用于BNP免疫测定法的稳定标准品

摘要

本发明涉及一种稳定的标准品或校准物脑钠肽原(BNP原)制备物，其用于检测样品中BNP免疫反应性的方法。所述制备物包含BNP原或其片段或修饰形式。

说明书

发明领域

本发明涉及BNP抗原，并且具体涉及所述抗原的新的稳定形式，其可 以用作测量BNP免疫反应性的免疫测定法中的标准品或校准物(calibrator)。

发明背景

脑钠肽(Brain natriuretic peptide)(BNP)是一种由32个氨基酸残基组成的 小肽激素。BNP从心脏释放并且能够通过免疫学方法在血液中检测。已经承 认测量BNP的血液浓度是鉴定患有充血性心力衰竭(CHF)的患者的有效方 法。BNP的合成形式，即，BNP-32，通常在免疫测定法中用作标准品。多 项研究证实了合成BNP-32在掺入(spike into)血浆或缓冲溶液时显著的不稳 定性。肽的不稳定性显著折损(compromise)了合成BNP-32在免疫测定法中 作为液体校准物或液体标准品的应用。

脑钠肽(BNP)是一种心神经激素，其源自前体前BNP原(pre-proBNP)， 所述前体含有134个氨基酸并且在其N末端包括26个氨基酸的信号肽。将 通过切割信号肽产生的BNP原(proBNP)进一步切割成BNP，即认为是生物 学活性激素的C末端的32个氨基酸，并且通常相信BNP原是无活性的氨基 末端片段。

脑钠肽(BNP)的血液测量已经在充血性心力衰竭(CHF)中用作诊断和预 后的辅助，并且在急性冠状动脉综合征(ACS)中用作预后标记物。此外，可 以证明BNP可以用来辅助指导对CHF患者的医疗。对BNP临床测定逐渐 增加的兴趣导致开发这样的免疫测定法，其适合于随机存取的完全自动化、 高通量的临床设备，例如，ADVIA Centaur BNP(Bayer Diagnostics)和AxSYM BNP系统(Abbott Laboratories)。

Advia-Centaur BNP测定法是一种在自动多重分析仪(multi-analyzer)上进 行的非同位素免疫测定方法，所述分析仪允许高通量的测定形式。所述测定 法是一种基于一步方法的双位点免疫测定法。测定结果通过直接的化学发光 可见。尽管据报道所述技术考虑的是准确度(accuracy)改进的高通量测定法， 但是Advia-Centaur多重分析仪提供了一种用于进行免疫测定法的平台。同 样，其没有为所述测定法中使用的结合剂诸如抗BNP抗体提供改进。

AxSYM BNP测定法是一种完全自动化的微粒酶免疫测定法，其以两步 的三明治形式使用两种单克隆小鼠抗体。将BNP捕获在抗BNP涂覆的乳胶 微粒上，藉由碱性磷酸酶并测量由4-甲基伞形磷酸盐(4-methylumbelliferyl phosphate)底物分解产生的荧光来检测。固相抗体针对BNP的N末端，而缀 合抗体针对C末端。使用六种校准物用于AxSYM BNP测定法。校准物A 是含有蛋白质稳定剂的乙酸盐缓冲液。校准物B-F在含有蛋白质稳定剂的乙 酸盐缓冲液中含有渐增浓度的合成BNP(100、400、1000、2000和4000ng/L)。 这些校准物源于(traceable)用合成BNP按重量制备的参比标准品。AxSYM BNP测定法具有0-4000ng/L的动态范围。

AxSYM BNP测定法，如Advia-Centaur系统和其它用于测定BNP的方 法，使用常规的抗BNP抗体，其特异性识别成熟的32个氨基酸的BNP中 的表位。由此，这些方法均不能避免对测定准确度和可重复性的限制，所述 准确度和可重复性是由免疫学测量的标准化所赋予的，所述标准化依赖于对 BNP成熟形式的检测，所以本领域需要一种稳定、可靠的校准物或标准品用 于测量BNP。

