轮状病毒基因重配毒株及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一株轮状病毒基因重配毒株及其构建方法和应用，属于轮状病毒的诊断和防制领域。本发明轮状病毒基因重配毒株以羊轮状病毒弱毒株的VP1、VP2、VP3、VP4、NSP1、VP6、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5基因为该重配毒株的基因骨架并重配了牛轮状病毒株的VP7基因节段，其微生物保藏号是：CGMCC No.3102。本发明重配毒株R191与LLR－85毒株联合应用可构成能够涵盖牛轮状病毒主要血清型G6和G10型的二价减毒活疫苗。在新生犊牛体内对两株疫苗候选毒株进行了免疫原性和病毒释放的评价，结果显示，疫苗候选毒株在新生犊牛体内具有良好的免疫原性和很低的病毒释放率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒毒株，尤其涉及一种轮状病毒基因重配毒株及其构建方法，本发明还涉及轮状病毒基因重配毒株在牛腹泻诊断和防治中的应用，属于轮状病毒的诊断和防治领域。

背景技术

在我国乃至世界范围内，牛轮状病毒均是引起犊牛腹泻的主要致病因素，而且G6和G10型轮状病毒均是牛轮状病毒流行的主要血清型。在美国，应用基因重配方法构建轮状病毒多价基因重配减毒疫苗已经在人轮状病毒感染的预防中取得成功。

鉴于G6和G10型轮状病毒是牛轮状病毒的主要流行血清型，并且轮状病毒基因重配减毒疫苗的研究在人轮状病毒疫苗的研究上已经取得成功，本发明构建了以羔羊轮状病毒LLR-85毒株为基因背景重配了牛轮状病毒NCDV株VP7基因的重配毒株，并且已经从分子水平和生物学水平两方面鉴定表明其能够稳定传代。

发明内容

本发明目的之一是提供一株轮状病毒基因重配毒株；

本发明目的之二是提供一种构建上述轮状病毒基因重配毒株的方法；

本发明目的之三是将所述轮状病毒基因重配毒株应用于牛轮状病毒的诊断和防制；

本发明的上述目的是通过以下方案来实现的：

一株轮状病毒基因重配毒株(代号为R191)，该重配毒株以羊轮状病毒LLR-85毒株的VP1、VP2、VP3、VP4、NSP1、VP6、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5基因为基因骨架重配了牛轮状病毒NCDV株的VP7基因节段；

本发明重配毒株微生物保藏号是：CGMCC No.3102；分类命名：轮状病毒；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2009年5月18日；

此外，本发明还提供了一株羊轮状病毒弱毒株(代号为：LLR-85)，该弱毒株通过将市售单价人轮状病毒疫苗进行增殖而获得，该羊轮状病毒弱毒株适应了MA104细胞，接种试验表明对新生犊牛无致病性，其微生物保藏号是：CGMCC No.3101；分类命名：轮状病毒；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2009年5月18日。

一种构建上述轮状病毒基因重配毒株R191的方法，包括：将MA104细胞在细胞培养板上培养形成致密单层；用牛轮状病毒NCDV毒株和羊轮状病毒弱毒株LLR-85毒株同时共感染单层MA104细胞，收获病毒培养物，反复冻融；用蚀斑法挑选混合的子代病毒，挑选的单克隆蚀斑病毒进行小量扩大培养，鉴定，即得。

本发明以羊轮状病毒LLR-85弱毒株和牛轮状病毒NCDV毒株为亲本病毒，构建了一株以LLR-85为基因背景重配了NCDV株VP7基因的重配毒株R191。经RNA PAGE电泳以及RT-PCR序列分析进行鉴定，证明R191的基因组组成为VP7基因节段来源于NCDV株，而其余的10个基因节段均来源于LLR-85毒株。所以本发明重配毒株R191的G血清型为G6型。而LLR-85毒株的G血清型为G10型，因此本发明重配毒株R191与羊轮状病毒LLR-85毒株联合应用可构成能够涵盖牛轮状病毒主要血清型G6和G10型的二价减毒活疫苗。两株疫苗候选毒株已经在新生犊牛体内进行了免疫原性和病毒释放的评价，结果显示，该疫苗候选毒株在新生犊牛体内具有良好的免疫原性和较低的病毒释放率。涵盖牛轮状病毒主要血清型的二价减毒活疫苗候选毒株的成功研制和应用，能够降低牛腹泻疾病的发生率，从而减少养牛业因牛腹泻疾病引起的巨大经济损失。应用该研究平台可将其他动物血清型(G5、G8等)轮状病毒的VP7基因重配到亲本毒株LLR-85毒株的基因组中，从而构建牛轮状病毒多价减毒疫苗毒株，以实现对牛轮状病毒腹泻疾病的全面预防。

