HpyCH4V。在另一优选实施例中，限制性内切酶为Tsp509I。在某些实施例中，添加终止所述切断试剂的切断活性的步骤，举例来说，通过在扩增前引入蛋白酶及/或高温。

所述限制性核酸内切酶可在扩增之前或期间添加。在一个实施例中，所述限制性核酸内切酶是在扩增之前不足5分钟、在扩增前5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟或120或更多分钟时添加。如果向所述反应物中添加额外的限制性内切酶单元，那么可缩短培育时间。相反，经常使用较长培育时间以允许与较少酶单元的反应进行完全。此应视特定酶可在反应中存活(维持活性)的时间长短而定。在反应中，某一些酶可长期(＞16小时)存活而其它酶仅可存活1小时或更短时间。在某些实施例中，所述限制性内切酶消化大于40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的非目标核酸。然而，如果所消化非目标核酸不足40％可有效地富集目标核酸，那么所述限制性内切酶是在本发明范围内。在某些实施例中，所述限制性内切酶实质上消化所有的非目标核酸。在某些实施例中，当所述限制性核酸内切酶是在扩增期间添加时，所述限制性核酸内切酶是可在热循环期间保留活性的热稳定性限制性核酸内切酶。热稳定性核酸内切酶的实例包括但不限于Bst NI、Bs1 I、Tru 9I和Tsp 509I。在某些实施例中，所述切断试剂并热不稳定性(热不稳定)切断试剂，尤其是当所述消化优选地发生在扩增步骤之前时。在优选实施例中，所述切断试剂并非热稳定性切断试剂且非目标核酸消化发生在扩增步骤之前。在某些实施例中，引入一可在扩增步骤期间阻止或减少消化的步骤。

在一个实施例中，添加到样品中的限制性内切酶单元是0.10、0.25、0.50、0.75、1.0、2.0或更大。注意：DNA底物是以各种速率消化，因此，完全或实质上完全消化所需实际单元数目在检验与检验之间可能有所变化。

在某些实施例中，在单一反应中，只使用一种限制性核酸内切酶来消化一种或多种非目标等位基因。举例来说，可设计一种其中单一限制性核酸内切酶在所述基因组中实施多重(例如，大于5、10、15、20、25、50、100)消化的多重检验。在某些实施例中，使用一种以上(例如，大于或等于2、3、4、5、6、7、8、9、10)的限制性核酸内切酶来在所述基因组中制造多重(例如，大于5、10、15、20、25、50、100)消化。

扩增可在非目标等位基因切断之后或期间且在目标等位基因检测之前实施。在优选实施例中，扩增是在非目标等位基因切断之后实施。扩增可借助所属领域已知的任何方法来实施，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应、基于转录的扩增、限制性扩增、或滚环式扩增，使用复性至选定胎儿DNA区的引物。在扩增需要热循环的情形中，可在大于90℃时实施循环以便于灭活切断试剂。应选择寡核苷酸引物以便于其复性至拟扩增的序列。在一个实施例中，引物经设计以使得所述引物对的一个或两个引物含有可被一种或多种限制性核酸内切酶识别的序列。

在扩增后，目标等位基因在所述样品中的相对富集允许使用所属领域已知的任何实际核酸检测方法来精确地检测等位基因频率。举例来说，可使用任何下列方法，包括但不限于引物延伸或微量测序方法、连接酶序列测定方法、错配序列测定方法、微阵列序列测定方法、限制性片段长度多态性(RFLP)程序、基于PCR的检验(例如，PCR系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))、核苷酸测序方法、杂交方法、常规斑点印迹分析、单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链体分析、错配切断检测、质谱检测、实时-PCR及焦磷酸测序。

所述方法也可以在单一反应中以高水平进行多重检验。举例来说，可能同时检测到一种或多种等位基因。当多态基因座处的基因型未知时，多重检验实施例特别重要。在一些实例中，举例来说，当母亲基因型在多态基因座处为杂合型时，检验可能并不提供信息。参见图5A，其进一步阐述使用多态变异体来检测母体样品的胎儿核酸。在一个实施例中，检验大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、500或更多个目标等位基因，其中并非每一个目标等位基因均可提供信息。在某些实施例中，在多态基因座处的基因型为已知。在一些实施例中，检验大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50或更多个可提供信息的目标等位基因。本发明还部分地包括本文所提供不同多重检验方案的组合。

在某些实施例中，本发明部分提供一种用于量化样品中在多态基因座处的目标等位基因的方法，其中所述样品含有核酸，所述方法包含：用诸如限制性核酸内切酶等酶消化在所述多态基因座处含有母源等位基因的核酸，所述酶可选择性地消化母源等位基因，其中所述选择性消化产生富含胎儿DNA的DNA样品；实例在扩增子内的多态标记来测定母源或父源等位基因的频率，及与对照DNA样品比较父源或母源等位基因频率。在一个实施例中，等位基因频率差异表明染色体异常。在某些实施例中，对照DNA样品是以已知数量引入检验中的竞争性寡核苷酸。

在某些实施例中，本发明部分提供一种用于检测目标核酸是否存在的试剂盒。所述试剂盒的一种组份是用于扩增相关区域的引物。所述试剂盒的另一种组份包含用于辨别每一核酸物种的两不同等位基因的探针。

附图说明

图1是HpyCH4V消化图，其显示一系列DNA混合物的等位基因峰面积比。通过用未被HpyCH4V识别的SNP等位基因(即，目标等位基因)的计算峰面积除以质谱中所存在两种SNP等位基因的总峰面积来确定峰面积比。

图2是NlaIII消化图，其显示一系列DNA混合物的等位基因峰面积比。通过用未被NlaIII识别的SNP等位基因(即，目标等位基因)的计算峰面积除以质谱中所存在两种SNP等位基因的总峰面积来确定峰面积比。

图3是2％杂合型DNA混合物的HpyCH4V屏幕快照。注意：在DNA样品经HpyCH4V消化后，rs4329520和rs4658481分别出现′A′和′T′等位基因。

图4是2％杂合型DNA混合物的NlaIII屏幕快照。注意：在DNA样品经NlaIII消化后，rs2050927和rs4329520分别出现′A′和′T′等位基因。

图5A显示使用单核苷酸多态性(SNP)胎儿标识符来通过父系遗传等位基因确认胎儿DNA的存在。图5B显示代表性质谱，其表明自AMG XY评估的胎儿DNA数量与自胎儿标识符检验估计的胎儿DNA数量之间的关系。所述结果是使用在图9A-9C中所提供AMG引物产生。

图6描绘合适胎儿标识符的典型效能结果。在此，使用若干基因组DNA混合物验证SNP检验在DNA总量为1700拷贝与DNA总量为170拷贝时评估在母体DNA背景中的胎儿DNA数量的能力。注意：在低拷贝数下，胎儿DNA评估量的标准偏差会因采样误差的显著影响而增加。

图7显示用于检测系统模型中的父系遗传等位基因的多重SNP检验(总共21次检验)的效能。

图8A-8C提供AMG引物的定位设计。扩增引物具有单下划线且延伸引物具有双下划线。另外，提供竞争性序列。竞争性序列可用于定量方法。图8C包括显示由AMG检验和SRY检验各自产生的不同质量的结果表，其可用于说明各检验的结果。

图9提供白蛋白(ALB)引物的定位设计。扩增引物被突出显示且延伸引物具有双下划线。其中提供单独的PCR引物，所述引物的序列特异性部分具有下划线且多重标签没有下划线。另外，提供竞争性序列。竞争性序列可用于定量方法。

