一种利用聚合抗逆基因提高棉花耐盐耐旱性的方法

摘要

本发明公开一种利用聚合抗逆相关基因提高棉花耐盐耐旱性的方法，是将来自植物的信号传导途径的磷脂酰肌醇合成酶基因PIS、离子区隔化的液泡膜焦磷酸酶基因Ppase和来自大肠杆菌的赋予甜菜碱合成能力的胆碱脱氢酶基因betA重组到一个植物表达载体中，转入棉花细胞并让其高效表达，进而再生出转基因植株，从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因纯合体，培育出棉花耐盐耐旱育种新种质，进而创建出棉花耐盐耐旱育种新材料，以用于棉花的常规品种或杂交品种培育。

说明书

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过转基因聚合具有抗逆作用的涉及细胞不同代谢途径的抗逆相关的betA、PIS、Ppase基因提高棉花耐盐耐旱性的方法。

背景技术

土壤干旱和盐渍化是抑制植物生长和降低农作物产量的重要环境因子，全球有50％的农作物种植面积受到干旱和盐碱的威胁(Bray等，2000)。随着世界人口的增加和水资源亏缺以及耕地面积的日益减少，开发利用干旱地和盐碱地显得越来越重要。我国约二分之一国土面积处于干旱、半干旱区。即使在非干旱地区的主要农业区，也不时受到旱灾的侵袭。在我国16亿亩耕地中，盐碱地有1亿多亩，中低产田约10亿亩。其中大部分中低产田也是由于干旱和盐碱所致。此外有3亿亩盐碱荒地有待开发利用，灌溉地区次生盐渍化田地还在逐年增加。土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的一个重要因素，是提高农产品数量和质量的重要障碍。随着人口的增加和耕地面积的日益减少，开发利用盐碱地变得越来越重要(Liu等，1998)。

干旱和盐碱构成了对植物的渗透胁迫，导致植物缺水和脂质过氧化，引起细胞结构严重受损和正常代谢活动不能进行。盐胁迫还引起离子毒害效应。植物的耐盐性和耐旱性既相互关联又存在差异，是分别由多基因控制的复杂性状，涉及到多条代谢途径，其中部分基因在进化上高度保守。近年来植物耐盐机理的研究取得了突破性进展，已从不同生物中克隆出一批耐盐相关基因，而且这些基因与植物的抗旱、耐盐性状的关系也得到初步确认。这些基因大体可分为三类：(1)信号转导和转录调控基因，如MAP激酶基因、SOS激酶基因、磷脂酶基因和一些转录因子基因如HSF、CBF/DREB和ABF/ABAE家族等；(2)直接参与保护和修复膜和蛋白的基因，如热休克蛋白(Hsps)和分子伴侣基因、胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)基因、渗透保护物质(相容性溶质)合成酶基因和细胞抗氧化及活性氧清除相关基因等；(3)水分与离子吸收与转运基因，如水通道蛋白基因和离子转运体等。其中一些基因转入植物后能明显提高植株耐盐性。

基于植物耐盐抗旱机理的研究，目前采用基因工程技术提高作物耐盐耐旱性的研究目前集中在四个方面：1)渗透保护与渗透调节，2)氧自由基的消除，3)离子均衡的调控，4)胞内信号传递通道的调节。迅速合成并积累大量小分子化合物来维持细胞的正常功能是许多高等植物在受到盐或其它环境胁迫时对外界的一种适应性防御反应。甜菜碱是这类相容性小分子有机物中重要的一种。甜菜碱不仅能作为无毒害的渗透调节剂在细胞受胁迫条件下维持胞内渗透压，而且能稳定酶和蛋白复合物等大分子的结构和功能并保持膜的完整性，从而抵御盐、冷、热和冻害对植物所造成的伤害(Chen等，2008；Ashraf等，2007)。采用基因工程的方法使不能合成甜菜碱的植物合成甜菜碱已被证明是可以有效地提高对各种非生物胁迫容忍性。大肠杆菌的胆碱脱氢酶由betA基因编码，催化胆碱形成甜菜碱醛，也能以几乎相同的速率催化甜菜碱醛脱氢产生甜菜碱，即胆碱脱氢酶兼具胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶的功能，此特性使转移单一酶基因的基因工程即可赋予植物积累甘氨酸甜菜碱的能力。将betA基因导入烟草(等，2000)，转基因植物的耐盐性、耐低温能力与对照植株相比有明显的提高，叶片中积的累甜菜碱含量最高达35nmol g^-1FW。本实验室Quan等(2004年)将betA基因转移到优良玉米自交系中，Lv等(2007年)将betA基因转移到棉花中，Duan等(2009年)将betA基因转移到烟草中，提高了转基因植物的耐旱性，更为重要的是提高了转基因植物在干旱胁迫下玉米的籽粒产量或者棉花的籽棉产量。

