3－氨基－1－硝基脒基－2－哌啶酮及其盐在制备治疗心血管疾病药物中的用途

摘要

本发明公开了3－氨基－1－硝基脒基－2－哌啶酮及其盐在制备治疗心脑缺血、缺氧疾病药物中的用途。3－氨基－1－硝基脒基－2－哌啶酮及其盐能显著延长实验动物在脑缺血及常压缺氧环境中的存活时间，降低脑缺血再灌注后造成的脑水肿程度及其它的神经行为症状。在临床上有较大应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮及其药物可接受的盐在制备抗心脑缺血、缺氧药物中的用途。

背景技术

心脑缺血、缺氧在临床上是比较常见的现象，如由于心脏冠状动脉狭窄或阻塞造成的心肌缺血、缺氧的心脏病，及由于脑血管狭窄或阻塞造成的以缺血、缺氧为特征的脑病，如脑梗塞等。

近年来，心脑血管疾病的发病率逐渐增加。据统计，美国冠心病患者估计有700万例，每年约150万人发生心脏事件，大约30万人在到达医院前死亡，另外20万人死于发病后第一周，同时也花费了大量的资金。美国每年用于冠心病的诊治的开支估计为500亿美元，发展中国家包括我国在内冠心病的发病率也在逐年上升，十余年来增加了2.3倍，现有冠心病患者一千多万人。我国居民死于心血管疾病的人数是癌症的1.7倍，成为致死的主要原因。

脑血管疾病也是世界上主要致死原因之一。与西方发达国家不同的是，我国脑卒中(脑出血+脑梗塞)的发病率是急性心肌梗死和冠心病卒死发病率的3～4倍，而脑梗塞与脑出血的发病率相近。根据国家卫生部公布的第三次全国死因调查结果显示，脑血管病已占死亡总数的22.45％。目前中国每年脑卒中新发病250万例，而每年死于脑卒中约有150万人，存活者中有3/4留有不同程度的残疾，脑卒中导致人群寿命平均缩短12年。随着我国老龄化社会的快速发展，脑梗塞造成的死亡率还将不断攀升。脑梗塞后脑组织缺血缺氧，激活炎细胞，中性粒细胞释放溶酶体酶，致细胞破坏，溶解死亡；耗氧增加，再灌注后重新获得氧供，产生大量的氧自由基，引起呼吸爆发，细胞损伤；中性粒细胞及血小板活化聚集，释放血管活性物质，致血管痉挛，引发缺血区再灌注后“无复流”细胞缺血缺氧受损。

据资料报道，目前高血压的发病率超过世界人口的10％，全球有高血压患者6亿人，在我国高血压发病率为11.26％，其中男性综合发病率为12.13％，女性为10.32％，因此患者约1.76亿人，且每年仍以新增300万人的速度发展，其中高血压危重症者占5％，约880万人。而高血压是心脏病和脑梗塞的独立危险因素。随着我国人口老龄化和生活方式的改变，心脑血管疾病日益增多，逐渐成为危害人类健康的“第一杀手”。

目前，临床上用于治疗高血压病的药物主要有β-肾上腺素受体阻断药如美托洛尔、钙拮抗剂如氨氯地平、血管紧张素转换酶抑制剂如卡托普利、血管紧张素II受体拮抗剂如氯沙坦钾和血管扩张药物如肼屈嗪(肼苯哒嗪)、硝普钠等。治疗心脏病和心绞痛的化学药品主要有硝酸异山梨酯和单硝酸异山梨酯(ISMN)。单硝酸异山梨酯为二硝酸异山梨酯的主要生物活性代谢物，与其它有机硝酸酯一样，主要药理作用是松弛血管平滑肌。ISMN释放一氧化氮(NO)，NO与内皮舒张因子相同，激活鸟苷酸环化酶，使平滑肌细胞内的环鸟苷酸(cGMP)增多，从而松弛血管平滑肌，使外周动脉和静脉扩张，对静脉的扩张作用更强。静脉扩张使血液潴留在外周，回心血量减少，左室舒张末压和肺毛细血管楔嵌压(前负荷)减低；动脉扩张使外周血管阻力、收缩期动脉压和平均动脉压(后负荷)减低；冠状动脉扩张，使冠脉灌注量增加。总的效应是使心肌耗氧量减少，供氧量增多，心绞痛得以缓解。其副作用包括用药初期可能会出现硝酸酯引起的血管扩张性头痛，通常连续使用数日后，症状可消失；还可能出现面部潮红、眩晕、直立性低血压和反射性心动过速；偶见血压明显降低、心动过缓、心绞痛加重和晕厥等。