具体实施方式

在生物学和诊断学领域中已经确定某些核酸是以十分低的浓度存于人体中。具体来说，已经发现胎儿DNA存于母体血浆中(罗(Lo)等人，柳叶刀杂志(Lancet.)1997年8月16日；350(9076)：485-7)。此发现有利于研发简单地基于母体血液样品分析的非侵入性产前诊断方法(罗(Lo)等人，美国人类遗传学报(Am J Hum Genet.)1998年4月；62(4)：768-75)。基于母体血浆的方法的非侵入性特性代表优于诸如羊膜腔穿刺术和绒膜绒毛采样等常规产前诊断方法的一个重要优点，所述常规产前诊断方法与胎儿丢失的小但有限的风险相关。然而，所属领域的许多技术人员经历的技术挑战与辨别母体血浆中的共存母体DNA背景与相对少量胎儿DNA的能力有关。在怀孕期间，胎儿DNA数量占母体血浆中DNA总量的大约3-6％。因此，母体血浆的胎儿DNA分析的诊断可靠性通常取决于胎儿特异性标记的精确检测。

本文所述方法通过在检测或定量所述样品中所存在等位基因之前相对地富集低拷贝数核酸的量来解决此问题。在产前诊断情形中，使用限制性核酸内切酶增强的多态序列检测能够选择性地、灵敏地检测母体样品的胎儿核酸。在检测母体样品中所存在等位基因之前选择性地富集母体血浆样品中的胎儿DNA。为了富集在母亲血浆中所存在的胎儿DNA以便精确地检测在所述样品中所存在的胎儿等位基因，本文所述方法可切断母体核酸或源自母亲的核酸。因此，母体DNA可能实质上被缩减、掩蔽或完全破坏且留下其中DNA富含源自胎儿的DNA的样品。可使用一种或多种诸如限制性核酸内切酶等酶来选择性地缩减母体DNA，所述酶可选择性地消化包含母源等位基因的核酸。

定义

本文所用术语“样品”包括试样或培养物(例如，微生物培养物)，其包括核酸。术语“样品”也意欲包括生物和环境样品两者。样品可包括合成来源的试样。生物样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、活组织检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、母乳、乳汁、胚胎细胞和胎儿细胞。所述生物样品可为母体血液，包括母体血浆或血清。在一些环境中，所述生物样品是无细胞的。在其它环境中，所述生物样品确实含有母体血液中的细胞成份或细胞残留物。

在优选实施例中，所述样品包含若干核酸的混合物。举例来说，所述混合物可包含来自不同物种或来自不同个体的核酸。在一个实施例中，所述样品是来自怀孕女性或疑似怀孕的女性。在相关实施例中，所述样品是经由非侵入性方式(例如，血液抽取)获得。在一些实施例中，所述样品是来自任何动物，包括但不限于人类、非人类、哺乳动物、爬行动物、牛、猫、狗、山羊、猪、幼猪、猴、猿、大猩猩、公牛、奶牛、熊、马、绵羊、家禽、小鼠、大鼠、鱼、海豚、鲸、及鲨、或可测试目标核酸之存在的任何动物或有机体。

在优选实施例中，生物样品为血液，且更优选为血浆。本文所用术语“血液”涵盖全血或血液中的任一部分，例如，通常所定义的血清和血浆。血浆是指对经抗凝剂处理的血液实施离心获得的全血部分。血清是指在血液样品凝固后剩余的水样流体部分。环境样品包括环境材料，例如，地表物质、土壤、水、犯罪现场样品和工业样品，以及自食品和奶制品加工仪器、装置、设备、器皿、可弃式和不可弃式物件获得的样品。不应将这些实例视为限制适用于本发明的样品类型。

如本文所用术语“非侵入性”是指一种对个体(例如，母亲、胎儿、受害者等)产生最小风险的收集样品的方法。非侵入性方法的一个实例是血液抽取；而侵入性方法的实例包括羊膜腔穿刺术和绒膜绒毛采样，两者均会对胎儿产生有限的风险。

如本文所用术语“目标”或“目标核酸”欲指可检测或测量其存在或者可研究其功能、相互作用或特性的任何分子，其中目标核酸包含目标等位基因且非目标核酸包含非目标等位基因。当胎儿基因在多态基因座处为杂合型时胎儿核酸可包含目标核酸和非目标核酸。目标核酸的其它实例包括但不限于微量核酸、突变核酸、病毒性核酸和移植核酸。

在整个本发明中术语“核酸”与“核酸分子”可互换使用。所述术语是指寡核苷酸、寡聚核苷酸、聚核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、催化RNA、无性系、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增核酸、扩增子、PCR产物和其它类型的扩增核酸、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些物质都可呈单链或双链形式，并且除非另外加以限制，否则其涵盖可以与天然存在核苷酸类似的方式发挥作用的天然核苷酸已知类似物及其组合及/或混合物。因此，术语“核苷酸”是指天然存在和经修饰/非天然存在的核苷酸两者，其包括三、二和单磷酸核苷以及存于多核酸或寡核苷酸内的单磷酸酯单体。核苷酸也可为核糖核苷酸；2’-脱氧核苷酸；2’，3’-脱氧核苷酸以及众多种业内熟知的其它核苷酸模拟物。模拟物包括链终止核苷酸，例如3’-O-甲基卤代碱基或糖取代物；替代性糖结构，包括非糖物质、烷基环结构；替代碱基，包括肌苷；经脱氮(deaza)修饰的核苷酸；经χ和ψ连接体修饰的核苷酸；经质量标记修饰的核苷酸；磷酸二酯修饰或替换，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯、酰胺、酯、醚；和基本或完全的核苷酸间替代，包括切断连接，例如，光可切断硝基苯基部分。

在RNA的情形中，RNA可为存于母体血浆中的胎盘表达RNA。背景母体RNA可按照本文所提供方法经选择性地消化。而且，所述方法可进一步包含辨别RNA等位基因的额外步骤，其涉及逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。在某些实施例中，所述胎儿RNA可使用(例如)RNA提取方法从母体体液(优选地，全血且更优选地血浆或血清)提取，所述RNA提取方法可为(例如，但不限于)明胶提取方法；硅胶、玻璃珠或硅藻提取方法；基于胍鎓硫氰酸-酚的提取方法；基于胍鎓硫氰酸的提取方法；基于基于胍-氢氯酸的提取方法；使用离心(经由氯化铯或类似梯度)的方法；基于酚-氯仿的提取方法；及/或其它可行RNA提取方法，如所属领域已知的可用于提取细胞内RNA的方法，包括市售RNA提取方法，例如，通过使用或采用或修饰下述中的方法：波姆(Boom)等人，(1990，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)28：495-503)；张(Cheung)等人，(1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)32：2593-2597)；波姆(Boom)等人，(1991，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)29：1804-1811)；康姆扎斯尅(Chomczynski)和萨奇(Sacchi)(1987，分析生物化学(Analytical Biochem.)162：156-159)；康姆扎斯尅(Chomczynski)，(1993，生物技术(Biotech.)15：532-537)；康姆扎斯尅(Chomczynski)和麦基(Mackey)(1995，生物技术(Biotechniques)19：942-945)；康姆扎斯尅(Chomczynski)和麦基(Mackey)(1995，分析生物化学(Anal.Biochem.)225：163-164)；齐格恩(Chirgwin)等人，(1979，生物化学(Biochem.)18：5294-5299)；佛恩尼(Fournie)等人，(1986分析生物化学(Anal.Biochem.)158：250-256)；及WO 97/35589。