在复杂机制控制下的多条途径参与了细胞质中Na⁺浓度的调节。多数盐生植物消除Na⁺毒害的主要机制是将吸收的Na⁺定位于液泡来降低胞质中Na⁺的浓度，即离子区域化机制尤为重要。减少植物细胞质中Na⁺浓度的一个重要途径是Na⁺区隔化。植物中将Na⁺从胞质运往液泡是由液泡膜上的Na⁺/H⁺ antiporter完成的，盐胁迫下Na⁺/H⁺ antiporter活性往往显著增强的同时常也伴随V-ATPase和H⁺-TsVP的活性升高。液泡膜上的V-ATPase和H⁺-Ppase为Na⁺/H⁺ antiporter提供H⁺梯度。氢离子焦磷酸酶(H⁺-Ppase)定位于植物细胞的液泡膜上，以PPi作为能量，将H⁺泵入到液泡内，与V-ATPase一起维持液泡和细胞质之间H⁺梯度。液泡膜电位主要取决于V-ATPase和H⁺-Ppiase活性，质子泵活性的升高驱动盐活化的Na⁺/H⁺ antiporter活性的提高，Na⁺/H⁺antiporter利用这种H⁺梯度以Na⁺/H⁺反向交换形式将Na⁺泵入到液泡中，从而降低细胞质中Na⁺浓度。过表达来自盐芥液泡膜H⁺-Ppase基因TsVP可大幅度提高植物的耐盐耐旱性(Gao等，2006.Li等，2008)。Lv等(2007，2009)将来自盐芥的Ppase基因TsVP转入棉花改善了棉花的耐盐抗旱性和干旱盐胁迫下的光合作用能力。

一些工作表明，磷酸肌醇信号途径在高等植物的生长、发育及对环境胁迫反应中发挥重要作用。磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PtdIns)是真核细胞中的主要磷脂之一，是细胞中主要的磷脂信号分子的前体。磷脂酰肌醇合成酶(phosphatidylinositol synthase，PIS)以CDP-DG和myo-inositol为底物合成PtdIns，PtdIns以不同方式被磷酸化产生一系列的磷酸肌醇，其中磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2)可被磷脂酶C(phospholipase C，PLC)水解产生二酯酰甘油(diacylglycerol，DG)和三磷酸肌醇(trisphosphate inositol，IP3)。2000年Xue等克隆从拟南芥中到AtPIS1基因并将其在酵母中表达鉴定了其功能。2005年翟淑梅等从玉米中克隆出ZmPIS基因，研究表明异源表达PIS基因可提高转基因植物的耐盐抗旱性。

采用转基因技术提高植物耐盐耐旱性是国内外研究的热点课题，已有大量的工作。将维持细胞内离子平衡的基因、合成渗透保护物质的基因、能减轻细胞内自由基危害的基因等导入植物，提高了植物的耐盐耐旱性，为培育耐盐耐旱作物新品种开辟了一条有效途径。但迄今所创造的转基因植物中，绝大多数是通过单个目的基因的遗传转化获得的。发育和代谢的协调进行和生物的适应性与抗逆性多依赖于多基因之间的互作，因此，多基因转化的策略必将成为今后基因工程在基础理论与实际应用研究中的主流方向之一。从策略和技术上讲，采用转基因技术聚合不同代谢途径相关基因提高作物耐盐耐旱性已具有成熟的技术路线和必要的实施条件。

在作物育种工作中，急待解决的难题之一是大幅度提高优良育种材料的耐盐耐旱性，从而选育出具有重大突破的品种。迄今所创造的转基因植物中，绝大多数是通过单个目的基因的遗传转化获得的。发育和代谢的协调进行和生物的适应性与抗逆性多依赖于多基因之间的互作，因此，多基因转化的策略必将成为今后基因工程在基础理论与实际应用研究中的主流方向之一。

