一种西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法

摘要

一种西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法，它涉及一种体细胞胚诱导植株再生的方法。本发明解决了现有西兰花通过器官发生进行离体再生的方法存在的诱导分化时间长、繁殖率低以及不同品种间分化率差异大的问题。方法：1.西兰花种子消毒；2.西兰花种子培养得到幼苗；3.将外植体切成小段，然后诱导培养，得到成熟体细胞胚；4.将成熟体细胞胚接种到1/2MS固体培养基或者再生培养基中培养，即完成了西兰花体细胞胚诱导植株再生。本发明的方法诱导分化时间短、诱导率高、不同品种间分化率差异小。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体细胞胚诱导植株再生的方法。

背景技术

西兰花(Brassica oleracea L.var.italica Planch)又名青花菜、绿菜花、茎椰菜、木立花椰菜、意大利芥蓝等，是一、二年生草本植物，营养价值较高，含有丰富的维生素A和维生素C，以及含量可观的维生素B₁、B₂、B₅、钙和铁等物质，并含抗癌物质，受到消费者的青睐。青花菜栽培历史较短，但发展很快，在我国已成为一些地区出口创汇的重要优质蔬菜种类之一。同时，美国、日本等国家育成的杂种一代品种在国内外市场上畅销，我国也育出一批品种。

西兰花的组织培养自20世纪70年代以来相继有所报道，研究的最初目的是实现离体快繁，借以扩大稀缺种质资源的数量，满足育种和生产上的需要。随着青花菜育种工作的深入，品种虽然增多，但是限于优良基因资源的缺乏，在抗虫、延熟保鲜、抗某些病害等特性品种的选育上，常规育种较难开展。基因工程的发展为转入外源有益基因以创新种质提供了捷径，西兰花的遗传转经研究已有一些报道，但转化率普遍较低。建立植物成熟高效的再生体系是遗传转化中重要的1个环节，一方面有利于转化细胞的分化再生；另一方面可以保障获得尽可能多的可供筛选的再生植株，从中得到外源基因表达正常的转基因植株。

体胚发生途径和器官发生途径是进行无性繁殖的很重要的途径，同时也是进行转基因研究的前提。目前，已经利用西兰花的各种外植体通过器官发生途径进行了体外的增殖，但目前西兰花通过器官发生的离体再生方式普遍存在诱导分化时间长、繁殖率低和不同品种间分化率差异大的问题，如Qin Ying等的研究表明，外植体培养4～5周以后才开始形成不定芽，每个外植体产生的不定芽数仅能达到1.6～4.1，研究的4种西兰花基因型的体细胞胚诱导率差异大，最低为74.4％，最高为92.5％。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有西兰花通过器官发生进行离体再生方法存在的诱导分化时间长、繁殖率低以及不同品种间分化率差异大的问题，而提供了一种西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法。

本发明西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法通过以下步骤进行的：一、先用质量浓度为65％～75％的酒精对西兰花种子消毒50～70s，再用质量浓度为0.8％～1.2％的次氯酸溶液消毒10～16min，然后用无菌水冲洗3～5次；二、将消毒后的西兰花种子接种于萌发培养基中培养6～8天，培养温度为20～25℃，即得到西兰花幼苗；三、用刀将西兰花幼苗中的子叶、下胚轴或根切成0.5～10mm的小段后接种到固体诱导培养基或液体诱导培养基中培养，培养温度为20～25℃，在无光照条件下培养7～10天得到球形胚，然后将球形胚从母体上分离出来再接种到液体诱导培养基中，在温度为20～25℃的条件下培养14～20天得到成熟体细胞胚；四、将成熟体细胞胚接种到1/2MS固体培养基或者再生培养基中培养，培养温度为20～25℃，培养时间为28～30天，即完成了西兰花体细胞胚诱导植株再生；其中，步骤二中的萌发培养基是以MS培养基为基本培养基，且每1L的萌发培养基中还包含18～22g的蔗糖和7～9g的琼脂，pH值为5.6～6.0；步骤三中的固体诱导培养基是MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基还包含0.2～1.2mg的2，4-二氯苯氧乙酸、18～22mg的蔗糖和7～9g的琼脂，pH值为5.6～6.0；步骤三中的液体诱导培养基均是以MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基还包含0.2～1.2mg的2，4-二氯苯氧乙酸和18～22mg的蔗糖，pH值为5.6～6.0；步骤四中的再生培养基是以1/2MS固体培养基为基本培养基的改良培养基，且每1L的改良培养基中还包含0.8～1.2mg的苄基氨基嘌呤或0.8～1.2mg的赤霉素，pH值为5.6～6.0。