发明内容

我们最近的研究已经证实通过免疫学方法在人血中检测到的大部分 BNP免疫反应性存在于BNP的前体形式(BNP原)中。同样，最近的研究揭 示人血中的大部分BNP原是糖基化的。这些发现确立了在免疫测定法中使 用BNP原作为标准品(校准物)的益处。稳定性研究揭示重组BNP原(糖基化 的或非糖基化的)与合成的BNP-32相比在BNP测定法中测量时展示了显著 更高的稳定性(至少10倍至1000倍，并且甚至更高)。重组糖基化BNP原的 稳定性显著高于非糖基化的重组蛋白的稳定性。所以，BNP原用于免疫测定 法中作为稳定的校准物或标准品优于合成BNP-32。

因此，本发明的一个方面涉及用于在检测样品中BNP(SEQ ID NO：4)或 其片段、或包含这种序列或其部分的分子的方法中使用的标准品脑钠肽原 (BNP原)制备物，其中所述标准品制备物包含具有SEQ ID NO：1中提供的氨 基酸序列、或其片段或修饰形式(modification)的分离的或重组的或合成的 BNP原与至少一种稀释剂的组合。BNP原的片段是BNP原的功能性多肽片 段，其保留与特异性结合全长BNP原的至少一种抗体特异性结合的能力。 在一种实施方案中，功能性片段将包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-76。在一些 实施方案中，BNP原的修饰形式，即修饰的BNP原，是与SEQ ID NO：1或 SEQ ID NO：2具有至少90％、95％、98％、99％或99.9％同一性的序列同一 性的多肽，或是这样的多肽，其序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的差 异在于五个或更少氨基酸的取代(优选地，保守氨基酸取代)、五个或更少氨 基酸的插入、或五个或更少氨基酸的缺失。技术人员使用日常技术和方法将 能够鉴定根据本发明的这些和其它多肽，因为每个这样的多肽将展现一种可 识别的与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相似的结构，其相似之处在于初级 氨基酸序列中至少90％的同一性，并且展现与结合配偶体(bin ding partner)， 例如抗体，特异性结合的功能特性，所述结合配偶体与具有SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4中所示序列的多肽特异性地结合。

在一些实施方案中，BNP原、其片段或修饰的BNP原是重组BNP原或 内源BNP原。同样，预期BNP原、其片段或修饰的BNP原是非糖基化的BNP 原，或糖基化的BNP原。此外，BNP原或其片段或修饰的BNP原可以在真 核细胞诸如人的细胞中表达。在一些实施方案中，BNP原或其片段或修饰的 BNP原是合成的BNP原。本发明包括修饰的BNP原多肽，其在从BNP原N 末端起的76个氨基酸残基的至少一个中，即，在BNP原氨基酸序列的N末 端片段中，包含至少一个氨基酸残基变化。示例性氨基酸修饰在上文描述。

本发明的另一方面是选自下组的肽作为标准品或校准物在用于检测样 品中BNP免疫反应性的方法中的用途：具有SEQ ID NO：1中给出的氨基酸 序列的分离的或重组的或合成的BNP原，分离的或重组的或合成的BNP原 片段，和分离的或重组的或合成的修饰BNP原。预期在根据本发明的各种 用途中，可以使用任何上述的肽或制备物，或可以使用分离的全长BNP原。 在用途的某些实施方案中，肽是从人的组织或体液如人血分离的内源BNP 原；在其它实施方案中，BNP原是重组BNP原肽。分离的或重组的BNP原 可以是非糖基化的BNP原或糖基化的BNP原。此外，肽，例如，糖基化的 BNP原，可以在真核细胞如人细胞中表达(内源地或重组地表达)。另一方面， 非糖基化的BNP原可以在原核细胞中表达。根据说明，在根据本发明的用 途中使用的肽可以是合成的肽，如合成的BNP原。合成肽是在细胞之外通 过人工使用用于合成肽的任何常规技术构建的肽。