术语“扩增反应”是指任何增加核酸拷贝数的体外方式。

“扩增”是指使样品经受足以允许进行扩增的条件的步骤。扩增反应的组份可包括但不限于(例如)引物、聚核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP和诸如此类。术语“扩增”通常是指目标核酸的“指数式”增加。然而，本文所用“扩增”也可指核酸中所选目标序列数量的线性增加，但与一次性单一引物延伸步骤不同。

“聚合酶链式反应”或“PCR”是指可以几何级数扩增目标双链DNA中特定区段或子序列的方法。PCR为所属领域技术人员所熟知；例如，参见美国专利第4,683,195号和第4,683,202号；以及PCR方案：方法与应用指南(PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications)，英尼斯(Innis)等人，编辑，1990。

本文所用“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰核苷单体的线性寡聚体。寡核苷酸包括能特异性地结合目标核酸的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其环口异构形式、肽核酸(PNA)、和诸如此类。通常通过磷酸二酯键或其类似物来连接各单体以形成大小在数种单体单元(例如，3-4种)至数十种单体单元(例如，40-60种)范围内的寡核苷酸。每当通过字母序列(例如，“ATGCCTG”)来表示寡核苷酸时，应理解从左至右核苷酸呈5’-3’顺序且除非另外注明，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷且“U”表示核糖核苷(尿苷)。寡核苷酸经常包含四种天然脱氧核苷酸；然而，其也可包含核糖核苷或非天然核苷酸类似物。如果酶活性需要特定寡核苷酸或聚核苷酸底物，例如，单链DNA、RNA/DNA双螺旋或诸如此类，则所属领域的技术人员熟知寡核苷酸或聚核苷酸底物适宜组成的选择。

如本文所用“寡核苷酸引物”(或简写成“引物”)是指可与核酸模板上的序列杂交且有助于所述核酸模板扩增或者在检测所述核酸分子中起作用的聚核苷酸序列。在扩增实施例中，使用寡核苷酸引物作为核酸合成的起始点。引物可具有各种长度并且长度经常小于50个核苷酸，例如，长度为12-25个核苷酸。可根据那些所属领域技术人员已知的原理来设计PCR中所用引物的长度和序列。

术语“模板”是指在本文所述方法中可用于扩增的任何核酸分子。可将非天然双链RNA或DNA制成双链DNA以便用作模板DNA。任何双链DNA或含有多种不同双链DNA分子的制剂可用作模板DNA以扩增在模板DNA中所含相关基因座。如本文所用术语“扩增子”是指通过(例如)聚合酶链反应“拷贝”一次或多次的经扩增DNA。扩增子序列是在两扩增引物之间。

如本文所用术语“多态基因座”是指包含多态性的核酸区。所述核酸区的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多个核苷酸。

本文所用术语“多态性”是指等位基因变异体。多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)以及简单序列长度多态性。多态性可能是由一等位基因相对于另一等位基因有一个或多个核苷酸发生取代所致，或者可能是由插入或缺失、重复、反转和所属领域已知的其它改变所致。其它多态性包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、插入/缺失、短串联重复，例如，二-、三-或四-核苷酸重复(STR)及诸如此类。如本文所用多态性可包括后生变异体，只要可使用非后生特异性切断试剂进行切断。

本文所用术语“等位基因”是在染色体上占据相同位置的基因或DNA非编码区域的若干种替代形式之一。术语等位基因可用于描述来自任何有机体的DNA，包括(但不限于)细菌、病毒、真菌、原生动物、霉菌、酵母、植物、人类、非人类、动物、和古细菌。

等位基因可具有相同序列或可改变单一核苷酸或不只一个核苷酸。对于每个染色体具有两份拷贝的有机体来说，如果两个染色体具有相同的等位基因，则这种情况称作纯合。如果两个染色体上的等位基因不同，则这种情况称作杂合。例如，如果相关基因座是在染色体1上的SNP X且母系染色体在SNP X处含有腺嘌呤(A等位基因)并且父系染色体在SNP X处含有鸟嘌呤(G等位基因)，那么此个体在SNP X处为杂合型A/G。

如本文所用术语“突变型等位基因”可指与疾病状态(例如，癌症)相关的变异体等位基因。

如本文所用术语“序列标识符”是指存在于两个序列之间且可用于区分所述序列的任何序列差异。在一个实施例中，所述序列标识符并不包括甲基化差异。

如本文所用术语“基因型”是指存于个体或样品中的等位基因或非同源变异体的身份。术语“对样品进行基因定型”或“对个体进行基因定型”是指确定存于样品中或由个体在特定区中所携带的特异性等位基因或特异性核苷酸或多态性。

如本文所用术语“选择性地”并非意欲提议绝对事件而是优先事件。举例来说，“选择性地切断”用于指明一个序列(举例来说，非目标序列)优先另一序列(举例来说，目标序列)切断或消化。然而，一些目标序列也可能由于切断试剂或在切断过程中引入的其它变量缺乏特异性而切断。

如本文所用术语“切断试剂”是指能够根据在两个或更多个序列之间所存在序列差异有区别地切断所述两个或更多个序列的任何手段。切断剂可为酶。切断剂可为天然的、合成的、未经修饰的或经修饰的。在优选实施例中，所述切断试剂是限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶(或者称为限制性内切酶)是一类可切割或消化在特定位点处的DNA的细菌酶。I型限制性核酸内切酶作为与甲基化酶的复合物及作为可结合DNA上识别位点的多肽出现。所述I型限制性核酸内切酶通常并不是很特异的限制性核酸内切酶且在远端位点处切割。II型限制性核酸内切酶是典型的实验工具。其具有特异性很强的识别和切割位点。所述识别位点较短，有4-8个核苷酸，且通常为回文序列。由于两条链具有在相反方向上伸展的相同序列，所述酶使双链断裂，如果切断位点远离中心，那么此断裂产生具有短单链尾部的片段；这些片段可与其它片段尾部杂交且称为粘性末端。所述酶通常依据分离其的细菌来命名(属名的首个字母和种名的前两个字母)。接下来认定菌株且用罗马数字指定多种酶。举例来说，从大肠杆菌(E.coli)R菌株分离的两种酶指定为Eco RI和Eco RII。在优选实施例中，所述限制性内切酶是II型限制性核酸内切酶。在另一优选实施例中，所述限制性内切酶具有热不稳定性。

如本文所用术语“染色体异常”是指目标染色体的结构与正常同源染色体不符。术语“正常”是指在特定物种的健康个体中所发现的主要核型或带型。染色体异常可为数量性或结构性，且包括(但不限于)非整倍性、多倍性、倒位、三体性、单体性、重复、缺失、部分染色体缺失、添加、部分染色体添加、插入、染色体片段、染色体区域、染色体重排、和易位。染色体异常可能与病理性状态的存在相关或与引发病理性状态的诱因相关。

与本文所述方法相关的用途和优点

本发明部分提供特别适用于非侵入性产前测试的基于核酸的检验。本文所提供方法尤其可用于测定样品中胎儿核酸的存在、测定样品中胎儿核酸的数量、测定胎儿性别、及富集目标核酸序列。本发明部分可与诸如那些阐述于下述中的方法等其它产前方法组合：2008年2月7日提出申请的美国申请案第12/027,954号、2007年5月30日提出申请的PCT申请案第PCT/US07/69991号、2007年6月15日提出申请的PCT申请案第PCT/US07/071232号、2008年3月3日提出申请的美国临时申请案第61/033,343号、2008年3月11日提出申请的美国临时申请案第61/035,711号；或与任何揭示于在2007年6月15日提出申请的美国临时申请案第60/944,331号中的产前诊断(侵入性和非侵入性)方法组合，所有所述案件均以引用的方式并入本文中。