本发明利用西兰花幼苗中的子叶、下胚轴和根作为外植体诱导体细胞胚，获得西兰花的再生植株，本发明的方法中外植体培养1～3周以后便开始形成不定芽，每个外植体产生的不定芽数为5～27，本发明用Fantasy、青藏77、绿辉、海兹、曼陀绿、绿星这6种不同品种的西兰花进行培养得到幼苗，然后用这6种不同品种的西兰花幼苗的子叶、下胚轴和根为外植体分别进行体细胞胚诱导植株再生，其中采用这六种不同品种的西兰花幼苗的子叶为外植体进行体细胞胚诱导植株再生时成熟体细胞胚诱导率最低49％，最高为54％，采用这六种不同品种的西兰花幼苗的下胚轴为外植体进行体细胞胚诱导植株再生时成熟体细胞胚诱导率最低78％，最高为82％，采用这六种不同品种的西兰花幼苗的根为外植体进行体细胞胚诱导植株再生时成熟体细胞胚诱导率均为100％。本发明的方法诱导分化时间短、繁殖率高、不同品种间分化率差异小，且本发明的方法成活率高，经本发明方法培养得到的植株再生率为16％～75％。

附图说明

图1为具体实施方式十八步骤三中在无光照条件下培养时间为8天得到球形胚的照片；图2为具体实施方式十八步骤三中培养得到的成熟的体细胞胚的照片；图3为具体实施方式十八得到的再生植株的照片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法通过以下步骤进行的：一、先用质量浓度为65％～75％的酒精对西兰花种子消毒50～70s，再用质量浓度为0.8％～1.2％的次氯酸溶液消毒10～16min，然后用无菌水冲洗3～5次；二、将消毒后的西兰花种子接种于萌发培养基中培养6～8天，培养温度为20～25℃，即得到西兰花幼苗；三、用刀将西兰花幼苗中的子叶、下胚轴或根切成0.5～10mm的小段后接种到固体诱导培养基或液体诱导培养基中培养，培养温度为20～25℃，在无光照条件下培养7～10天得到球形胚，然后将球形胚从母体上分离出来再接种到液体诱导培养基中，在温度为20～25℃的条件下培养14～20天得到成熟体细胞胚；四、将成熟体细胞胚接种到1/2MS固体培养基或者再生培养基中培养，培养温度为20～25℃，培养时间为28～30天，即完成了西兰花体细胞胚诱导植株再生；其中，步骤二中的萌发培养基是以MS培养基为基本培养基，且每1L的萌发培养基中还包含18～22g的蔗糖和7～9g的琼脂，pH值为5.6～6.0；步骤三中的固体诱导培养基是MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基还包含0.2～1.2mg的2，4-二氯苯氧乙酸、18～22mg的蔗糖和7～9g的琼脂，pH值为5.6～6.0；步骤三中的液体诱导培养基均是以MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基还包含0.2～1.2mg的2，4-二氯苯氧乙酸和18～22mg的蔗糖，pH值为5.6～6.0；步骤四中的再生培养基是以1/2MS固体培养基为基本培养基的改良培养基，且每1L的改良培养基中还包含0.8～1.2mg的苄基氨基嘌呤或0.8～1.2mg的赤霉素，pH值为5.6～6.0。

本实施方式中所述的MS培养基由浓度为1900mg·L^-1的KNO₃、浓度为1650mg·L^-1的NH₄NO₃、浓度为170mg·L^-1的KH₂PO₄、浓度为370mg·L^-1MgSO₄·7H₂O、浓度为440mg·L^-1的CaCl₂·2H₂O、浓度为0.83mg·L^-1的KI、6.2mg·L^-1的H₃BO₃、浓度为22.3mg·L^-1的MnSO₄·4H₂O、浓度为8.6mg·L^-1的ZnSO₄·7H₂O、浓度为0.25mg·L^-1的Na₂MoO₄·2H₂O、浓度为0.025mg·L^-1的CuSO₄·5H₂O、浓度为0.025mg·L^-1的CoCl₂、浓度为37.3mg·L^-1的Na₂·EDTA、浓度为27.8mg·L^-1的FeSO₄·7H₂O、浓度为100mg·L^-1的肌醇、浓度为2mg·L^-1的甘氨酸、浓度为0.1mg·L^-1的VB₁、浓度为0.5mg·L^-1的盐酸吡哆醇、浓度为0.5mg·L^-1的烟酸和浓度为0.5mg·L^-1的VPP组成。