附图说明

图1轮状病毒基因组RNA电泳图谱；1：牛轮状病毒NCDV株；2：NCDV与LLR-85重配毒株R191；3：羊轮状病毒弱毒株LLR-85株。

图2重配毒株R191和亲本病毒的一步生长曲线。

图3接种犊牛血清抗轮状病毒IgG(A)和IgA(B)抗体动态变化；第一组犊牛口服接种重配毒株R191，第二组犊牛口服接种亲本毒株LLR-85，第三组犊牛口服接种重配毒株R191和亲本毒株LLR-85。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例轮状病毒基因重配毒株R191的构建、鉴定及免疫原性试验一、试验材料和试验方法

1.细胞、病毒株和实验动物

MA104细胞由本实验室保存。牛轮状病毒弱毒株NCDV株(G6P[1])，该毒株是1971年分离于美国内布拉斯加州某牛场的新生犊牛腹泻粪便样品，购自中国兽医药品监察所。羊轮状病毒弱毒株LLR-85株(G10P[12])，该毒株是1985年分离于兰州一腹泻羔羊体内，本发明中所用到的羊轮状病毒弱毒株LLR-85毒株是通过从市售单价人轮状病毒疫苗(LLR，兰州生物制品研究所)中增殖而获得，适应了MA104细胞，对新生犊牛无致病性，其微生物保藏号是：CGMCC No.3101；。这两株病毒均在MA104细胞上连续适应传代10次，并进行三次蚀斑纯化。血清中不含有轮状病毒抗体的11头不吃初乳的新生犊牛分成3组，在出生后24h之内接种疫苗候选毒株。每一组犊牛都饲养在独立的饲舍内，饲喂不含有轮状病毒抗体的代乳粉。

2.试验材料

DMEM培养基购自GIBCO公司；DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)为上海华舜生物技术有限公司产品；Simply P总RNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)；Ex Taq DNA聚合酶、反转录酶(AMV)均购自宝生物工程(大连)有限公司；6孔、12孔、24孔、96孔细胞培养板购自加拿大JET Biochemical公司；优级胎牛血清(PAA)购自GIBCO公司；低熔点琼脂糖购自Solarbio公司；实验中所用其它化学试剂均为分析纯级别。

3.主要仪器设备

各种规格移液器、紫外分光光度计及5415R、5810R高速台式低温离心机(德国eppendorf公司)；MCO-15AC二氧化碳培养箱、MDF-U32V超低温冰箱(日本SANYO公司)；IX51荧光倒置显微镜(OLYMPUS公司)；生物二级安全柜(美国LABCONCO公司)；DK-8D电热恒温水槽(上海精宏)；空气浴恒温摇床(KYC 100B，上海福玛实验设备有限公司)；旋涡混合器(QL-901，江苏海门麒麟医用仪器厂)；PCR仪(MyCycler^TM型，美国Bio-Rad公司)；Zenyth 3100多功能酶标仪；DYCZ-21型垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；EPS 300电泳仪、GIS-2020全自动凝胶成像系统(上海天能)；YDS60/210液氮罐(新乡豫新航空低温容器)；ASTACUS小型超纯水仪(德国MEMBRAPURE公司)。

4.RT-PCR及序列分析

(1)引物设计：用于扩增轮状病毒部分基因节段的RT-PCR引物参考Gouvea etal.，1994以及Park et al.，2006的研究设计，引物序列在表1中列出，均由上海生物工程公司合成。

(2)RNA的提取：应用杭州博日科技有限公司Simply P总RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，操作按说明书进行，具体步骤如下：

1)直接取病毒的细胞培养上清100μl，加入Solution R2 600μl，充分颠倒混匀，室温静置3-5min；

2)将上清吸入Spin column，Spin column要套上离心管，离心30S；

3)弃去外套管中的液体，向Spin column中加入600μl Wash Buffer，离心30S，重复洗涤一次，最后离心2min；

4)将Spin column移入新的1.5ml离心管中，将Spin column的盖子打开在通风的超净工作台中风干2min，在膜中央加入20-50μl DEPC处理水，室温静置1min，离心30S，获得总RNA。