本发明的另一方面是用于测定患者的血清、血浆、全血或其它体液样品 中具有如SEQ ID NO：4中给出的氨基酸序列的BNP或其片段或包含这种序 列或其部分的分子的诊断性免疫测定法，其包括(a)测量样品中的BNP免疫 反应性；(b)使用选自下组的多肽作为标准品制备标准曲线：分离的或重组的 或合成的BNP原，分离的或重组的或合成的BNP原片段，和分离的或重组 的或合成的修饰BNP原；和(c)将步骤(a)中获得的BNP免疫反应性的值与步 骤(b)中产生的标准曲线比较，从而定量所述样品中的BNP免疫反应性。

本发明的另一方面涉及用于诊断性测量患者的样品中BNP免疫反应性的 免疫测定试剂盒，所述试剂盒包含对BNP有特异性的单克隆或多克隆抗体； 可检测标记；和选自下组的多肽：分离的或重组的或合成的BNP原、分离的 或重组的或合成的BNP原片段和分离的或重组的或合成的修饰BNP原。

通过参考下文的附图简述和详述将更好地理解本发明的其它特征和优势。

附图简述

图1提供前BNP原体内加工示意图。

图2提供使用ELISA对不同单克隆抗体(Mab)的滴定曲线。抗原：人重 组NT-BNP原，量：0.01μg/孔。

图3图示说明了适合用于，例如，BNP免疫反应性的三明治免疫测定法 的单克隆抗体结合位点的表位位置。

图4显示适合在本发明的方法中使用的合适单克隆抗体的校准曲线。测 定法是在用抗生蛋白链菌素(streptavidin)涂覆的平板中进行的一步荧光免疫 测定法。用于捕获的单克隆抗体：生物素化的15F11或15C4，来自Hytest Ltd。 用于检测的单克隆抗体：铕(Eu)标记的24E11、29D12、13G12或18H5，全 部来自Hytest Ltd。样品体积：50μl，抗原：人重组NT-BNP原，温育时间： 室温30分钟。

图5公开了对内源NT-BNP原的稳定性研究。将从患有心力衰竭的患者 汇集的血样在4℃(-■-)和室温(-◆-)温育72小时。

图6提供对BNP原三明治免疫测定法的校准曲线。捕获抗体是Mab 50E1 (BNP特异性；Hytest Ltd.)，检测抗体是MAb 16F3(NT-BNP原特异性的； Hytest Ltd.)。在用抗生蛋白链菌素涂覆的平板中进行一步测定法。使用了生 物素化的单克隆抗体用于捕获，并且使用了铕标记的单克隆抗体用于检测。 样品体积：50μl，抗原：人重组BNP原，温育时间：室温30分钟。

图7公开了在Tricine-SDS凝胶电泳之后使用不同单克隆抗体的Western 印迹中对人重组NT-BNP原的检测。泳道1：Mab 5B6，泳道2：15F11，泳 道3：11D1，泳道4：15D7，泳道5：13C1，泳道6：24E11。全部抗体均来 自Hytest Ltd。NT-BNP原量：2.5μg/孔。

图8是在还原性条件下将重组BNP原样品分级的Tricine-SDS-PAGE凝 胶电泳图。泳道1：分子量标准品(BioRad)；泳道2：rec BNP原(重组的)，3 μg；泳道3：rec NT-BNP原(重组的)，3μg。用考马斯亮蓝R-250染色凝胶。