本实施方式培养得到的植株再生率为16％～75％。

本实施方式中利用子叶、下胚轴和根作为外植体，本实施方式的方法中外植体培养1～3周以后便开始形成不定芽，每个外植体产生的不定芽数为5～27。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中先用质量浓度为70％的酒精对西兰花种子消毒60s，再用质量浓度为1％的次氯酸溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3次。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二中将消毒后的西兰花种子接种于萌发培养基中培养7天，培养温度为23℃。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的子叶、下胚轴或根切成8mm的小段。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一、二或四不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的子叶、下胚轴或根切成小段接种到固体诱导培养基或液体诱导培养基中培养，培养温度为23℃，在无光照条件下培养时间为8天得到球形胚。其它步骤及参数与具体实施方式一、二或四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是步骤三中将球形胚从母体上分离出来再接种到液体诱导培养基中，在温度为23℃的条件下培养得到成熟体细胞胚。其它步骤及参数与具体实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一、二、四或六不同的是步骤四中培养温度为23℃，培养时间为29天。其它步骤及参数与具体实施方式一、二、四或六相同。

具体实施方式八：本实施方式本实施方式西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法通过以下步骤进行的：一、先用质量浓度为70％的酒精对西兰花种子消毒60s，再用质量浓度为1％的次氯酸溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3次；二、将消毒后的西兰花种子接种于萌发培养基中培养7天，培养温度为23℃，即得到西兰花幼苗；三、用刀将西兰花幼苗中的子叶、下胚轴或根切成8mm的小段后接种到固体诱导培养基或液体诱导培养基中培养，培养温度为23℃，在无光照条件下培养时间为8天得到球形胚，然后将球形胚从母体上分离出来再接种到液体诱导培养基中，在温度为23℃的条件下培养14～20天得到成熟体细胞胚；四、将成熟体细胞胚接种到1/2MS固体培养基或者再生培养基中培养，培养温度为23℃，培养时间为29天，即完成了西兰花体细胞胚诱导植株再生；其中，步骤二中的萌发培养基是以MS培养基为基本培养基，且每1L的萌发培养基中还包含20g的蔗糖和8g的琼脂，pH值为5.8；步骤三中的固体诱导培养基是MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基还包含1mg的2，4-二氯苯氧乙酸、20mg的蔗糖和8g的琼脂，pH值为5.8；步骤三中的液体诱导培养基均是以MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基还包含1mg的2，4-二氯苯氧乙酸和20mg的蔗糖，pH值为5.8；步骤四中的再生培养基是以1/2MS固体培养基为基本培养基的改良培养基，且每1L的改良培养基中还包含1mg的苄基氨基嘌呤或1mg的赤霉素，pH值为5.8。

本实施方式中所述的MS培养基由浓度为1900mg·L^-1的KNO₃、浓度为1650mg·L^-1的NH₄NO₃、浓度为170mg·L^-1的KH₂PO₄、浓度为370mg·L^-1MgSO₄·7H₂O、浓度为440mg·L^-1的CaCl₂·2H₂O、浓度为0.83mg·L^-1的KI、6.2mg·L^-1的H₃BO₃、浓度为22.3mg·L^-1的MnSO₄·4H₂O、浓度为8.6mg·L^-1的ZnSO₄·7H₂O、浓度为0.25mg·L^-1的Na₂MoO₄·2H₂O、浓度为0.025mg·L^-1的CuSO₄·5H₂O、浓度为0.025mg·L^-1的CoCl₂、浓度为37.3mg·L^-1的Na₂·EDTA、浓度为27.8mg·L^-1的FeSO₄·7H₂O、浓度为100mg·L^-1的肌醇、浓度为2mg·L^-1的甘氨酸、浓度为0.1mg·L^-1的VB₁、浓度为0.5mg·L^-1的盐酸吡哆醇、浓度为0.5mg·L^-1的烟酸和浓度为0.5mg·L^-1的VPP组成。

本实施方式培养得到的植株再生率为20％～68％。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的子叶切成小段后接种到固体诱导培养基中培养。其它步骤及参数具体实施方式八相同。

本实施方式成熟体细胞胚诱导率为50％，不定芽数为5.1，其中不定芽数是指每个外植体上生长的成熟体细胞胚数。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的下胚轴切成小段后接种到固体诱导培养基中培养。其它步骤及参数具体实施方式八相同。

本实施方式成熟体细胞胚诱导率为80％，不定芽数为7.9，其中不定芽数是指每个外植体上生长的成熟体细胞胚数。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的根切成小段后接种到固体诱导培养基中培养。其它步骤及参数具体实施方式八相同。

本实施方式成熟体细胞胚诱导率为100％，不定芽数为5.4，其中不定芽数是指每个外植体上生长的成熟体细胞胚数。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的子叶切成小段后接种到液体诱导培养基中培养。其它步骤及参数具体实施方式八相同。