(3)RT-PCR：首先是以提取的总RNA为模板进行的反转录(RT)反应，反应体系如下(25μl)：

DEPC水                      3μl

5×AMV Buffer               5μl

dNTPs(2.5mM)                5μl

特异性下游引物(10pM/μl)    2.5μl

AMV反转录酶                 0.25μl

RNA模板                     10μl

反应条件为：25℃10min，42℃1h。

其次是以反转录的cDNA为模板进行PCR反应，反应体系如下(25μl)：

DEPC水                   16μl

Ex-Taq Buffer            2.5μl

dNTPs(2.5mM)             2μl

上、下游引物(10pM/μl)各 1.5μl

Ex-Taq DNA聚合酶         0.25μl

cDNA模板                 2.5μl

反应条件为：94℃预变性4min，94℃45S，50℃45S，72℃1min 30个循环，最后72℃延伸10min。

(4)核苷酸及氨基酸序列分析：PCR扩增产物用上海华舜生物工程公司生产的凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化产物直接送上海生物工程公司进行测序，或者经过克隆以后进行测序。将测序结果与GenBank收录的不同种属轮状病毒的代表毒株的对应基因节段进行比较。用Lasergene 7.2版本软件分析核苷酸和氨基酸的同源性及进化关系。

表1  轮状病毒部分基因节段序列分析用引物

5.病毒培养

将在-70℃冰箱保存的病毒液用一定浓度的胰酶(50μg/ml)于37℃预处理1h，然后进行一定比例的稀释。将已长成致密单层的MA104细胞用PBS缓冲液轻洗3遍，而后将处理好的病毒液接种到单层细胞上，于37℃吸附1h。弃掉吸附液，用PBS缓冲液轻洗1遍，加入含有5μg/ml胰酶的无血清DMEM，37℃5％CO₂培养箱培养。逐日观察细胞病变，待细胞病变达75％～80％时收获病毒，反复冻融3次，分装成1ml小管于-70℃冰箱保存备用。

6.病毒RNA PAGE电泳

(1)RNA抽提缓冲液的配制：

Tris-Cl(pH7.4)  0.02M(Tris base配制后用HCl调pH7.4，再加其他)

NaCl            0.3M

MgCl2           0.01M

SDS             0.1％

EDTA            0.005M

溴酚蓝          0.04％

蔗糖            4％

首先称量合适配制量的Tris base于纯水中充分溶解，而后用HCl调节pH值为7.4。然后再依次加入以上所列试剂，充分搅拌混匀，使其充分溶解，室温保存备用。

(2)RNA的提取：

1)100μl RNA抽提缓冲液加等体积液体性样品，颠倒混匀，室温静置10min；

2)加1/5RNA抽提缓冲液体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，漩涡震荡器混匀30S，室温静置10min；

3)4℃12000rpm离心10min，深蓝色上清即为电泳样品。

(3)电泳及染色：

取上一步处理样品的深蓝色上清20-30ul直接上样，室温下电泳1h，然后转至4℃冰箱内进行电泳，恒流10mA/胶板，电泳16h。电泳结束后，将胶卸下用含10％乙醇和0.5％乙酸的固定液固定30min，摇床室温缓慢振摇；之后用蒸馏水冲洗三遍，再加入含0.2％的硝酸银溶液染色30min，摇床室温缓慢振摇；用蒸馏水冲洗三遍，再加入提前4℃预冷的含1％甲醛溶液、0.04％碳酸氢钠和2％氢氧化钠的显色液显色约10min，直至条带清晰弃掉显色液，用水冲洗2-3遍。

7.轮状病毒重配株的构建

(1)病毒蚀斑形成单位的测定：MA104细胞接种于六孔细胞培养板，待两天后长成致密单层待用。预先计算好试验所需病毒的总量，用一定浓度的胰酶(50μg/ml)于37℃处理1h，然后用无血清DMEM将要接种的病毒进行连续10倍稀释。将长成致密单层的MA104细胞用PBS缓冲液轻洗三遍。将稀释好的稀释样本接种到MA104细胞单层，于37℃吸附1h。倾弃吸附液体，用PBS缓冲液轻洗一遍，每孔加入2ml营养琼脂(营养琼脂为含1％低熔点琼脂糖、5μg/ml胰酶的无血清DMEM)，室温静置约10min待琼脂凝固以后倒置放在5％CO₂培养箱中培养3-5天，待最高稀释倍数的培养孔维持2天蚀斑数不再增加时作为判定终点。按以下公式计算病毒的蚀斑滴度，病毒的蚀斑滴度以蚀斑形成单位(Plaque Form Unit，PFU/ml)来表示。