杂交法是先用不同基因转化同一基因型的材料，再把获得基因表达稳定的不同转基因植株彼此杂交聚合多个目标基因，然后通过自交获得含有多个转基因纯合的株系。利用杂交法聚合多基因通常存在费时且工作量庞大的缺点。如果将3～4个单基因从各自的亲本中聚合到一起，那么至少需要4～6代的时间(Haipin et al，2001)。另外，由于这些基因可能不在同一个位点上，继续传代可能会导致基因的分离，这对于进一步的育种是非常不利的。考虑到转基因的位置效应和基因表达的稳定性，通常还必须扩大相应的育种群体。Hitz(1999)指出，在应用杂交聚合法时，为了保持原来品种的田间性状，每个基因的繁育群体至少应扩大为原来的2倍。对于3基因转化而言，育种规模即必须扩大8倍以上。这样的育种方法导致成本高昂，产量难以保证，而且不同位点之间的基因表达难以协调。对于依赖营养繁殖具有杂合背景的植物(许多观赏植物、马铃薯、多年生果树)则无法通过杂交法实现基因聚合。重复转化法又称为顺序转化法，是指经过一次转化的植株作为受体进行二次转化，依次多重转化以达到目标基因的聚合。一些研究认为重复转化法的局限在于易诱发基因沉默，而且每次转化需要使用不同的筛选标记。尽管这种方法在理论上可行，但由于耗时费力，筛选困难，不同基因间易发生分离或诱发沉默，多次的转化和长时间的组织培养还容易引起变异，同时每次转化均需要不同的筛选标记，因而在实践中难度较大。共转化法是将多个基因同时导入受体细胞基因组中，这些基因可位于同一个转化质粒上。共转化法能够通过一个单一的转化事件导致多基因整合的发生，相比重复转化而言方法简单且耗时少。在上述的各种多基因聚合的方法中，将目的基因接到一个转化载体进行转化是有效而省时的方法。多个基因如能构建在同一载体上，无疑将会省去杂交法、回交法、重复转化法的繁琐费时，多载体共转化频率低，整合模式复杂以及多个转入的基因在后代中发生分离与重组等问题。因此多基因表达载体的构建已经成为多基因转化策略的关键性技术之一。

在棉花主栽区，干旱和土壤盐渍化是影响棉花产量的主要因素。棉花是耐盐抗旱性较强的作物，可看作是盐碱地和干旱地的先锋作物。Levitt认为棉花耐盐极限为0.6％～0.7％盐浓度，但其耐盐性因品种、生育阶段、器官以及土壤盐分种类等不同而差异较大，绝大多数品种在盐浓度大于0.2％时会受到离子毒害和渗透胁迫。在严重干旱条件下，棉花也会出现生长缓慢以及落蕾落铃等现象，从而严重影响棉花生产。因土壤盐渍化造成棉花播种面积减小和产量锐减，农民急需耐盐耐旱性强的高产棉花品种。随着我国淡水资源的逐年匮乏和气候变暖，采用转基因技术培育耐盐耐旱棉花具有重要的战略意义。由于种质材料缺乏和田间选择困难等原因，常规育种选育耐盐耐旱棉花品种的工作收效不大。采用基因工程技术可望在较短时间内创造出棉花耐盐耐旱育种新种质。目前棉花的转基因工作主要集中在抗鳞翅目昆虫方面，抗虫棉已在国内外大面积推广。而采用转基因技术创造耐盐耐旱棉花的工作在国内外尚处起步阶段。迄今国内外未报道获得耐盐或/和耐旱性大幅度提高且具有实用价值的转基因棉花，也未见到将涉及细胞不同代谢途径的抗逆相关的betA、PIS、Ppase构建到一个植物表达载体中转入棉花提高棉花耐盐耐旱性的报道。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的问题是提供一种通过转基因聚合betA、PIS、Ppase基因提高棉花耐盐耐旱性的方法。

在本发明中，采用基因聚合的策略是将不同抗逆代谢途径的3个具有重要农艺应用价值的异源基因和赋予棉花对草甘磷抗性的EPSP基因导入棉花，培育出耐盐耐旱性大幅度提高的棉花新材料。