本发明部分可用于使用与本文所提供标准相匹配的高频率多态性更精确地检测胎儿DNA。这些多态性也可以称为胎儿标识符。所述标准包括下述中的一者或多者：

1)所述SNP的一种等位基因可被所述切断试剂识别；

2)另一种SNP等位基因不被所述切断试剂识别；

3)在PCR扩增子内的SNP+/-50碱基对处没有发现其它切断位点；及

4)(任选地)次要等位基因频率大于0.4(优选地，在群体范围内)。

胎儿标识符的实例阐述于表6、9、10和11中。在一个实施例中，检测样品中是否存在胎儿核酸的方法包含获得或拥有已知源自母亲且疑为包含胎儿核酸的核酸样品；分析所述核酸样品以确定在一种或多种核苷酸多态性中的母体基因型，所述核苷酸多态性选自由陈述于表6、9、10和11中的多态性组成的群组；并分析所述核酸样品以确定在一种或多种核苷酸多态性的胎儿基因型，所述核苷酸多态性选自由陈述于表6、9、10和11中的多态性组成的群组，其中拥有父系遗传等位基因的胎儿基因型表明存在胎儿核酸，而且其中包含母源等位基因的核酸使用本文所提供方法被消化。在优选实施例中，一种或多种陈述于表6或11中的多态性结合本文所提供方法使用。在相关实施例中，首先自实质上不含胎儿核酸的DNA确定所述母体基因型。举例来说，在所述样品是血液的情形中，可自包含有核母体细胞(例如，白细胞)的血液部分确定所述母体基因型。在一个实施例中，实质上不含胎儿核酸的DNA是来自外周血单核细胞。在某些实施例中，通过比较父系遗传等位基因与内部对照(例如，竞争性寡核苷酸)的相对数量来确定胎儿DNA的数量。

在表6、9、10和11中，扩增引物对的每一引物可包含所示整个序列或只包含无下划线的序列，其中所述引物的有下划线部分是供经改良多重分析的标签序列(ACGTTGGATG)且无下划线的部分是序列特异性引物序列。所述标签序列可为任何所属领域已知的可改良多重分析的标签序列。在某些实施例中，本发明部分包括实质上与本文所提供引物相类似的引物，举例来说，相似度为约90％或更大，而且其中所述引物对指定核酸区仍具有特异性。举例来说，引物序列的一个或多个碱基可发生变化或被取代(例如，肌苷)，但所述引物仍保持相同的特异性和结合能力(plexing ability)。以大写字母文本指明的碱基与跟引物杂交的核酸序列互补且以小写字母文本指明的碱基不与跟引物杂合的核酸序列互补。以小写字母文本指明的碱基可经选择以改变或调节引物和扩增产物的质量。

在特定实施例中，序列标签连接至在表6、9、10和11中所提供多个初级和次级引物对。所述序列标签可连接至每一引物对的初级和次级引物中的任一者或两者。通常，所述序列标签连接至每一引物对的初级和次级引物。本文所用序列标签的长度可在自5至最多20、自5至最多30、自5至最多40、或自5至最多50个核苷酸的范围内，其中长度为10-mer的序列标签特别适用于本文所提供方法。在多重扩增反应中对于每一引物对来说所述序列标签不一定是相同的序列且对于特定扩增引物对内的初级和次级引物来说也不一定是相同的序列。在一特定实施例中，所述序列标签对于在多重扩增反应中的每一引物来说是相同的。举例来说，在某些实施例中，所述序列标签是10-mer，例如，-ACGTTGGATG-且连接至每一初级和次级引物的5′末端。在本文所提供方法的特定实施例中，只有单一引物对可用于扩增每一特定核酸目标区。

在某些实施例中，本文所述方法可用于改良母体样品中Y-染色体的检测，其可用于测定胎儿性别。可通过实施在实例3中所述SRY检验来测定母体样品中是否存在Y-染色体。SRY检验是可检测痕量Y-染色体的高度灵敏的定性内部标准检验。在某些实施例中，可根据本文所提供方法检验定位于Y-染色体上的其它多态性。

还可通过实施本文所提供AMG检验来测定母体样品中是否存在Y-染色体。可结合诸如RhD检验、血型检验或性别测试检验等其他检验来测定是否存在目标核酸。所述方法还可用于其他应用中，包括但不限于亲子鉴定、法医或质量控制检验。

除了产前应用外，所述方法还可用于诸多应用，包括但不限于检测罕见的癌症突变、检测移植排斥和法医。

在某些实施例中，测定人类血清白蛋白(ALB)基因的核酸分子总拷贝数。用于测定在样品中所存在核酸总拷贝数的方法包含检测白蛋白特异性延伸产物及比较延伸产物与引入所述样品中的竞争剂的相对数量。在相关实施例中，本发明部分提供用以测定样品中胎儿DNA的相对数量的组合物和方法(例如，当所述样品是来自怀有男性胎儿的怀孕女性的血浆时)，其包含使一种或多种白蛋白基因序列复性至胎儿DNA，在图9中所提供引物；实施引物延伸反应；及分析引物延伸产物以测定ALB延伸产物的相对数量，其中已使用本文所提供方法使母体白蛋白核酸减少。在相关实施例中，首先使用在图9中所提供扩增引物来扩增胎儿ALB扩增子。所述检验可用于测量在样品中所存在或者加载至特定反应中的核酸多少(例如，总拷贝数)。所述检验可用作内部对照及可能成功地进行特定PCR反应的指导。举例来说，如果测量到只有400拷贝ALB，那么检测到任何胎儿DNA的可能性可被视为很低。在某些实施例中，引入在图9中所提供竞争剂作为内部标准以测定拷贝数。在一个实施例中，可将200、300、400、500、600、700、800或更多个竞争剂分子引入所述检验中。

本文所述方法提供许多优点。所述方法可高度灵敏地检测以低相对百分比存于DNA混合物中及以低拷贝数存在的多态等位基因(例如，胎儿标识符)。还可以将所述方法纳入单一反应的多重检验中。所述方法可容易地执行且只需对许多当前检测方法添加单一额外步骤即可。

核酸酶

用于选择在特定位点处切割核酸的限制性内切酶的切断方法和程序为所属领域的技术人员所熟知。举例来说，许多限制性内切酶供应商提供关于可通过特异性限制性内切酶切割DNA序列的条件和类型的信息，包括英格兰生物实验室公司(NewEngland BioLabs)、骏日宝生物化学公司(Pro-Mega Biochems)、宝灵曼公司(Boehringer-Mannheim)及诸如此类。

拟切断核酸的制剂应不含诸如酚、氯仿、醇、EDTA、去污剂或过量盐等污染物，所有这些污染物均可能干扰限制性内切酶活性。

本发明各实施例可自经选择以响应适当多态等位基因的多种限制性核酸内切酶(可自各种销售商获得)组装而成，只要所述限制性核酸内切酶对一种多态等位基因的选择性优于对另一种多态等位基因的选择性并在扩增子序列内实施消化以使得其可阻止后续扩增事件。在一个实施例中，所述扩增子经选择以使得其含有可变核酸酶限制酶切位点及序列标识符，此可与所述限制酶切位点相同或不同。而且，所述限制性内切酶不一定在所述多态位点处切断，举例来说，在SNP的可变核苷酸处切断。

根据亚单元组成、切断位置、序列特异性和辅因子需求，在传统上将限制性内切酶分成三种。然而，氨基酸测序揭开了限制性内切酶有极多种类型并揭露在分子水平上有许多酶的种类都多于三种。