图9显示不同抗原在BNP免疫反应性测量中的稳定性。在4℃温育。

图10显示不同抗原在BNP免疫反应性测量中的稳定性。在25℃温育。

发明详述

脑钠肽(BNP)和NT-BNP原是公认的用于诊断、预后和治疗患有心力衰 竭的患者的标记物。两种肽都是蛋白水解加工前体分子前BNP原的产物(图 1)。前BNP原由134个氨基酸残基(a.a.r.)构成并且在心肌细胞中合成。前BNP 原通过未知的一种或多种蛋白酶切割产生两种肽，即，信号肽(氨基酸残基 1-26)和BNP原(氨基酸残基27-134)。对BNP原分子(108个氨基酸残基)的进 一步加工导致出现BNP(氨基酸残基77-108)和BNP原的N末端部分，即， NT-BNP原，氨基酸残基1-76。BNP分子含有通过在两个Cys残基之间形成 内在二硫键而形成的环状结构。BNP(生物学活性分子)和NT-BNP原(其生理 学活性，如果存在的话，未清楚地理解)二者以等摩尔量分泌至血流中并且 在人血中循环。健康成人血液中的BNP浓度为约25pg/ml(Wu等，Clin Chem. 2004May；50(5)：867-73)，而NT-BNP原的浓度为约200pg/ml(Luchner等， Hypertension，2002Jan；39(1)：99-104)。已经确定BNP原合成响应于对心脏 的机械或神经激素刺激而增加，并且这种增加导致血清中BNP和NT-BNP 原的浓度增加。对于患有不同心血管病状(pathology)，如心力衰竭、左心室 功能异常、非稳定性心绞痛和心肌梗塞的患者报道了人血中升高的BNP和 NT-BNP原水平。心力衰竭患者中的两种分析物的血液浓度与疾病的严重性 相关。已经报道在心力衰竭的极早阶段期间(根据New York Heart Association 分类为NYHA I阶段)，在无症状的患者中，两种浓度已经升高。因此，BNP 和NT-BNP原测量作为用于评估疑似患有心力衰竭的患者的方法的基础而受 到关注。心力衰竭的早期诊断对于早期药物干预是重要的，并且可能减少与 这些疾病的晚期相关的发病率和死亡率。

BNP和NT-BNP原测量可用于对患有不同心脏病状的患者进行风险分 级(risk stratification)。经证实患有可能的并发症的患者特征性地展现出显著 高于不患并发症的患者的BNP和NT-BNP原浓度(Luchner等，见上文)。例 如，在患有急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome)的患者中，对两种 肽的测量有助于区分哪些是有风险发展出新的心脏事件的患者。NT-BNP原 测量不仅有助于疾病诊断，还有助于监控施用于患有心力衰竭的患者的治疗 (Troughton等，Lancet，2000Apr 1，355(9210)：1126-30)。

目前两种分析物均在临床实践中使用，并且在目前临床医生之间对于哪 种更优选没有达成共识。NT-BNP原和BNP的浓度之间存在关联，并且显然 诊断和预后值相似。然而，患者血液中的NT-BNP原的浓度是BNP浓度的 2-5倍高。对这个事实的解释是，患者血液中NT-BNP原的半衰期与BNP相 比更长。因此，NT-BNP原免疫测定法显示了较高的敏感性，因为NT-BNP 原测定法的特征在于信号相对于噪声的比例相当高。

对NT-BNP原分子的不同表位为特异性的高亲和力单克隆抗体(参见表 1，列出了来自Hytest Ltd.的合适抗体)是已知的。这些抗体，以及抗BNP抗 体，可用于开发定量三明治NT-BNP原(或BNP，或BNP+BNP原总和)免疫 测定法、在直接ELISA中对抗原进行的免疫检测、和Western印迹。涉及抗 体的特征信息列于下文的表1。对于抗NT-BNP原单克隆抗体(Hytest Ltd.)：