本实施方式方法中采用六种不同的西兰花种子进行诱导再生，这六种不同的西兰花的品种名称分别为Fantasy、青藏77、绿辉、海兹、曼陀绿、绿星，六种不同的西兰花种子进行诱导再生的结果如表1所示。

表1

 品种  成熟体细胞胚诱导率/％  不定芽数 Fantasy  49  5.1 青藏77  50  5.7 绿辉  52  5.6 海兹  54  5.9 曼陀绿  53  6 绿星  54  4.7

注：表中不定芽数为每个外植体上生长的成熟体细胞胚数。

从表1的数据可以看出，六种西兰花品种利用子叶作为外植体在液体诱导培养基中培养，成熟体细胞胚诱导率最低为49％，最高为54％，且不定芽数相差不大，说明西兰花品种对体细胞的诱导影响不大，也就是说这种再生体系的建立对于几种不同类型的西兰花都是适用的。本发明的方法不同品种间分化率差异小。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的下胚轴切成小段后接种到液体诱导培养基中培养。其它步骤及参数具体实施方式八相同。

本实施方式方法中采用六种不同的西兰花种子进行诱导再生，这六种不同的西兰花的品种名称分别为Fantasy、青藏77、绿辉、海兹、曼陀绿、绿星，六种不同的西兰花种子进行诱导再生的结果如表2所示。

表2

 品种  成熟体细胞胚诱导率/％  不定芽数 Fantasy  78  23.8 青藏77  79  25.1 绿辉  81  22.9 海兹  80  26.0 曼陀绿  82  24.6 绿星  80  24.1

注：表中不定芽数为每个外植体上生长的成熟体细胞胚数。

从表2的数据可以看出，六种西兰花品种的利用下胚轴作为外植体在液体诱导培养基中培养，成熟体细胞胚诱导率最低为78％，最高为82％，且不定芽数相差不大，说明西兰花品种对体细胞的诱导影响不大，也就是说这种再生体系的建立对于几种不同类型的西兰花都是适用的。本发明的方法不同品种间分化率差异小。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤三中用刀将西兰花幼苗中的根切成小段后接种到液体诱导培养基中培养。其它步骤及参数具体实施方式八相同。

本实施方式方法中采用六种不同的西兰花种子进行诱导再生，这六种不同的西兰花的品种名称分别为Fantasy、青藏77、绿辉、海兹、曼陀绿、绿星，六种不同的西兰花种子进行诱导再生的结果如表3所示。

表3

 品种  成熟体细胞胚诱导率/％  不定芽数 Fantasy  100  23.8 青藏77  100  25.1 绿辉  100  22.9 海兹  100  26.0 曼陀绿  100  24.6 绿星  100  24.1

注：表中不定芽数为每个外植体上生长的成熟体细胞胚数。

从表3的数据可以看出，六种西兰花品种的利用根作为外植体在液体诱导培养基中培养，体细胞诱导率均为100％，且每个外植体上的体胚数目相差不大，说明西兰花品种对体细胞的诱导影响不大，也就是说这种再生体系的建立对于几种不同类型的西兰花都是适用的。本发明的方法不同品种间分化率差异小。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十四不同的是步骤四中将成熟体细胞胚接种到1/2MS固体培养基培养。其它步骤及参数与具体实施方式十四相同。

本实施方式方法中采用Fantasy、青藏77、绿辉、海兹、曼陀绿、绿星六种不同的西兰花种子进行诱导再生培养，采用Fantasy西兰花种子培养得到的植株再生率为16.7％，采用青藏77西兰花种子培养得到的植株再生率为18.6％，采用绿辉西兰花种子培养得到的植株再生率为19.6％，采用海兹西兰花种子培养得到的植株再生率为21.6％，采用曼陀绿西兰花种子培养得到的植株再生率为20.3％，采用绿星西兰花种子培养得到的植株再生率为19.1％。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十四不同的是步骤四中将成熟体细胞胚接种到再生培养基培养，再生培养基是以1/2MS固体培养基为基本培养基的改良培养基，且每1L的改良培养基中还包含1mg的赤霉素，pH值为5.8。其它步骤及参数与具体实施方式十四相同。