I型酶是在距其识别序列任意远处切割DNA的复杂、多亚单元、组合的限制性内切酶和修饰酶。起初我们认为是罕见的，现在我们从定序基因组分析获知这是很常见的。I型酶具有相当大的生物化学利益但其具有很小的实用价值，这是因为I型酶不产生离散的限制性片段或清晰的凝胶带图案。

II型酶在靠近其识别序列或在其识别序列内的指定位置切割DNA。其产生离散的限制性片段和清晰的凝胶带图案且其是用于实验室DNA分析和基因克隆的唯一类型。II型酶在氨基酸序列上经常彼此完全不同，甚至也不同于所有其它已知蛋白，因此其可能是独立地出现在进化过程中而不是源自共同的祖先。

最常见的II型酶是那些在其识别序列内切断DNA的II型酶，如HhaI、HindIII和NotI。此种酶是可购得的主要酶。大部分识别对称DNA序列，这是因为其作为同型二聚体与DNA结合，但少数(例如，BbvCI：CCTCAGC)识别不对称DNA序列，这是因为其作为异源二聚体与DNA结合。某些酶识别其中识别序列的两个半位点毗邻的连续序列(例如，EcoRI：GAATTC)，而其他酶识别其中半位点被隔开的不连续序列(例如，BgII：GCCNNNNNGGC)。切断在每次切割的一侧留下3′-羟基且在另一侧留下5′-磷酸根。其只要求镁有活性且相应的修饰酶只要求S-腺苷甲硫氨酸有活性。此种酶往往较小，其中亚单元在200-350个氨基酸范围内。

其次最常见的是II型酶-通常称作“IIs型酶”的是那些靠一侧切断其识别序列外侧的II型酶，如FokI和AlwI。这些酶大小中等，长度为400-650个氨基酸，且其识别连续且不对称的序列。其包含两个不同的结构域，一个用于DNA结合且另一个用于DNA切断。据认为，这些酶大部分作为单体与DNA结合，但经由毗邻酶分子的切断结构域二聚作用以协作方式切断DNA。鉴于此原因，一些IIs型酶对含有多个识别位点的DNA分子的活性要强的多。诸多IIS型限制性内切酶为人们所知且这些酶是自细菌、噬菌体、古生菌和真核藻类的病毒分离得到且可购得(普洛麦格(Promega)，麦迪逊维斯(Madison Wis.)；新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass.))。可用于本文所述方法的IIS型限制性内切酶的实例包括但不限于诸如那些列示于表IA中的酶等酶。

表                                                                         1A

酶来源                                            识别/切断位点  供应商

Alw I-洛菲氏不动杆菌属                            GGATC(4/5)     新英格兰生物实验室

(Acinetobacter Iwoffii)

Alw26I-洛菲氏不动杆菌属                           GTCTC(1/5)     普洛麦格

Bbs I-侧芽胞杆菌                                  GAAGAC(2/6)    新英格兰生物实验室

(B acillus laterosporus)

Bbv I-短芽胞杆菌                                  GCAGC(8/12)    新英格兰生物实验室

(Bacillus brevis)

BceA I-蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)              IACGGC(12/14)  新英格兰生物实验室

1315

Bmr I-巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)           CTGGG(5/4)     新英格兰生物实验室

Bsa I-嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus                   GGTCTC(1/5)    新英格兰生物实验室

stearothermophilus)6-55

Bst71I-嗜热脂肪芽孢杆菌71                         GCAGC(8/12)    普洛麦格

BsmA I-嗜热脂肪芽孢杆菌A664                       GTCTC(1/5)     新英格兰生物实验室

BsmB I-嗜热脂肪芽孢杆菌B61                        CGTCTC(1/5)    新英格兰生物实验室

BsmF I-嗜热脂肪芽孢杆菌F                          GGGAC(10/14)   新英格兰生物实验室

BspM I-芽胞杆菌属M                           ACCTGC(4/8)  新英格兰生物实验室

Ear I-产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)     CTCTTC(1/4)  新英格兰生物实验室

Fau I-水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)    CCCGC(4/6)   新英格兰生物实验室

Fok I-海床黄杆菌(Flavobacterium              GGATG(9/13)  新英格兰生物实验室

okeanokoites)

Hga I-鸡嗜血杆菌(Haemophilus gallinarum)     GACGC(5/10)  新英格兰生物实验室

Pie I-勒氏假单胞菌(Pseudomonas               GAGTC(4/5)   新英格兰生物实验室

lemoignei)

Sap I-糖多孢菌属(Saccharopolyspora           GCTCTTC(1/4) 新英格兰生物实验室

species)

SfaN I-粪链球菌(Streptococcus faecalis)ND    GCATC(5/9)   新英格兰生物实验室

547

Sth132 I-嗜热链球菌(Streptococcus            CCCG(4/8)    无商业供应商

thermophilus)ST 132                                       (基因(Gene)195：

                                                           201-206(1997))

II型酶的第三个大类，更恰当地，称作“IV型”是长度为850-1250个氨基酸的较大组合的限制性内切酶和修饰酶，其中两种酶活性驻留于相同蛋白链中。这些酶在其识别序列外部切断；那些识别连续序列的酶(例如，Eco57I：CTGAAG)只在一侧切断；那些识别不连续序列的酶(例如，BcgI：CGANNNNNNTGC)在两侧切断，释放含有所述识别序列的小片段。这些酶的氨基酸序列不同但其结构是一致的。这些氨基酸序列包含一个连接至DNA-修饰结构域的N-末端DNA-切断结构域及一个或两个形成C-末端或作为独立的亚单元存在的DNA序列-特异性结构域。这些酶在与其底物结合时，其转变到限制模式以切断DNA或修饰模式以对其进行甲基化。

如上文所讨论，限制识别位点的长度可有所变化。举例来说，酶EcoRI、SacI和SstI各自识别DNA的6碱基对(bp)序列，而NotI识别长度为8bp的序列且Sau3AI的识别位点长度仅为4bp的序列。识别序列的长度表明所述酶会在DNA随机序列中切割的频率。具有6bp识别位点的酶通常会每46或4096bp切割一次；具有4bp识别位点的酶会大致每256bp发生一次切割。

不同的限制性内切酶可具有相同的识别位点-这些酶称为同切点酶。表IB显示SacI和SstI的识别位点是相同的。在某一些情形中，同切点酶在其识别位点内以相同的方式切割但有时并非如此。同切点酶经常具有不同的最佳反应条件、稳定性和成本，此可影响决定使用哪种酶。表IB仅供显示例示性限制性内切酶且并非以任意方式限制本发明的范围。

表IB

  酶  识别序列

  BamH I  GGATCC CCTAGG  Not I  GCGGCCGC CGCCGGCG  Sau3A I  GATC CTAG  Sac I  GAGCTC CTCGAG  Sst I  GAGCTC CTCGAG  HinfI  GANTC CTNAG  Xho II  PuGATCPy PyCTAGPu

限制识别位点可为明确的或含糊的。酶BamHI识别序列GGATCC且不识别其他序列；因此其被视为“明确的”。相比之下，HinfI识别以GA开始、以TC结束且在这两者之间具有任意碱基的5bp序列(在表IB中，“N”代表任意核苷酸)。HinfI具有含糊的识别位点。XhoII也具有含糊的识别位点：Py代表嘧啶(T或C)且Pu代表嘌呤(A或G)，因此XhoII可识别并切割AGATCT、AGATCC、GGATCT和GGATCC序列。

一种酶的识别位点可含有另一种酶的限制酶切位点。举例来说，注意：BamHI识别位点含有Sau3AI的识别位点。因此，所有BamHI位点可用Sau3AI切割。类似地，4个可能Xho II位点中的一个也可为BamHI的识别位点且所有4个位点可用Sau3AI切割。