目前用于脑血管及神经系统的药物，按作用机制分为：高度选择性钙拮抗剂、脑血管和周围血管扩张剂、植物提取物和其他脑保护剂。临床使用的脑保护剂主要有：依达拉奉、神经节苷脂、脑蛋白水解物、胞二磷胆碱、小牛血(清)去蛋白、鼠神经生长因子等。其中最值得关注的是依达拉奉和神经节苷脂，已成为脑血管用药中增长最快的品种之一。治疗心脑血管疾病还用一些中药如丹参及其复方制剂、葛根素制剂、银杏叶及其提取物制剂等。

进入新世纪后，各国药企纷纷加大了心脑血管病新药和仿制药的开发力度，心脑保护剂已逐渐成为临床使用中的热门药物，其中的脑循环代谢保护剂已成为研发的新热点，此类药物具有自由基的清除、保护、修复与激活神经元的优势。同时，也针对改善红细胞变性能力，降低血黏度和抑制血小板聚集，具有延长细胞生存能力、注重改善脑循环系统的功能。而治疗这类疾病的心脑血管支架术和搭桥术等常见的并发症是缺血再灌注损伤。长期以来人们一直在寻求各种能有效治疗心脑缺血缺氧及缺血再灌注损伤等疾病，保护心肌细胞和脑细胞的药物。

3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮(I)是Miklos Bodanszky等发现的物质(US3024242)，其分子式为C₆H₁₁N₅O₃，结构表示如下：

未见关于(I)的生物活性、药理作用和用途的报道，尚无其在制备抗心脑缺血缺氧药物方面的应用。

本发明令人惊奇地发现3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮(I)能显著延长实验动物在脑缺血及常压缺氧环境中的存活时间，降低脑缺血再灌注后造成的脑水肿程度及其它的神经行为症状。因而可用于人和动物抗心脑缺血、缺氧状态，治疗或预防心脑缺血缺氧相关的疾病。

发明内容

本发明涉及3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮和其药物可接受的盐在制备抗心脑缺血、缺氧药物中的应用。

在3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮的药物可接受的盐中，可提及与药物可接受的无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硼酸盐、磷酸盐、磺酸盐、硫酸氢盐和磷酸氢盐，以及有机酸盐，如柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、甲基硫酸盐、苦味酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、羟乙磺酸盐、α-酮戊二酸盐、α-甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐和葡萄糖-1-磷酸盐。

优选的化合物I的盐为：

II、3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮盐酸盐

III、3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮乙酸盐

IV、3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮乳酸盐

V、3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮甲磺酸盐

VI、3-氨基-1-硝基脒基-2-哌啶酮马来酸盐

为了证实化合物I及其盐的药物制剂的药理活性，本发明研究人员对该系列化合物进行了一系列的药理毒理学试验。

试药：化合物I及其盐由北京嘉事联博医药科技有限公司实验室提供，其他各种药品、试剂、试药等均为市售品。

具体实施方式

试验例1对小鼠常压缺氧存活时间的影响

将50只昆明种小鼠，体重18～20g，雄性，随机分为五组：生理盐水对照组，葛根素注射液对照组，化合物(II)高、中、低剂量组，每组10只。单次腹腔注射给药后30分钟，将每只小鼠置于盛有5g钠石灰的125ml磨口广口瓶中，加盖密封，记录存活时间(从密封至停止呼吸的时间min)。实验数据用x±SD表示，用t检验比较存活时间的差异性。

表1对小鼠常压缺氧存活时间的影响

注：与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果葛根素注射液对小鼠常压缺氧存活时间有显著的延长作用，化合物II高剂量组对常压缺氧小鼠存活时间与葛根素注射液作用相当。

试验例2对大鼠局灶性脑缺血损伤的影响

大鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型：健康雄性SD大鼠，体重250～300g，大鼠用10％水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉，颈正中切开，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，用电热烧灼器烧断颈外动脉的分支，结扎并游离颈外动脉主干一段，在颈外动脉游离段上剪开1个小口将预先制备好的尼龙线栓子插入，经左侧颈总动脉分支处通过颈内动脉入颅，至大脑前动脉首端，尼龙线插入深度平均为(18.5±0.15)mm，缝合皮肤。缺血2小时后轻轻拔出栓塞线，实现大脑中动脉再灌注。将大鼠随机分为4组：假手术组、模型对照组、依达拉奉组、化合物I治疗组(50mg/kg、10mg/kg)，每组25只大鼠。造模后6小时内，治疗低剂量组、高剂量组和依达拉奉组分别按照10mg/kg、50mg/kg和1mg/kg经腹腔给药，以后每天2次连续3天；对照组和假手术组给予等容量的生理盐水。