本实施方式方法中采用Fantasy、青藏77、绿辉、海兹、曼陀绿、绿星六种不同的西兰花种子进行诱导再生培养，采用Fantasy西兰花种子培养得到的植株再生率为46.7％，采用青藏77西兰花种子培养得到的植株再生率为47.2％，采用绿辉西兰花种子培养得到的植株再生率为45.7％，采用海兹西兰花种子培养得到的植株再生率为49.3％，采用曼陀绿西兰花种子培养得到的植株再生率为48.5％，采用绿星西兰花种子培养得到的植株再生率为44.9％。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十四不同的是步骤四中将成熟体细胞胚接种到再生培养基培养，再生培养基是以1/2MS固体培养基为基本培养基的改良培养基，且每1L的改良培养基中还包含1mg的苄基氨基嘌呤，pH值为5.8。其它步骤及参数与具体实施方式十四相同。

本实施方式方法中采用Fantasy、青藏77、绿辉、海兹、曼陀绿、绿星六种不同的西兰花种子进行诱导再生培养，采用Fantasy西兰花种子培养得到的植株再生率为73.3％，采用青藏77西兰花种子培养得到的植株再生率为72.6％，采用绿辉西兰花种子培养得到的植株再生率为74.5％，采用海兹西兰花种子培养得到的植株再生率为70.2％，采用曼陀绿西兰花种子培养得到的植株再生率为71.6％，采用绿星西兰花种子培养得到的植株再生率为74.1％。

具体实施方式十八：本实施方式本实施方式本实施方式西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法通过以下步骤进行的：一、先用质量浓度为70％的酒精对西兰花种子消毒60s，再用质量浓度为1％的次氯酸溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3次；二、将消毒后的西兰花种子接种于萌发培养基中培养7天，培养温度为22℃，即得到西兰花幼苗；三、用刀将西兰花幼苗的根切成0.5mm的小段后接种到液体诱导培养基中培养，培养温度为22℃，在无光照条件下培养时间为8天得到球形胚，然后将球形胚从母体上分离出来再接种到液体诱导培养基中，在温度为22℃的条件下培养18天得到成熟体细胞胚；四、将成熟体细胞胚接种到再生培养基中培养，培养温度为22℃，培养时间为28天，即完成了西兰花体细胞胚诱导植株再生；其中，步骤二中的萌发培养基是以MS培养基为基本培养基，且每1L的萌发培养基中还包含20g的蔗糖和8g的琼脂，pH值为5.8；步骤三中的液体诱导培养基均是以MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基还包含1mg的2，4-二氯苯氧乙酸和20mg的蔗糖，pH值为5.8；步骤四中的再生培养基是以1/2MS固体培养基为基本培养基的改良培养基，且每1L的改良培养基中还包含1mg的苄基氨基嘌呤，pH值为5.8。

本实施方式中所述的MS培养基由浓度为1900mg·L^-1的KNO₃、浓度为1650mg·L^-1的NH₄NO₃、浓度为170mg·L^-1的KH₂PO₄、浓度为370mg·L^-1MgSO₄·7H₂O、浓度为440mg·L^-1的CaCl₂·2H₂O、浓度为0.83mg·L^-1的KI、6.2mg·L^-1的H₃BO₃、浓度为22.3mg·L^-1的MnSO₄·4H₂O、浓度为8.6mg·L^-1的ZnSO₄·7H₂O、浓度为0.25mg·L^-1的Na₂MoO₄·2H₂O、浓度为0.025mg·L^-1的CuSO₄·5H₂O、浓度为0.025mg·L^-1的CoCl₂、浓度为37.3mg·L^-1的Na₂·EDTA、浓度为27.8mg·L^-1的FeSO₄·7H₂O、浓度为100mg·L^-1的肌醇、浓度为2mg·L^-1的甘氨酸、浓度为0.1mg·L^-1的VB₁、浓度为0.5mg·L^-1的盐酸吡哆醇、浓度为0.5mg·L^-1的烟酸和浓度为0.5mg·L^-1的VPP组成。

本实施方式所用的西兰花品种名称为绿辉。

本实施方式的体细胞胚诱导率为100％，不定芽数为22.8，其中不定芽数为每个外植体上生长的成熟体细胞胚数。

本实施方式培养得到的植株再生率为71.6％。

本实施方式步骤三中在无光照条件下培养时间为8天得到球形胚如图1所示；图2本实施方式步骤三中培养得到的成熟体细胞胚如图2所示；本实施方式得到的再生植株如图3所示。从图中可以看出采用本实施方式的西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法成功的得到了西兰花的植株。本发明方法首次利用了西兰花幼苗中的子叶、下胚轴和根作为外植体诱导体细胞胚，获得西兰花的再生植株，缩短该树种的育种周期，使一些优质的种质资源得到快速而广泛的应用，使丰富的种质资源得到保护，还可为该物种的基因工程改良工作奠定基础，从而培育出速生、丰产、优质、抗逆的西兰花新品种。