自表IB还可见，大部分识别序列是回文结构-其正向(在上游链上5′至3′)及反向(在下游链上5′至3′)读取相同。常用限制性内切酶的大部分但当然不是所有的识别位点是回文结构。大部分限制性内切酶作为二聚体(配对)与其识别位点结合。

核酸检测

不管是检测序列差异、检测扩增产物还是检测引物延伸产物，均可使用所属领域已知的任意检测或辨别方法。这些方法包括但不限于引物延伸反应、质谱法、使用至少一探针的杂交、使用至少一荧光标记探针的杂交、直接测序、克隆和测序、及电泳。所属领域已知的多态性检测方法还可包括(例如)微量测序方法、连接酶序列测定方法(例如，美国专利第5,679,524号和第5,952,174号、及WO 01/27326)、数位化PCR(美国专利第6,143,496号)、错配序列测定方法(例如，美国专利第5,851,770号、第5,958,692号、第6,110,684号、和第6,183,958号)、微阵列序列测定方法、限制性片段长度多态性(RFLP)程序、基于PCR的检验(例如，PCR System(应用生物系统公司(Applied Biosystems)))、核苷酸测序方法、杂交方法、常规斑点印迹分析、单链构象多态性分析(SSCP，例如，美国专利第5,891,625号和第6,013,499号；奥里塔(Orita)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)86：27776-2770(1989))、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链体分析、错配切断检测、及阐述于谢菲尔德(Sheffield)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)49：699-706(1991)，怀特(White)等人，基因组学(Genomics)12：301-306(1992)，格蓝母(Grompe)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：5855-5892(1989)及格蓝母(Grompe)，自然基因学(Nature Genetics)5：111-117(1993)中的技术、质谱法检测(例如，美国专利US 20050079521，其以引用方式并入本文中)、实时-PCR(例如，美国专利第US5,210,015号、第US 5,487,972号，所述两个案件均以引用方式并入本文中)、或与对拟检测序列具有特异性的适宜核酸引物杂交。适宜核酸引物可以诸如基因芯片等样式提供。

引物延伸多态性检测方法(在本文中也称作“微量测序”方法)通常通过使互补寡核苷酸与携带多态位点的核酸杂交来实施。在这些方法中，所述寡核苷酸通常毗邻所述多态位点杂交。当所述延伸寡核苷酸与所述核酸杂交时如本文所用术语“毗邻”是指在核酸中延伸寡核苷酸的3′末端，有时为多态位点5′末端的1个核苷酸，经常为2或3个核苷酸且时常为多态位点5′末端的4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。随后借助一个或多个核苷酸(经常为1个、2个或3个核苷酸)来延伸所述延伸寡核苷酸，且添加至延伸寡核苷酸中的核苷酸的数目及/或类型决定存在哪种多态变异体。寡核苷酸延伸方法揭示于(例如)美国专利第4,656,127号、第4,851,331号、第5,679,524号、第5,834,189号、第5,876,934号、第5,908,755号、第5,912,118号、第5,976,802号、第5,981,186号、第6,004,744号、第6,013,431号、第6,017,702号、第6,046,005号、第6,087,095号、第6,210,891号、和WO 01/20039中。延伸产物可以任一方式来检测，例如，通过荧光方法(参见，例如，陈和郭(Chen&Kwok)，核酸研究(NucleicAcids Research)25：347-353(1997)及陈(Chen)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94/20：10756-10761(1997))及通过质谱方法(例如，MALDI-TOF质谱法)。使用质谱法的寡核苷酸延伸方法阐述于(例如)美国专利第5,547,835号、第5,605,798号、第5,691,141号、第5,849,542号、第5,869,242号、第5,928,906号、第6,043,031号、第6,194,144号、和第6,258,538号中。

微量测序检测方法经常纳入进行延伸步骤的扩增过程。所述扩增工程通常扩增来自包含所述多态位点的核酸样品的区域。可通过在聚合酶链反应(PCR)中利用一对寡核苷酸引物来实施扩增，其中一种寡核苷酸引物通常与多态性的3′区互补且另一种通常与多态性的5′区互补。PCR引物对可用于在(例如)美国专利第4,683,195号、第4,683,202号、第4,965,188号、第5,656,493号、第5,998,143号、第6,140,054号、WO 01/27327、和WO 01/27329中所揭示方法中。PCR引物对还可用于实施PCR的任何市售机器，例如，可自应用生物系统公司(Applied Biosystems)购得的任何系统。

微阵列可用于测定在核酸样品中是否存在多态变异体。微阵列可包括任何本文所述寡核苷酸，且用于制造和使用适用于预测的寡核苷酸微阵列的方法揭示于美国专利第5,492,806号、第5,525,464号、第5,589,330号、第5,695,940号、第5,849,483号、第6,018,041号、第6,045,996号、第6,136,541号、第6,142,681号、第6,156,501号、第6,197,506号、第6,223,127号、第6,225,625号、第6,229,911号、第6,239,273号、WO 00/52625、WO 01/25485、和WO 01/29259中。所述微阵列通常包含固体载体且所述寡核苷酸可通过共价键或通过非共价相互作用连接到此固体载体。所述寡核苷酸还可以直接或通过间隔分子连接到所述固体载体。微阵列可包含一个或多个与核苷酸序列内多态位点互补的寡核苷酸。

实例

提供下列实例以进一步阐述本发明各实施例而非对其进行限制。

实例1：使用Hpych4v和Nlaiii进行限制性核酸内切酶增强的多态序列检测

使用若干限制性核酸内切酶(RE)证明限制性核酸内切酶增强的多态序列检测的功效，所述限制性核酸内切酶(RE)包括HpyCH4V和NlaIII(自新英格兰生物实验室公司(New England BioLabs，Inc)购得)。分别在多重基因定型反应中测试这两种酶特异性地切断指定多态性的一种等位基因的能力同时对所述多态性的其余等位基因实施PCR扩增。关于用每种酶测试的多态性，参见表2。

将两种CEPH DNA样品以不同比率混合以产生由0％、2％、5％、20％、50％和100％的对于SNP两种等位基因来说为杂合型的DNA组成的DNA样品，其余DNA是被RE识别的对于所述等位基因来说为纯合型的DNA。表3显示在这些研究中所用DNA样品及相应的基因型信息。由NA05995和NA10849组成的混合物用于HpyCH4V酶实验且由NA10862和NA10846组成的混合物用于NlaIII酶实验。

表2：识别SNP的限制性内切酶

  限制性内切酶  多态性 SNP等位基因  被RE消化的等位基因  rs 10430091  A/T  NlaIII  rs2050927  A/T  A  NlaIII，HpyCH4V  rs4329520  A/T  T，T*  rs4657868  A/T  HpyCH4V  rs4658481  A/T  A  rs6693568  A/T  rs860954  A/T  rs9431593  A/T

*两种酶NlaIII和HpyCH4V消化T等位基因。

表3：所用DNA样品和基因型

*DNA样品是自科里尔(Coriell)CEPH DNA收藏所获得。

表4：DNA混合物(按照反应以ng DNA列示)

注释：基于单倍体人类基因组当量的3pg DNA，0.6ng DNA等于200拷贝所述混合物基因组目标DNA。

在制备样品DNA混合物后，按照下表5(使用在表6中所示多重PCR引物)制备PCR混合制剂以便按照每一样品反应使其不包括限制性核酸内切酶或包括0.25U限制性核酸内切酶。将PCR混合制剂等分添加至96-孔板中以便对于每种酶条件来说每种DNA混合物具有7个重复样品。在向PCR混合制剂混合物中添加DNA后，将样品在37℃下培育1小时以便于DNA样品被酶消化且随后立即使用标准条件进行热循环(表7)。