神经行为评分：治疗3天后进行神经行为评分。按照Bederson评分标准，即0分：无神经功能缺失症状；1分：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2分：向瘫痪侧推时感阻力较对策明显降低；3分：大鼠爬行时向瘫痪侧旋转；4分：伴有意识障碍。

脑梗死灶体积测定：治疗3天后，随机取10只大鼠断头处死，在冰盘上快速取出大脑，将其平均冠状切为5片，放于新鲜配置的2％TTC染液中，37℃孵育30min。梗死区显示白色，非梗死区呈红色。用TD2000图像分析系统测出各层的梗塞面积，总面积之和乘以层厚即为体积(mm³)。

脑含水量的测定：采用干湿重法测脑组织含水率：于治疗3天后，随机取10只大鼠，麻醉后断头取脑立即切成左右两半，用电子天平称取病灶侧半球的重量，然后置于100℃烤箱内烤24小时，用同一天平再次称重，以〔(湿重-干重)/湿重×100％〕即为相对含水量。

上述所得结果以x±s表示，应用SSPS11.0统计软件进行统计处理，结果见表2。

表2不同试验组对大鼠神经行为、脑梗死体积和脑含水量的影响(x±s)

注：与模型对照组比较^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01

结果：由表2可知，依达拉奉组和本发明化合物I高剂量组均对大鼠局灶性脑缺血引起的神经行为和脑梗死体积有非常显著的治疗作用(^▲▲P＜0.01)，在脑含水量方面亦有显著的影响(^▲P＜0.05)。

试验例3抗培养脑细胞缺氧-再给氧损伤试验

原代脑细胞培养与缺氧、缺氧-再给氧损伤模型的建立：取2-3天龄Wistar大鼠乳鼠，雌雄不限，参考文献方法取大鼠大脑皮质脑细胞。用于检测丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)的细胞接种于10ml玻璃培养瓶中，用于线粒体脱氢酶活性测定的细胞置于96孔培养板中培养。采用含15％新生小牛血清的M199培养基，细胞密度为10⁶/cm³，放入CO₂孵箱培养，取培养第3天而且生长良好的脑细胞供实验用。将培养的细胞换用高纯氮(99.999％)饱和的无糖Hanks液，密闭培养，造成缺氧环境。持续缺氧一段时间后换用正常含糖的Hanks液(95％空气+5％CO₂)培养30分钟，造成缺氧-再给氧损伤模型。将试验分为6组，分别于开始缺氧处理前给药：A、不缺氧的对照组；B、单纯缺氧-再给氧组；C、缺氧-再给氧+化合物I 25mg/L；D、缺氧-再给氧+化合物I 50mg/L；E、缺氧-再给氧+化合物I 100mg/L；F、缺氧-再给氧+尼莫地平25mg/L。所有数据以x±s表示，以t检验进行显著性检验。

细胞MDA含量及SOD活性测定：细胞缺氧60分钟，再给氧30分钟后，将细胞轻轻刮下，以荧光微量法检测细胞MDA含量，用光化学扩增法测定细胞SOD活性，结果见表4。

细胞内线粒体脱氢酶活性测定：细胞缺氧120分钟，再给氧30分钟后，以MTT法测定细胞光密度(OD)值，结果见表3。

表3不同试验组对缺氧-再给氧脑细胞MDA含量、SOD活性以及OD值的影响

注：与A组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01与B组比较^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01

结果：由表3可知，本发明所述化合物剂量与脑细胞MDA含量、SOD活性呈非常显著正相关，与OD值呈正相关。

试验例4小鼠急性毒性试验

(1)静脉注射给药的急性毒性试验

取健康ICR小鼠50只，体重18-22g，雌雄各半，分为5组，一次静脉注射不同剂量的化合物I，观察小鼠连续7天的状况和死亡情况，记录数据，实验结果见表4，经统计处理得LD₅₀为2.12g/kg。

表4小鼠静脉注射给药LD₅₀结果

(2)口服给药的急性毒性试验

取健康ICR小鼠40只，体重18-22g，雌雄各半。分为单硝酸异山梨醇酯组、化合物I组，口服给药，给药剂量按照人给药剂量的50倍即1g/kg，每天给药1次，连续7天，观察小鼠死亡情况，记录数据，实验结果见表5。

表5小鼠急性毒性实验

上述实验结果表明：化合物I与单硝酸异山梨醇酯比较具有更好的安全性。

另取健康ICR小鼠50只，体重18-22g，雌雄各半，分为5组，依次口服不同剂量的化合物II，观察小鼠连续7天的状况和死亡情况，记录数据，实验结果见表6，经统计处理得LD₅₀为5.12g/kg。

表6小鼠口服给药LD₅₀结果