本发明通过转基因聚合betA、PIS、Ppase基因提高棉花耐盐耐旱性的方法是，将来自植物磷脂信号途径关键基因磷脂酰肌醇合成酶基因PIS和植物离子区隔化的关键基因液泡膜焦磷酸酶基因Ppase、来自大肠杆菌的渗透保护合成途径的关键基因胆碱脱氢酶基因betA重组到植物表达载体pCAMBIA1302中，转入棉花细胞中并让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；在盐碱池或干旱棚中鉴定出耐盐耐旱性提高的转基因纯合体，从而创建出棉花耐盐抗旱育种新种质。

其中，上述目标基因PIS、betA和Ppase基因以betA-PIS-Ppase的顺序串联插入在植物表达载体pCAMBIA上；其中所述pCAMBIA的选择标记基因是EPSP基因。

其中，所述EPSP基因由35s启动子驱动，betA基因由Pubi启动子驱动，PIS和Ppase基因由35s启动子驱动。

其中，所述PIS基因是信号传导途径的基因，所述betA基因是渗透调节途径的基因，所述Ppase基因是离子区隔化途径的基因；其中PIS和Ppase基因来自盐生植物或非盐生植物，BetA基因来自大肠杆菌。

其中，上述用于遗传转化的棉花品种是春棉、夏棉、常规棉或杂交棉。

其中，上述用于遗传转化的棉花受体细胞是茎尖分生组织细胞、离体培养的幼胚细胞、成熟胚细胞、胚性愈伤组织细胞或原生质体。

其中，上述利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体的方法是：通过对3～4叶期转基因棉花小苗喷洒20～30ppm草甘膦检测转基因植株的抗性，用除草剂筛选获得抗性植株，然后对抗性植株利用常规分子检测技术(PCR、southern杂交等)检测获得转基因纯合植株。

其中，上述对获得的转基因纯合植株耐盐碱性鉴定方法是：采用盐碱池-生理生化指标和盐碱地多点试验鉴定相结合的策略，筛选出耐盐碱能力明显提高的纯合体，从中选择优异材料培育棉花耐盐碱新种质。

其中，上述对获得的转基因纯合植株耐旱性鉴定方法是：采用干旱棚-生理生化指标和盆栽鉴定相结合的策略，筛选出耐盐碱能力明显提高的纯合体，从中选择优异材料培育棉花耐旱新种质。

本发明获得的转基因聚合植株可直接应用于棉花的常规品种或杂交品种培育。

本发明的基本思路是依据植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新进展，利用植物细胞中与抗逆性相关的代谢途径的调控知识，植物的抗逆性多依赖于多基因之间的互作，采用转基因和基因聚合技术，将能够显著提高细胞中甘氨酸甜菜碱含量并明显提高植物棉花耐盐耐旱性的betA基因、磷脂酶信号传导途径中的关键酶磷脂酰肌醇合成酶PIS基因和能够提高液泡膜质子梯度、增加Na⁺向液泡储蓄从而增加细胞吸水能力的液泡膜焦磷酸酶基因Ppase导入棉花良品种中，实现这些基因的过表达，从而大幅度提高植株的耐盐耐旱性。在转基因操作中选用了对人、畜安全的除草剂抗性基因EPSP(EPSPS：烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，是莽草酸途径中的一个关键酶)作为选择标记基因。草甘膦(Glyphoaste)是目前使用面积最大、使用范围最广的灭生性除草剂，其毒性机制主要是竞争性抑制莽草酸途径中的EPSP合酶，导致芳香族氨基酸合成受阻，从而扰乱了生物体正常氮代谢而死亡。植物中EPSP合成酶的过量表达或某些活性位点氮基酸的突变对高剂量的草甘膦有较强的耐受性，因此可赋予转基因植物抗草甘膦(商品名称为农达，镇草宁，MON-0573等，)除草剂特性。