表5：不添加DNA的每一多重分析的PCR混合制剂制备

  试剂  最终浓度  无RE  N＝1(uL)  HpyCH4V  N＝1(uL)  NlaIII  N＝1(uL)  水  n/a  3  2.95  2.975  10xPCR缓冲剂(HotStar Taq缓冲剂)  1.25x  3.125  3.125  3.125  MgCl₂(25mM)  1.625mM  1.625  1.625  1.625  PCR核苷酸混合物(供UNG使用)(10mM  dATP，dCTP，dGTP，dUTP)  0.2mM  0.5  0.5  0.5  F/R引物混合物(0.5uM)  0.1μM  5  5  5  5U/ul HpyCH4V或10U/ul NlaIII  0.25U/rxn  -  0.05  0.025  1U/μl尿嘧啶-DNA-糖基化酶  (Uracil-DNA-Glycosylase)(UDG)  1.25U/rxn  1.25  1.25  1.25  HotStar Taq(5U/uL)  2.5U/rxn  0.5  0.5  0.5  DNA-分别添加  变化的  10  10  10  总体积  n/a  25  25  25

表6A：SNP的PCR引物序列

  SNP  正向PCR引物  反向PCR引物  rs  10430091  ACGTTGGATGCACAAGATT  CTGAAACTTAG  ACGTTGGATGGCTGTTTAACTCAG  CATG

  rs2050927  ACGTTGGATGTTGGGTGC  AGAGTAGTCATC  ACGTTGGATGTTCTAGCTTGCTTC  TCCTCC  rs4329520  ACGTTGGATGATGTCCACC  TCCTGCTCCAC  ACGTTGGATGGAAAGTTGTCGTGG  TAGAGG  rs4657868  ACGTTGGATGCTAGCGTAC  CCAATGGAATC  ACGTTGGATGCTAACCAGGAAAAG  ACACCC  rs4658481  ACGTTGGATGGTGGTAGA  AACAAATGTCAGC  ACGTTGGATGCTGCTAAGCATGAG  AGAAAG  rs6693568  ACGTTGGATGGGCCTGTT  CATTCTCAGAAA  ACGTTGGATGTGACTAGGAAATCA  CACTGG  rs860954  ACGTTGGATGTAGCCTTTA  GTCTTGATGCC  ACGTTGGATGCCATTCTTGTATGT  TTTGTC  rs9431593  ACGTTGGATGGCCTCAGTA  GTCACATAAGG  ACGTTGGATGTTGAGATCAGTGTC  GGTTCC

表6B：延伸引物

  SNP  延伸引物  rs 10430091  gTGTTTAACTCAGCATGTGGGAA  rs2050927  CCTCCATCATCCTTAGC  rs4329520  GCGTGGTTCTAGACTTATGC  rs4657868  cAAGACACCCCCATACATTA  rs4658481  TAAGCATGAGAGAAAGGGAAAG  rs6693568  atGAAATCACACTGGACATTTT  rs860954  GTTTTGTCTTTTTCTGTATACTCATG  rs9431593  TGTTCCTGACTCTCAAAAT

表7：热循环条件

借助表5中的延伸引物使用标准iPLEX^TM检验和技术对在PCR期间产生的扩增子进行基因定型(朱林可(Jurinke)，C，欧斯(Oeth)，P.，范德波姆(vanden Boom)，D.，MALDI-TOF质谱法：高效能DNA分析的通用工具(a versatile tool forhigh-performance DNA analysis).分子生物技术(Mol.Biotechnol.)26，147-164(2004)；及欧斯(Oeth)，P.等人，iPLEXTM检验：借助经质量修饰终止子延伸的单碱基引物增强系统的多重分析功效和灵活性(Increased Plexing Efficiency andFlexibility forSystem through single base primer extension withmass-modified Terminators).SEQUENOM应用注意事项(2005)，两者均以引用方式并入本文中)。

结果

用两种限制性内切酶消化DNA在次要等位基因以低达2％杂合型DNA比率存在时能够检测次要等位基因。此与未被消化DNA样品相反，其中次要等位基因在以20％杂合型DNA及更大比率存在时才能可靠地检测到。当考虑等位基因峰面积比时，限制性核酸内切酶消化的效应甚至更明显。经HpyCH4V消化的样品显示在2％杂合型DNA混合物中的次要等位基因的峰面积比为0.35-0.45，而2％杂合型DNA混合物的次要等位基因的峰面积比处于背景水平且未经酶消化(图1)。尽管等位基因峰面积比增加不如使用NlaIII限制性核酸内切酶时高，但结果是相似的(图2)。含有或不含HpyCH4V(图3)或NlaIII(图4)的2％杂合型DNA混合物的质谱屏幕快照实例示于下文中。

优化研究

使用5％杂合型DNA混合物(0.6ng杂合型DNA，11.4ng纯合型DNA)实施酶浓度和HpyCH4V消化预PCR培育时间的初步优化研究。基于这些实验，在培育时间短至5分钟且用0.25U HpyCH4V酶时达最大峰面积比。

实例2：使用Tfii进行限制性核酸内切酶增强的多态序列检测

按照在实例1中所述使用不同的限制性核酸内切酶TfiI实施类似的实验。在此实验中，TfiI限制性核酸内切酶选择性地识别及切断′C/T′SNP，rs4487973的′C′等位基因。SNP rs4487973出现在染色体1上的下列基因组序列中：CACACAGTTAGGATT[C/T]ACCTGAGCTTGTCCC。对于这些研究来说，将两种CEPH DNA样品(一种是rs4487973SNP纯合型′C′且另一种是rs4487973SNP杂合型′C/T′)以不同的比率混合以产生含有0％、1％、2.5％、10％、50％rs4487973T等位基因的DNA混合物。向每一混合物中添加或不添加TfiI限制性核酸内切酶以测定核酸内切酶对多态序列检测的影响。在没有被TfiI酶消化的混合物中，在10％和50％T等位基因混合物中检测到rs4487973T等位基因而在0％、1％和5％T等位基因DNA混合物中没有检测到。然而，在被TfiI酶消化的样品中，在1％、5％、10％和50％T等位基因混合物中可检测到rs4487973T等位基因。这些结果表明使用此方法可改良以低相对浓度存于样品中的多态等位基因的检测。

实例3：胎儿标识符、性别测试和拷贝数测定

SNP选择

用总共16个SNP实施关于临床样品的父系遗传等位基因和与男性胎儿Y-染色体频率相关性的分析。对用于分析临床样品的SNP检验进行多重分析(8-重)。在所有种群中所有SNP具有次要等位基因频率(maf)(～0.4)且未被连接。

在评估可用疾病特异性标记进行多重分析的通用胎儿标识符小组的效能时，选择一组新的泛族maf＞0.4的87A/T SNP并进行16重分析。

SNP分析方法

使用iPLEX^TM检验和技术实施母体血沉棕黄层和母体血浆的SNP分析。简单来说，在所述SNP周围的目标区首先被PCR扩增。接下来，使寡核苷酸引物复性至PCR产物并借助单核苷酸使用4个终止子核苷酸和DNA聚合酶的混合物以等位基因特异性方式加以延伸。将延伸产物转移至小型化芯片阵列并通过MALDI-TOF质谱法来分析。测定延伸产物的分子量可明确地识别存于所述样品中的SNP等位基因。质量信号的峰面积比可评估等位基因在指定样品中的相对丰度。图5A提供用于SNP分析的检验的概括。