宿主动物：            Balb/c小鼠

用于融合的细胞系：    Sp 2/0

抗原：                对应于NT-BNP原序列的氨基酸残基1-12、

                      13-27、28-45、46-60、61-76的合成肽，与载体

                      蛋白缀合。

特异性：              人NT-BNP原和BNP原

纯化方法：            蛋白A亲和层析

呈递(presentation)：  含0.1％叠氮化钠的PBS中的Mab溶液

在用与载体蛋白缀合的对应于NT-BNP原不同部分(SEQ ID NO：3的氨 基酸残基1-12、13-27、28-45、46-60、61-76)的合成肽免疫Balb/c小鼠之后 生成了产生单克隆抗体的杂交瘤。使用合成肽文库测定全部Mab的精确表 位特异性。检查全部抗体在直接ELISA、三明治免疫测定法和Western印迹 中识别重组NT-BNP原(Hytest Ltd.)的能力。

表1

  Mab   目录号   特异性  亚类   表位   应用   5B6   4NT1   人NT-BNP原，   BNP原  IgG1   氨基酸残基   1-12   EIA、WB   29D12   4NT1   人NT-BNP原，   BNP原  IgG2a   氨基酸残基   5-12   EIA、三明治免   疫测定法、WB   15F11   4NT1   人NTBNP原，   BNP原  IgG2b   氨基酸残基   13-24   EIA、三明治免   疫测定法、WB   7B5   4NT1   人NTBNP原，   BNP原  IgG1   氨基酸残基   13-24   EIA、三明治免   疫测定法、WB   13G12   4NT1   人NT-BNP原，   BNP原  IgG2a   氨基酸残基   13-20   EIA、三明治免   疫测定法、WB   18H5   4NT1   人NT-BNP原，   BNP原  IgG1   氨基酸残基   13-20   EIA、三明治免   疫测定法、WB   16F3   4NT1   人NTBNP原，   BNP原  IgG   氨基酸残基   13-20   EIA、三明治免   疫测定法、WB   11D1   4NT1   人NT-BNP原，   BNP原  IgG1   氨基酸残基   31-39   EIA、WB   16E6   4NT1   人NTBNP原，   BNP原  IgG1   氨基酸残基   34-39   EIA、三明治免   疫测定法、WB   15D7   4NT1   人NTBNP原，   BNP原  IgG1   氨基酸残基   48-56   EIA、WB   15C4   4NT1   人NTBNP原，   BNP原  IgG2b   氨基酸残基   63-71   EIA、三明治免   疫测定法、WB   24E11   4NT1   人NT-BNP原，   BNP原  IgG2a   氨基酸残基   67-76   EIA、三明治免   疫测定法、WB   28F8   4NT1   人NT-BNP原，   BNP原  IgG2a   氨基酸残基   67-76   EIA、三明治免   疫测定法、WB

这些抗体的一些应用在下文描述。

1.直接ELISA

表1的单克隆抗体在直接ELISA中识别重组人NT-BNP原和BNP原 (Hytest Ltd.)，并且将ELISA实验的结果示于图2。图2中显示的数据属于四 种单克隆抗体，其中的每一种均证实了可滴定的结合NT-BNP原的能力。类 似的实验已经显示本文公开的其它抗体与NT-BNP原结合，并且全部这些抗 体还显示可滴定的结合BNP的能力。

2.NT-BNP原定量三明治免疫测定法

在三明治荧光免疫测定法中，使用重组抗原和从患有慢性心力衰竭患者 汇集的血样，作为捕获和检测抗体测试了全部Mab。该实验揭示了免疫测定 法中应用的大多数对NT-BNP原分子中心部分(氨基酸残基28-45和氨基酸 残基46-60)特异性的抗体在对人血中抗原的检测中表现相对较差。因此，对 于人血的精确定量NT-BNP原测量，优选使用利用对氨基酸残基5-12、13-27 和61-76特异性的抗体的双位点抗体组合(图3和图4)。优选的抗体对(捕获- 检测)是：

15F11-24E11

15C4-29D12

15C4-13G12

15C4-18H5

这些优选抗体对中的每一种显示了在抗原识别(10-15pg/ml)中的高敏感 性和良好的动力学。用来自心力衰竭患者的血样测试了所有优选的三明治 Mab组合，并且每种优选的Mab对均能够检测人血中循环的抗原。