本发明所用的目标基因为来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA，来自植物的编码液泡膜上焦磷酸酶基因Ppase和磷脂肌醇信号途径的关键酶磷脂酰肌醇合成酶PIS基因。大肠杆菌的胆碱脱氢酶(CDH)由betA基因编码，催化胆碱形成甜菜碱醛，也能以几乎相同的速率催化甜菜碱醛脱氢产生甜菜碱，即CDH兼具胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶的功能，此特性使转移单一酶基因的基因工程即可赋予植物积累甘氨酸甜菜碱的能力。由于在转基因植物中过表达betA基因可提高作物合成甜菜碱的能力，可提高作物的耐盐、抗旱等非生物胁迫。磷脂酰肌醇合成酶(PIS)催化myo-inositol和CDP-甘油生成磷脂酰肌醇(PI)，PI的D3、D4、D5位置有顺序的磷酸化产生了重要的信号分子PI(3.4)P2、PI(3.4.5)P3和PI(4.5)P2。PI(4.5)P2被PI-PLC分解成为IP3和DG，其中IP3刺激细胞内钙离子的释放，DG激活PKC。过表达PIS基因使烟草耐旱性及耐盐性有一定程度的提高。氢离子焦磷酸酶(Ppase)定位于植物细胞的液泡膜上，以PPi作为能量，将H⁺泵入到液泡内，与V-ATPase一起维持液泡和细胞质之间H⁺梯度，为Na⁺/H⁺antiporter提供H⁺梯度。过表达来自盐芥液泡膜H+-PPase基因TsVP可大幅度提高植物的耐盐耐旱性(Gao等，2006；Li等，2008，Lv等，2009)。所用的植物转基因载体为pCAMBIA1302或和pMD18载体，或它们的派生载体。这些载体分别重组进betA基因、PIS基因和Ppase基因。转基因植物细胞选择标记基因分别为除草剂抗性基EPSP基因。目标基因和转基因植物选择标记基因采用常规分子生物学方法通过多步骤重组插入到植物转基因表达载体中，并通过转基因植物的检测确定了这些基因能在植物中活跃表达，并提高了转基因植物的耐盐耐旱性。

转基因棉花采用农杆菌介导法产生，转基因植株用PCR检测、Southern blotting验证，外源基因表达研究采用Northern blotting。植株抗逆性测定采用植物生理学和作物栽培学方法，其中转基因植株耐盐耐旱性测定采用盆栽试验-生理指标测定、盐碱地和干旱池栽培实验及田间多点实验法。转基因遗传稳定性测定采用经典的遗传学方法，结合于PCR检测和系谱分析。

在棉花的遗传转化中，以我国新选育的优良品种(如鲁棉系列)为材料，取无菌萌发的种子幼苗茎尖分生组织为受体，采用农杆菌介导法进行转化。转基因植株经选择基本保持原品种特性，通过一次转化实现基因聚合，达到在同一品种植株中获得聚合不同抗逆基因的目的。

本发明实施的具体步骤为：

1)将3个目的基因和1个选择标记基因通过常规分子生物学方法通过多步骤重组插入到植物转基因表达载体中，并导入到大肠杆菌或/和农杆菌中。

2)通过农杆菌介导的转基因方法，以棉花的茎尖分生组织细胞为受体将目标基因转入棉花细胞中，获得转基因植株。通过分子检测和植株抗逆性测定选出目的基因稳定表达且植株抗性明显提高的转基因植株。

3)转基因聚合材料的抗逆性鉴定和利用。根据目的基因表达产物的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，筛选出耐盐耐旱性明显提高的转基因育种材料。获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。

附图说明

图1、1302-EPSP-betA-PIS-TsVP植物表达载体的构建。

图2、正常生长条件下棉花种子的萌发率。

图3、250mM NaCl条件下棉花种子的萌发率。

图4、不同NaCl浓度下种子萌发后第10d棉花幼苗的生物量。

图5、在东营盐碱地中转基因棉花的出苗率，土壤含盐量0.6％。

图6、12％(w/v)PEG-6000渗透胁迫下棉花叶片的相对水含量。

图7、12％(w/v)PEG-6000渗透胁迫下棉花叶片的净光合速率。

图8、花期控水下棉花的籽棉产量。

注：betA为转betA基因株系；

PIS为转PIS基因株系；

BPT为转betA-PIS-TsVP基因株系；

TsVP为转TsVP基因株系。

^*与野生型棉花(鲁棉研19)相比显著性差异(P＜0.05)。

具体实施方式

以下叙述本发明的实施例。需说明的是，本发明的实施例只对本发明起说明作用而没有限制作用。

实施例1：创制耐盐碱的优异棉花育种材料

1、植物表达载体的构建

目标基因和转基因植物选择标记基因采用常规分子生物学方法通过多步骤重组插入到植物转基因表达载体中。植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA-PIS-TsVP的构建过程参见图1。本实施例中目的基因为来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA、来自盐芥来自盐芥的编码液泡膜上焦磷酸酶基因Ppase(TsVP)和来自玉米的磷脂肌醇信号途径的关键酶磷脂酰肌醇合成酶PIS基因。选择标记基因为除草剂抗性基因EPSP(EPSPS：烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)