例如某病毒每孔接种0.2ml，在10^-5稀释度可形成50个蚀斑，则按以上公式计算该病毒的

(2)细胞计数：制备相同浓度的细胞悬液，置6孔细胞培养板培养至约48h长成致密单层。消化其中一孔细胞制成细胞悬液，用红细胞计数板在显微镜下进行细胞计数。细胞数(个/ml)＝四角四个大方格的细胞总数/4×稀释倍数×10⁴。例如已长成细胞单层的六孔培养板的某一孔用1ml液体制备悬液，用原液进行细胞计数，四大方格的细胞总数为320个，则该培养孔的细胞总数为8.0×10⁵个。

(3)重配株的构建：以轮状病毒NCDV株和LLR-85株为亲本病毒，以大约为1的相同的感染复数(multiplicity of infection，m.o.i.)同步共感染已长成致密单层的MA104细胞。如果病毒蚀斑滴度确定，预接种的单层细胞总数也已确定，那么以一定的m.o.i.进行感染所需的病毒总量(ml)可用以下公式计算。接种病毒量(ml)＝单层细胞总数(个)×m.o.i.值/病毒的蚀斑滴度。例如，如果病毒的蚀斑滴度为2.5×10⁷PFU/ml，预接种的单层细胞数为8.0×10⁵个，那么要实现m.o.i.为1的话，则需要接种病毒的量为8.0×10⁵×1/2.5×10⁷＝0.032ml。接种细胞在大约呈现75％细胞病变(cytopathic effects，CPE)时，收获细胞培养物，并且反复冻融3次。收获的培养物即为混合感染以后的混合体系，此体系中含有各种不同的子代重配病毒。对此混合物进行蚀斑挑选，以期挑选到试验想要的重配毒株。将混合培养物进行10倍倍比稀释进行预试验以确定适合的挑斑稀释度。确定合适的稀释度以后，即以合适稀释的混合培养物接种MA104细胞进行大量蚀斑筛选鉴定。子代蚀斑病毒通过两种方法进行鉴定，首先是通过RNA PAGE电泳进行初步筛选，通过RNA电泳不能够鉴别来源的部分RNA条带则通过序列分析来确定重配病毒RNA节段的来源。

8.新生犊牛的接种和样品的采集

(1)病毒半数细胞感染量(TCID₅₀)的测定：病毒的接种方法与方法5相同。将病毒作10倍连续倍比稀释即10^-1，10^-2，10^-3......10^-11，每孔加病毒悬液量为100μl，每个稀释度作8孔，每块板的最后一列设8孔细胞对照。把培养板置5％CO₂温箱37℃培养，逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed-Muench氏法计算TCID₅₀。

举例说明

TCID₅₀计算(接种剂量100μl)

1gTCID₅₀＝高于50％病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数高于50％病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为-1。

1gTCID₅₀＝-6+0.26×(-1)

        ＝-6.3

则TCID₅₀＝10^-6.3/0.1ml，即病毒作10^-6.3稀释，每孔接种100μl，可使半数组织细胞管发生病变。

(2)犊牛接种及样品采集：本研究的试验动物为新生犊牛，试验设计需要新生犊牛的总数为11头，分为3组。第一组的2头牛口服接种3.6×10⁶TCID₅₀重配毒株R191，第二组的2头牛口服接种3.2×10^6.5TCID₅₀亲本毒株LLR-85，第三组的7头牛口服接种1.8×10⁶TCID₅₀重配毒株R191和1.6×10^6.5TCID₅₀亲本毒株LLR-85(表2)。为了检测接种的疫苗毒株的排出情况，在接种后7天内每天采集所有接种犊牛的直肠拭子样品，直肠拭子用一定比例的PBS缓冲液制成悬液，3000rpm离心10min，上清用RNA PAGE电泳进行鉴定。为了检测犊牛接种疫苗毒株后的血清抗体反应，在免疫接种后(postinoculation days，PIDs)0，10，21和28天采集所有牛的全血并分离血清，血清保存于-20℃冰箱备用。