已知NT-BNP原是一种不稳定的分子，据报道肽的最N端和最C端区 域稳定性最低(Ala-Kopsala等，Clin.Chem.2004Sep；50(9)：1576-88.)。通过 在两个温度(4℃和20℃)将患者的血样温育不同的时间并在推荐的三明治免 疫测定法中测量抗原的免疫活性来评估内源NT-BNP原的稳定性。使用两对 Mab获得了最高的稳定性：15C4-13G12和15C4-18H5(图5)。在4℃温 育72小时之后观察到的抗原活性的变化不显著(低于10％)，并且在室温温育 样品24小时之后观察到约10-15％的损失。因此，在测定NT-BNP原免疫反 应性水平之前，可以将血清样品通过冷藏(或甚至在室温保存)贮存相对较长 的时间。

3.BNP原定量三明治免疫测定法

BNP前体(BNP原)是一种含有108个氨基酸残基的多肽分子。在患者血 液中能够检测到的BNP原的浓度与循环的BNP和NT-BNP原的浓度相当。 因此BNP原测量在心血管疾病的诊断、预后和治疗监控中可能具有临床价 值。对SEQ ID NO：1(BNP原)的肽5-12和13-27特异性的Mab识别循环的 BNP原并且能够用于与BNP-特异性Mab(例如，Hytest Ltd.目录号4BNP2) 配对来开发定量BNP原测定法。优选的Mab对(捕获-检测)是：

50E1-16F3

50E1-18H5

7B5-2G9

这些抗BNP原单克隆抗体对中的每一种在患者血液中显示了高敏感性、 良好的动力学和对抗原的有效识别(图6)。

4.通过Western印迹进行的NT-BNP原和BNP原免疫检测

如图7中所示，在Western印迹研究中，将抗原转移至硝酸纤维素膜上 之后，上文鉴定的来自Hytest Ltd.的单克隆抗体识别人NT-BNP原和BNP 原。

本文描述的实验中使用的人重组NT-BNP原和BNP原展现以下特性：

纯度：根据SDS-PAGE＞98％

应用：NT-BNP原和BNP原免疫测定法校准物和标准品，

      免疫印迹。

将人重组NT-BNP原(rec NT-BNP原；氨基酸残基1-76；SEQ ID NO：3) 和人重组BNP原(rec proBNP；氨基酸残基1-108；SEQ ID NO：1)在大肠杆菌 中表达。两种多肽都具有除一个氨基酸不同外与天然蛋白质相同的序列，即 在分子的N末端具有额外的Met残基。抗原由对于NT-BNP原的不同部分 有特异性的多克隆和单克隆抗体识别。BNP原还由BNP特异性抗体识别。

rec NT-BNP原和rec BNP原(Hytest Ltd.)均为高度纯化的肽。根据 SDS-PAGE(图8)和HPLC研究纯度大于98％。可以使用所述抗原作为 NT-BNP原和BNP原测定法中的校准物或标准品。在BNP临床免疫测定法 中，将BNP原或其片段优选作为标准品或校准物。在BNP免疫测定法中还 优选作为校准物的是BNP原的修饰形式，如上文所定义的。

尽管在对多种样品中的BNP免疫反应性的测量中可以使用多种BNP免 疫测定法，但是优异的结果获得自使用了稳定的标准品或校准物肽诸如BNP 原的免疫测定法。下文描述的稳定性研究显示，重组BNP原显示了显著高 于合成BNP-32的稳定性。此外，在重组BNP原之中，在真核细胞系中表达 的糖基化形式的BNP原比在细菌细胞中表达的非糖基化的BNP原显著性地 更稳定。

因此，本发明的一个方面涉及在检测样品中BNP免疫反应性的方法中 使用的标准品或校准物制备物，其包含BNP原或其功能性片段或修饰形式。 作为标准品使用的BNP原可以是内源的或重组的BNP原。然而，也可以使 用合成的BNP原，所述合成的BNP原与细菌细胞中产生的非糖基化的重组 蛋白具有相同的生物化学特性。