临床样品

总样品集係由35个来自怀孕高加索女性(9个，妊娠早期；12个，妊娠中期；14个，妊娠晚期)的成对血液/血浆样品构成。

用于测定母体血浆中Y-染色体频率与父系遗传等位基因之间的相关性的样品子集是由19种来自怀有男性胎儿的怀孕高加索女性的样品构成。

DNA提取

使用用于胎儿基因定型的MinElute试剂盒自1ml母体血浆提取DNA。

使用用于母体基因定型的Qiagen′s PureGene试剂盒自4ml冷冻血(除去血浆)提取DNA。

结果

使用旨在测定X染色体和Y染色体上的牙釉蛋白区中序列差异的检验来估计自怀有男性胎儿的怀孕女性血浆提取的胎儿DNA的相对数量。关于AMG检验的详情描绘于图8A-8C中。可通过序列特异性iPLEX延伸产物及其相应的质量信号来辨别X特异性序列与Y特异性序列。延伸产物的峰面积比可评估胎儿DNA的相对数量，这是因为Y特异性序列表示总胎儿DNA贡献的50％。

男性胎儿的19个血浆样品中有16个(84％)显示Y-染色体频率高于5％，表明在所提取DNA中存在至少10％胎儿DNA。

图6描绘一合适胎儿标识符的典型效能结果。在此，使用若干基因组DNA混合物验证SNP检验在DNA总量为1700拷贝与DNA总量为170拷贝时评估在母体DNA背景中的胎儿DNA数量的能力。注意：在低拷贝数下，胎儿DNA评估量的标准偏差会因采样误差的显著影响而增加。

表8提供以10+倍结合水平进行多重分析且通过所有确认阶段的SNP列表。下列显示用于证明多重SNP检验在确定胎儿DNA存在方面的效用的确认方案、效能标准和模型系统：

第I阶段

步骤1：初步胎儿标识符(FI)筛选参数

·FI是自多种87A/T SNP(质量相差56Da)的混合物进行多重分析获得

·对照DNA(CEPH群体)的基因定型

步骤2：提高筛选标准

·4个复制品出现基因定型重现性

·明确的基因型数据(检验显示没有干扰或不可预期的质量信号)

·在杂合型DNA中存在等位基因倾斜

·杂合型DNA的等位基因比率的变化

步骤3：再次分析成功的SNP并重复第I阶段筛选以产生10+SNP多重分析

在第II阶段测试通过第I阶段测试标准的经多重分析的SNP。

第II阶段

步骤1：基因组DNA混合物用于估计FI可靠性

·混合物母体：2000拷贝DNA1

·混合物10％：3600拷贝DNA 1/400拷贝DNA 2

·混合物20％：1600拷贝DNA 1/400拷贝DNA 2

以4个混合物系列及8次重复测量来分析等位基因频率变化。计算灵敏度和特异性以检测在高拷贝数等位基因背景中的低拷贝数等位基因。

在第III阶段测试通过第II阶段测试标准的经多重分析的SNP。

第III阶段

步骤1：将各种DNA混合以仿效不同的母体-胎儿组合

·第1组：3600拷贝母体DNA/400拷贝胎儿DNA

·第2组：1600拷贝母体DNA/400拷贝胎儿DNA

每一组含有88种样品混合物，4种阳性和4种阴性对照。以4个混合物系列分析等位基因频率变化，其中计算灵敏度和特异性以检测在高拷贝数等位基因背景中的低拷贝数等位基因。

将此检验小组应用于检测在母体DNA背景中的胎儿DNA的模型系统，显示如果样品制备方法可将胎儿DNA相对数量富集达20％，那么可以100％特异性和95％灵敏度检测父系遗传胎儿等位基因。在表8中，提供来自不同种族群体的各SNP的次要等位基因频率(MAF)。通过HapMap Project来定义种族群体，其中CEU表示北欧和西欧血统个体，HCB表示北京的汉族中国人，JAP表示东京的日本人且YRI表示尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人(Yoruba)。

表8

  SNP  MAF CEU  MAF HCB  MAFJAP  MAF YRI  rs11166512  0.43  0.41  0.50  0.49  rs11184494  0.50  0.40  0.48  0.50  rs11247894  0.43  0.39  0.32  0.44  rs12089156  0.46  0.49  0.44  0.43  rs12125888  0.40  0.43  0.48  0.43  rs12136370  0.42  0.48  0.42  0.48  rs12143315  0.40  0.42  0.42  0.42  rs12759642  0.39  0.48  0.48  0.42  rs156988  0.46  0.40  0.45  0.41  rs2050927  0.44  0.50  0.41  0.49  rs213624  0.48  0.44  0.40  0.34  rs2454175  0.46  0.48  0.43  0.40  rs4329520  0.45  0.43  0.40  0.44  rs4487973  0.47  0.43  0.44  0.40  rs454782  0.48  0.40  0.41  0.46  rs4648888  0.33  0.30  0.33  0.46  rs635364  0.49  0.40  0.46  0.43  rs660279  0.41  0.49  0.50  0.39  rs6687785  0.48  0.46  0.48  0.44  rs7551188  0.46  0.49  0.45  0.46  rs9431593  0.41  0.43  0.49  0.40

在相同母体血浆DNA提取物中分析得16个SNP多重分析小组的maf＞0.3并通过分析来自PBMC的DNA来建立母体基因型基准。使用所述母体基因型信息，确定血浆样品的父系遗传等位基因并自延伸产物的峰面积比评估胎儿DNA的数量，表示父系遗传胎儿等位基因和母源等位基因。

随后将AMG XY频率与可提供信息SNP的父系遗传胎儿等位基因的等位基因频率进行比较。此比较揭露具有10％(用作定量下限阈值)或更大的正Y频率的样品具有明显更大的母源等位基因频率与父系遗传胎儿等位基因频率差异(p-值＜0.001；费希尔氏精密测试(Fishers′exact test))。此数据表明胎儿标识符可用作确定胎儿DNA存在的非性别特异性方法。图7例示这些结果。

每个专利、专利申请案、公开案和本文所引用文献都是全文以引用方式并入本文中。引用上述专利、专利申请案、公开案和文献并不代表认可上述任意文献都是相关的先前技术，也不代表对这些出版物或文献中的内容或日期的认可。

可在不背离本发明基本方面的情况下对上文加以修改。尽管已经参照一个或多个具体实施例十分详细地阐述了本发明，但那些所属领域的普通技术人员应认识到，可对本申请案中具体揭示的实施例进行改变，而且这些修改和改良都在本发明范围和精神内。

可在不存在本文未具体揭示的任何要素的情况下以适宜方式实践本文说明性阐述的本发明。因此，例如，在本文中每一情形中，词语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一者都可用其它两个词语中的任一个来替代。所用词语和表达是用作说明性词语而不是限制性，并且使用所述词语和表达并不排除所示和所述特征或其部分的任何等效形式，并且可在本发明所主张范围内作出各种修改。除非上下文中明确阐述一种要素或不止一种要素，否则词语“一”是指其所修饰的一种或多个要素(例如“一试剂”可意指一种或多个试剂)。如本文所用词语“约”是指在基础参数10％内的数值(即，加或减10％)且如果在一串数值开头使用词语“约”，那么其修饰每一个所述数值(即，“约1、2和3”为约1、约2及约3)。例如，“约100克”的重量可包括介于90克与110克之间的重量。因此，应了解，尽管已通过代表性实施例和可选特征具体揭示本发明，但那些所属领域技术人员仍可采用本文所揭示概念的修改和变化形式，且所述修改和变化形式视为在本发明范围内。

本发明实施例阐述于上文权利要求中。