表2  新生犊牛接种轮状病毒疫苗毒株后粪便样品中轮状病毒的检测

“-”表示RNA电泳检测为LLR-85和R191阴性；

“+”表示RNA电泳检测为LLR-85阳性。

9.检测血清IgG和IgA抗体的ELISA方法

用初步纯化的牛轮状病毒NCDV株作为抗原包被ELISA平板，抗原用0.1M碳酸盐缓冲液(carbonate-bicarbonate buffer，CBS)稀释，4℃包被过夜，用正常MA104细胞冻融产物上清作为对照抗原也同样包被ELISA平板；用含有0.5％Tween 20的PBS洗涤平板3次，每次摇床振摇3min，然后用5％脱脂乳在37℃温箱封闭1h；用以上同样方法洗涤平板3次，然后将从1∶100倍稀释开始，连续两倍稀释的待检测样品加入到试样孔中，每个样品都要加复孔，于37℃作用1h；用以上同样方法洗涤平板3次，然后加入辣根过氧化物酶标记(horseradish peroxidase，HRP-conjugated)的抗牛IgG和IgA的单克隆抗体(分别是1∶5000和1∶2000倍稀释)，37℃作用1h；用以上同样的方法洗涤平板3次，然后加入1.8％的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-tetramethylb-enzidine，TMB)酶作用底物，室温显色10min；用2M硫酸终止显色反应；用ELISA多功能酶标仪(Zenyth 3100，HVD Anthos)在450nm的波长下扫描光密度值(Optical Density，OD₄₅₀)。用每个样品在病毒抗原包被孔的OD₄₅₀值减去细胞对照抗原包被孔的OD₄₅₀值作为每个检测样品的最终校正OD₄₅₀值，阴性对照的OD₄₅₀值的平均值加上3倍标准差(Standard Deviation，SD)作为结果判定的临界值(cut-off value)，每个检测样品的抗体滴度则表示为校正OD₄₅₀值大于临界值的最高稀释倍数的倒数。

二、试验结果

(一)轮状病毒基因重配毒株R191的构建及鉴定

本发明构建了以羔羊轮状病毒LLR-85毒株为基因背景重配了牛轮状病毒NCDV株VP7基因的重配毒株，并且已经从分子水平和生物学水平两方面鉴定其能够稳定传代。MA104细胞在六孔细胞培养板上培养约2天形成致密单层，用NCDV毒株和LLR-85毒株分别以1个m.o.i同时共感染单层MA104细胞，待产生75％CPE时收获病毒培养物，反复冻融3次。混合的子代病毒应用蚀斑技术进行挑选，挑选的单克隆蚀斑病毒进行小量扩大培养，然后鉴定所挑选的蚀斑病毒。子代病毒基因背景的鉴定主要用RNA电泳和基因的序列分析两种方法。为了挑选重配的目标病毒，本研究共挑选了450个蚀斑。首先对所有蚀斑病毒均进行RNA电泳的初步筛选鉴定，从RNA电泳水平发现不是试验所需目标病毒，则该蚀斑病毒弃之，若在RNA电泳水平上发现是试验所需要的目标病毒，则该病毒再进行蚀斑纯化一次，RNA电泳不能确定来源的基因节段则要通过基因的核苷酸序列分析来确定，最终筛选到只有VP7基因来源于NCDV而其他10个基因节段均来自于LLR-85的基因重配毒株。亲本病毒和重配病毒的RNA电泳图谱如图1显示，重配病毒的VP1、VP2、VP3和NSP3(gene7)基因节段是来源于LLR-85，而VP7基因节段来源于NCDV。剩余的基因节段通过RNA电泳不能确认其来源，因此进行RT-PCR序列分析确定其来源。亲本病毒和重配病毒的VP4、NSP1、VP6、NSP2、NSP4和NSP5各基因节段的核苷酸同源性分析在表3中列出。

试验结果显示，重配病毒的VP4、NSP1、VP6、NSP2、NSP4和NSP5基因节段与亲本病毒LLR-85毒株的核苷酸同源性在99.5％～100％之间，而与亲本病毒NCDV毒株的核苷酸同源性在71.1％～92.7％之间，并且对于这几个基因节段而言，LLR-85毒株与NCDV毒株之间的核苷酸同源性相似于重配病毒与NCDV毒株的核苷酸同源性，这说明本发明重配病毒的VP4、NSP1、VP6、NSP2、NSP4和NSP5基因节段来源于LLR-85。至此通过RNA电泳(图1)和序列分析(表3)两种方法的鉴定，已经充分证明获得了一株以LLR-85为基因骨架重配了NCDV株VP7基因节段的重配毒株，命名为R191。