如上所述，就本发明而言优选的BNP原是糖基化的BNP原，其可以是 在真核细胞系中表达的内源的，或者可替换地，重组的BNP原。

BNP原的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中提供。就本发明而言所述序列 的修饰形式是该序列的功能性类似物，其在BNP原氨基酸序列的N-末端片 段中包含氨基酸变化。

本发明的另一方面是如上所述BNP原在检测样品中BNP免疫反应性的 方法中作为标准品或校准物的用途。本发明的一个相关方面涉及用于生成作 为BNP量的函数的免疫测定法信号标准曲线的方法，所述标准曲线可用于 诊断性免疫测定法。

在另一方面，本发明提供用于测定患者血清样品中的BNP的诊断性免 疫测定法。在这样的方法中，测定样品中的BNP免疫反应性，并且将由此 获得的BNP值与使用本发明的标准品或校准物制备物制成的标准曲线比较。 诊断性免疫测定法是，例如，三明治免疫测定法，其使用第一捕获抗体和第 二检测抗体。

本发明更进一步的方面是用于诊断性测定患者血清样品中的BNP的免 疫测定试剂盒。这样的试剂盒包含BNP特异性的单克隆或多克隆抗体、可 检测的标记和根据本发明的标准品或校准物制备物。

实施例1

稳定性研究.

研究中使用的抗原。

稳定性研究中使用的抗原包括合成的BNP-32(Bachem，Bubendorf， Switzerland，目录号H-9060.0500)、合成的BNP-32(Peptide Institute，Osaka， Japan，目录号4212-v)、重组的BNP原(在大肠杆菌中表达的、非糖基化的， 来自Hytest Ltd.，Turku，Finland，8PRO8)、重组的BNP原(在真核CHO(中国 仓鼠)细胞中表达的，因此，是糖基化的，如本文所述)、和重组的BNP原(在 真核HEK(人)细胞中表达的，并且因此，是糖基化的，如本文所述)。

抗原溶液。通过汇集自健康供体收集的人柠檬酸盐血浆(human citrate plasmas)制备抗原基质。血浆通过静脉穿刺从15位健康的志愿者获得，并将 其与0.11M柠檬酸三钠(sodium citrate tribasic)以4∶1的比例混合。将粗制的 血清：柠檬酸盐在2000rpm离心30分钟。将血浆倾析、汇集并贮藏在-70℃ 直至使用。所述研究中使用的抗原浓度对于在CHO细胞中表达的重组BNP 原为6ng/ml，对于合成的BNP为20ng/ml，对于在大肠杆菌中表达的重组 BNP原为20ng/ml，并且对于在HEK细胞中表达的重组BNP原为20ng/ml。 向血浆添加0.1％叠氮化钠作为防腐剂以防止细菌生长。

在4℃和25℃温育。将人血浆中的抗原溶液在4℃和25℃温育不同 的时间段(多至96小时)。将等分试样冷冻并贮藏在-70℃直至测量BNP免疫 反应性。

测定BNP免疫反应性。样品中的BNP免疫反应性通过三明治免疫荧光 测定法利用两种BNP特异性单克隆抗体(MAb)来测定。第一种BNP特异性 单克隆抗体是包被(coating)单克隆抗体，或MAb，50E1(Hytest Ltd.目录号 4BNP2)，其特异性地识别并结合至BNP序列的肽26-32。第二种BNP特异 性单克隆抗体是检测单克隆抗体，或MAb，24C5(Hytest Ltd.目录号4BNP2)。 同样适合用于这样的测定法的是多种BNP特异性抗体，诸如由Hytest Ltd. 提供的另外的抗体，目录号为4BNP2，即，26E2、2G9、50B7、57H3、41A6、 43B12和16B12，以及多种同种型(isotype)的其它单克隆或多克隆抗体，和 保留了与BNP特异性结合的能力的片段或衍生物。