具体重组过程是：SphI单酶切植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA，回收载体部分。植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA其中的pCAMBIA1302载体为CAMBIA公司产品，GenBank注册号AF234298；EPSP基因注册号AY573186.1；betA基因注册号FJ823260.1。SphI不完全酶切克隆表达载体pMD18-35s-TsVP回收来自盐芥的PPase基因(TsVP)片段(pMD18克隆表达载体Takara公司有售，产品货号：D103C(A×10)pMD18，说明书中有详细碱基序列。TsVP基因注册号AY436553，参见：高峰，盐芥耐盐相关基因的克隆及功能分析，山东大学博士论文，2006)；将植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA的载体部分与克隆表达载体pMD18-35s-TsVP中的目的基因TsVP连接，获得中间植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA-TsVP。其后，BamH I不完全酶切回收中间植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA-TsVP的载体部分；Bgl II单酶切克隆表达载体pMD18-35s-PIS回收来自玉米的外源PIS基因片段(pMD18克隆表达载体Takara公司有售，PIS基因登录号AY370763，参见：翟淑梅，玉米磷脂酰肌醇代谢途径中酶的基因克隆及其功能鉴定，山东大学博士论文，2005)；将中间植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA-TsVP的载体部分与回收的克隆表达载体pMD18-35s-PIS外源基因PIS片段连接获得植物表达载体pCAMBIA1302-EPSP-betA-PIS-TsVP，可用于遗传转化。

2、棉花转基因植株的获得

棉花种子经硫酸脱绒后，用70％乙醇浸泡1min、0.1％的升汞浸泡15min，然后用无菌水洗涤5遍。消毒后种子放入铺有三层滤纸的无菌瓶中，加入适量无菌水，于30℃温箱中萌发。2～3天后下胚轴长到1～2cm，将萌发种子插到M1固体培养基中继续培养，取株高7～10cm小苗用于茎尖顶端生长锥用于转化。

将带有载体(质粒1302-EPSP-betA-PIS-TsVP带有除草剂抗性基因EPSP和目的基因TsVP，betA和PIS)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃下分别震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5～20倍用于转化。在浸染前向此细菌悬液加入100mg/L的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。在转化试验中，加入1％的表面活性剂Silwet L-77(Lehle Seeds，USA)或Tween80。

当种皮脱落或快脱落时，去掉种皮和一片子叶，裸露出小苗茎尖。若苗端已有小叶出现，则用镊子剥去。轻轻划伤顶端分生组织后，将蘸有农杆菌菌液的棉球(由灭菌脱脂棉制备)放到小苗顶端，持续24h后取下棉团，用无菌滤纸吸去感染部位的残留菌液。小苗浸染时置于真空干燥器中，辅以0.5×10⁵Pa的负压处理。浸染过的幼苗于21℃左右暗培养3天，然后在光下培养2～3天后移栽入花盆。花盆下部为壤土，上部为6～8cm厚的蛭石，隔天浇灌1/2MS无机盐溶液。

待转化植株长出3片真叶后，喷洒20ppm除草剂草甘膦(转基因选择标记基因为EPSP)水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株掉液滴为宜。未转化植株在喷洒后3天停止生长，7～10天左右开始死亡。转化处理后的植株，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。植株长到4～5叶期，将其定植到田间。

抗除草剂转化植株生长到7～8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对PCR阳性植株进行Southern检测。约25％的抗除草剂植株为转基因个体。

3.转基因植株的耐盐性检测

除草剂筛选后存活的植株生长到4～5叶期时移栽到田间，按照常规管理方法进行管理。单株收获种子供遗传稳定性分析和耐盐性鉴定。

(1)转基因植株的耐盐性测定

转基因植株开花后自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4～6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因。取转基因阳性植株进行抗逆性测定。