本发明为了确定重配毒株的生物学特性，将两个亲本病毒和重配病毒以相同的0.1个m.o.i.在MA104细胞上进行繁殖。在接种后12、24、36、48和72小时分别收获每个病毒的培养物，反复冻融3次后用病毒蚀斑技术测定每一个收获病毒的蚀斑滴度，然后以收获时间和病毒滴度制作一步生长曲线。结果显示，在病毒滴度最高时期重配毒株R191和亲本毒株LLR-85具有相似的生长滴度，分别为10^7.4，10^7.6PFU/ml(图2)。重配毒株R191与亲本毒株LLR-85具有相似的生长曲线，可能意味着重配毒株R191在MA104细胞上的复制能力没有受到VP7基因替换的影响，同时也可能暗示轮状病毒的生长与增殖并不是某一个单个基因所决定的。结果分析显示，本发明成功构建了以羊轮状病毒LLR-85毒株为基因骨架重配了牛轮状病毒NCDV毒株VP7基因的重配毒株R191。

表3  重配毒株R191与亲本病毒部分基因节段核苷酸序列的同源性比较

(二)接种犊牛的血清抗体反应

为了评价疫苗毒株R191和LLR-85毒株口服接种犊牛的体液免疫反应，11头不吃初乳的新生犊牛经检测不含有轮状病毒抗体，在出生后24h之内口服接种疫苗毒株。如表2所示分组，第一组2头犊牛口服接种重配毒株R191，第二组2头犊牛口服接种亲本毒株LLR-85，第三组7头犊牛口服接种重配毒株R191和亲本毒株LLR-85。在接种后0，10，21和28天采集每头牛的血清。将所有血清进行100倍稀释，用间接ELISA方法检测血清抗轮状病毒IgG和IgA抗体，以确定每一组牛在免疫期内的抗体动态变化曲线。接种牛的血清轮状病毒特异性的IgG和IgA抗体动态如图3所描述。结果显示，所有接种犊牛在第10天其血清抗轮状病毒IgG和IgA抗体均已转为阳性，第21天其血清抗轮状病毒IgG和IgA抗体均已达最高水平，第28天其抗体值不再升高。由于接种犊牛在接种后21天其血清抗轮状病毒IgG和IgA抗体均达到最高值，所以对接种后21天的犊牛血清进行抗轮状病毒IgG和IgA抗体的滴度测定。血清从1∶100倍稀释开始，进行连续2倍倍比稀释，每个稀释样品用间接ELISA方法检测血清轮状病毒特异性IgG和IgA抗体。结果显示，所有犊牛的血清抗轮状病毒IgG抗体滴度在1∶800到1∶6400之间，所有犊牛的血清抗轮状病毒IgA抗体滴度在1∶800到1∶3200之间(表4)。结果分析显示，新生犊牛口服接种重配毒株R191和/或亲本毒株LLR-85后均能产生较高滴度的抗轮状病毒特异性抗体，说明重配毒株R191和亲本毒株LLR-85具有较好的免疫原性。

表4  犊牛接种后21天血清抗轮状病毒IgG和IgA抗体滴度

注：第一组犊牛口服接种重配毒株R191，第二组犊牛口服接种亲本毒株LLR-85，第三组犊牛口服接种重配毒株R191和亲本毒株LLR-85。

(三)接种犊牛的病毒释放

为了确定新生犊牛在接种减毒株后的病毒排出情况，在免疫后7天时间内每天对接种犊牛的粪便样品进行轮状病毒的病原监测。将粪便样品的20％悬液低速离心，取上清用RNA PAGE电泳检测粪便中是否有免疫接种物的排出。结果如表2所示，在免疫接种后7天内收集的所有77份粪便样品中，仅有2份样品为轮状病毒抗原阳性(2/77，2.6％)，且这两份阳性样品均含有LLR-85毒株。除此之外，没有轮状病毒抗原在其他的粪便样品中被检出。在以前Theil和McCloskey的研究(1995)中，犊牛在口服接种USDA注册生产的牛轮状病毒-冠状病毒弱毒二价活疫苗后，在41份粪便样品中仅检测到1份轮状病毒抗原阳性。在本发明中，较低的病毒排出率(2/77，2.6％)与以前研究中的病毒排出率(1/41，2.4％)相近，显示本发明疫苗候选毒株在犊牛体内能够较好地耐受并且对犊牛也是安全的。