MAb 24C5特异性地识别并且结合至BNP序列的肽11-22，并且使用常 规技术将其与稳定的Eu³⁺螯合剂缀合。这种测定法不仅能够检测BNP，还能 够检测BNP原。因此，其可以用于对包括BNP和BNP原的全部BNP免疫 反应性进行定量。

稳定性研究的结果示于图9和图10。合成的BNP-32在显现BNP免疫 反应性的全部受试蛋白形式中表现了最差的稳定性。在4℃温育24小时之 后，在样品中观察到最初免疫反应性的3％或更少，而在25℃温育24小时 之后，观察到的低于最初免疫反应性的0.5％。在两个温度下温育96小时之 后，几乎检测不到免疫反应性。

在大肠杆菌中表达的重组非糖基化BNP原展现了居中的稳定性。在4℃ 温育96小时之后仍检测到了最初BNP免疫反应性的超过50％。在25℃， 在大肠杆菌中表达的重组BNP原展现了显著低于在4℃温育之后的稳定性， 即，在25℃温育96小时之后，检测到低于最初BNP免疫反应性的1％。

在CHO或HEK细胞中表达的BNP原的重组糖基化形式展现了最高的稳 定性，其中在HEK细胞中表达的BNP原的稳定性更高。在4℃温育96小时 之后，对于两种蛋白质均观察到了最初免疫反应性的超过90％；在25℃温育 96个小时之后，对于在CHO和HEK细胞系中表达的蛋白质分别观察到了最 初免疫反应性的70％和82％。在两个温度下，在人HEK细胞中表达的抗原的 稳定性在长时间温育过程中高于在CHO细胞中表达的抗原的稳定性。

总而言之，重组BNP原与合成BNP-32分子相比在BNP免疫反应性上 展现了显著增加的稳定性。另外，在真核细胞系中表达的糖基化的重组BNP 原比在大肠杆菌中表达的非糖基化的BNP原显著性地更稳定。

本文公开的数据，以及附加的内容，确定了脑钠肽的BNP原形式，以 及BNP原片段和BNP原修饰形式的免疫测定法，以一种导致测定结果的准 确度和再现性得到改进的方式，为使这样的测定法标准化的方法和制备物提 供了材料。这些改进，进而导致更加准确和可靠的对心血管疾病如充血性心 力衰竭的诊断。此外，改进的测定法可用于预后应用和对患者治疗的监控， 所述患者显示或有风险显示心血管疾病或其特征性症状。

尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应该理解的 是，能够进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖本发明的任何变形、用途 或修改，这些变形、用途或修改大体上遵循本发明的原理，并且其中所包括 的与本文内容的偏离在本发明所属领域内已知的或惯用的实践方式的范围 内，并且可以适用于本文所述的特征。

序列表

<110>西特斯特有限公司(Hytest Ltd.)

<120>用于BNP免疫测定法的稳定标准品

<130>45868

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>BNP原

<400>1

His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly

1               5                   10                  15

Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln

            20                  25                  30

Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr

        35                  40                  45

Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His

    50                  55                  60

Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met

65                  70                  75                  80

Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser

                85                  90                  95

Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His

            100                 105

<210>2

<211>134

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>前BNP原

<400>2

Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe

1               5                   10                  15

Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro

            20                  25                  30

Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn

        35                  40                  45

His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu

    50                  55                  60

Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg

65                  70                  75                  80

Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr

                85                  90                  95

Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys

            100                 105                 110

Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys

        115                 120                 125

Lys Val Leu Arg Arg Hi s

    130

<210>3

<211>76

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>NT-BNP原

<400>3

His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly

1               5                   10                  15

Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln

            20                  25                  30

Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr

        35                  40                  45

Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His

    50                  55                  60

Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg

65                  70                  75

<210>4

<211>32

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>BNP

<400>4

Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp

1               5                   10                  15

Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His

            20                  25                  30