由于棉花对盐害的敏感期为苗期，在花蕾期耐盐性较强，为了获得具有应用参考价值的数据，同时又能使筛选出的耐盐植株产生大量的种子以供盐碱地种植实验。将棉花种子播种于洗净的黄沙中与室温下萌发。播种后浇灌含有0、50、75、100、125、150、175、250mMNaCl的Hogland营养液。每株系每盆萌发25粒种子，5次重复。每日统种子萌发数。种子萌发后第10d测定幼苗生物量。

从种子萌发率和棉花幼苗的生物量可以看出，聚合betA-PIS-TsVP基因棉花的种子萌发率、幼苗的高度和棉花幼苗的干物质量均以聚合材料的为最高(图2～4)，聚合betA-PIS-TsVP(BPT)基因的棉花耐盐性苗期得以提高。苗期是棉花对盐胁迫最敏感的时期之一，而且很多研究表明某些棉花品种在不同发育阶段的耐盐性是相一致的，即在苗期耐盐性较强的品种，其在以后的各个生育时期的耐盐性也较强(AshrafM等，2002)。由于筛选所用的盐浓度远高于中度盐碱地的含盐量，而棉花通常只在含盐量0.4％以下的土地中生长正常，故获得的转基因棉花具有优异的耐盐性，可望获得在中度盐碱地种植的优良品种。

(2)转基因棉花的在盐碱地中的萌发率

棉花对盐害的敏感期为出苗期，在起身后耐盐性较强。为了获得具有应用价值的数据，将筛选出的耐盐植株产生的种子播种在盐碱地中，统计了田间的出苗率。盐碱地田间试验在山东省东营市河口区进行。播种前测定0～20cm土壤有机质、速效氮、速效磷和速效钾的含量，利用电导法测定土壤含盐量。土壤的基本理化性状为：有机质1.32％，速效氮38.97μg/g，速效钾75.62μg/g，速效磷14.12μg/g，土壤含盐量为0.55％。结果表明betA-PIS-TsVP基因聚合植株的种子萌发率最高，与野生型对照差异显著，聚合betA-PIS-TsVP基因植株表现出较好的耐盐性(图5)。棉花通常只在含盐量0.4％以下的土地中种植，而获得的转基因棉花具有优异的耐盐性，可含盐量0.5～0.6％土壤中生长。

实施例2：创制耐旱性显著提高的优异棉花育种材料

1、植物表达载体的构建

植物表达载体的构建同实施例1的植物表达载体的构建部分。

2、棉花转基因植株的获得

棉花转基因植株的获得同实施例1的棉花转基因植株的获得部分。

3.转基因植株的耐旱性检测

转基因植株开花后自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4～6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因。取转基因阳性植株进行抗逆性测定。

经硫酸脱绒的转基因棉花和鲁棉研19(对照)种子种于蛭石中，于28/20℃(昼/夜)、光照强度500μmol m^-2s^-1、光照时间14/10小时(昼/夜)、相对湿度60～70％下萌发长至两叶期，每转基因株系取长势一致的PCR阳性植株与野生型植株同时转入Hogland营养液培养，每周换2次营养液，充分通气。幼苗长至5叶期时一半植株转入加12％(w/v)PEG-6000的Hogland营养液中，渗透胁迫处理24小时。另外一半植株仍在Hogland营养液中培养，作为未处理对照。然后分别测定渗透胁迫处理植株和未处理植株的叶片相对含水量和净光合速率等生理指标。棉花种子播种于装有10kg/盆土壤的花盆中，待植株开第一朵花开始，每天控制浇水量，使土壤含水量保持在12％～14％之间，进行持续干旱胁迫4周，然后恢复正常浇水。在收获期测定株籽棉产量。

从种子棉花苗期12％(w/v)PEG-6000渗透胁迫24h后从棉花叶片的相对水含量和叶片净光合速率可以看出，棉花苗期的叶片相对水含量和叶片的净光合速率均以聚合betA-PIS-TsVP基因的为最高(图6～7)，聚合betA-PIS-TsVP(BPT)基因的棉花耐旱性得以提高。从花期干旱棉花的产量上看，聚合betA、PIS、TsVP基因棉花的单株籽棉产量最高(图8)，转betA-PIS-TsVP基因棉花的耐旱性显著提高。