三尖杉离体胚培养及植株再生方法

摘要

本发明提供一种三尖杉离体胚培养及植株再生方法，属于三尖杉的培养技术。本发明要解决现有技术中三尖杉种子休眠时间长、苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗的问题，选取当年籽粒饱满的种子为材料，经过诱导培养，15～20天胚即可萌发出生长健壮的新芽；再经过20～25天的增殖，25～30天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高达90％以上；扩繁系数高，苗木成活后长势良好，健壮挺拔。

说明书

技术领域

本发明属于三尖杉的培养技术，更具体涉及一种三尖杉离体胚培养及植株再生方法。

背景技术

三尖杉属三尖杉科三尖杉属常绿乔木，为我国特有珍稀树种，共有9种，我国有8种，其中福建省内有3种。其叶形似杉，但柔软不刺手，枝端冬芽呈三角排列，春天小枝分三叉生长，故名三尖杉。该树婆娑多姿，端庄秀丽，形态奇特，叶背有两条银白色的气孔带，微风吹拂，银光耀眼，具有独特风姿。三尖杉木材坚实，纹理直，结构慎密，适合做高级家具和室内装饰。其种子出油率高，可应用于工业。此外，三尖杉的根、茎、叶、皮、果中均含有多种生物碱，特别是其中的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱(简称双酯碱)对治疗血癌和淋巴肉瘤有特殊疗效，近年来备受医学界关注。但由于三尖杉植物对环境条件要求较特殊，自然资源稀少，加之其为雌雄异株，结实量少，分布区域比较狭窄，因此难以满足临床上日益增长的需求和规模化生产的需要。由于三尖杉种子属于生理休眠性种子，休眠时间长达一年以上，致使育苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗。宁蒗县林业局及林科所等单位开展了播种育苗方法研究，对种子进行层积催芽，提高了种子的发芽率，但仍无法满足实际生产需要和规模化生产要求。在生产中，特别是对其进行药用价值开发时，更不能提供大面积种植的优良纯化组培苗，因此急需成熟的组织培养技术，但在专利公开以前没有一个有关其组织培养的报道，更没有成功的实例。

发明内容

本发明的目的是提供一种三尖杉离体胚培养及植株再生的组织培养方法；解决现有技术中三尖杉种子休眠时间长、苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗的问题，该方法培养的芽健康、茁壮、增殖时间短、成苗移植后的成活率高，苗木成活后生长健壮，长势良好，具有显著的经济效益。

本发明的技术内容为：三尖杉离体胚培养及植株再生方法的具体步骤包括：

1)取材方法：选取当年籽粒饱满的三尖杉种子，采摘后用湿布包好，置于4℃下暂存；

2)培养基的配制：在基本培养基为MS中分别添加生长激素：IBA、NAA、IAA、ZE(玉米素)或KT中的几种，分别配置成芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基，所述这些培养基中还加入Su为25g/L，Ag⁺为7～7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac；所述这些培养基的厚度为1.4～1.6cm；

3)材料消毒处理：将4℃下暂存的三尖杉种子用洗涤剂漂洗干净，用自来水滴冲3个小时，在超净工作台内用重量浓度为75％的酒精消毒消毒30秒钟，用0.1％升汞HgCl₂消毒15分钟，无菌水冲3～4遍，消毒滤纸吸干表面水分；

4)诱导培养：用眼科镊和手术刀在无菌的条件下取生长饱满的胚，直接接种于所述芽诱导培养基上；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000Lx；诱导培养的时间15～20天；

5)增殖培养：将经过诱导培养的生长健壮的三尖杉幼苗切成带腋芽的茎段，接种在所述芽增殖培养基中，进行大量繁殖；100～150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000Lx；增殖培养的时间20～25天；

6)诱导生根：将步骤5)增殖培养培养出来的长到3cm以上的无根幼苗单株切下，带有2～3片叶子，转移到所述生根培养基中；100～150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000Lx；生根培养的时间25～30天；

7)试管苗完成：当试管苗长至3～4cm高，有2～3条形态正常的根，有完整须根，长度2～3cm时，完成三尖杉胚的离体培养及植株再生试管苗培养。

8)试管苗移栽：所述步骤7)的完成的三尖杉试管苗进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3～5天后打开瓶盖，3天后取出苗，洗去根部培养基，移入装有珍珠岩、土壤(质量比)1∶1混合的基质中，保湿遮阴，3周后成活率可达90％以上。

本发明的显著优点是：采用本发明方法进行，胚经过诱导培养，15～20天即可萌发出生长健壮的新芽；再经过20～25天的增殖，25～30天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高达90％以上；扩繁系数在16倍以上，苗木成活后生长健壮，长势良好，基本上解决了中三尖杉种子休眠时间长、苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗的问题，具有显著的经济效益。

附图说明

图1胚状体形成的芽苗

图2胚芽增殖形成的植株

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例

取材方法：选取当年籽粒饱满的三尖杉种子，采摘后用湿布包好，置于4℃下暂存。

培养基：

MS基本培养基采用1986，北京高等教育出版社出版，陈正华主编的《木本植物组织培养及其应用》中的配方进行配制的。

培养基的配制：基本培养基为MS，加入生长激素为IBA、NAA、IAA、ZE(玉米素)、KT(植物激素)，培养基中加入Su(蔗糖)为25g/L，Ag⁺为7～7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac；培养基厚度一般为1.4～1.6cm；

芽诱导培养基→MS+ZE(2.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+IAA(1.0mg/L)+Ag⁺(7～7.5g/L)+Su(25g/L)+Ac(2～2.5g/L)；

芽增殖培养基→MS+ZE(2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)+IAA(1.0mg/L)+Ag⁺(7～7.5g/L)+Su(25g/L)+Ac(2～2.5g/L)；

生根培养基→1/2MS+NAA(0.5mg/L)+IBA(1.0mg/L)+KT(0.3mg/L)+Ag⁺(7～7.5g/L)+Su(25g/L)+Ac(2～2.5g/L)；

这些培养基中Ag⁺的来源于AgNO₃。

基本培养基1/2MS是指：MS中大量元素减半，其余不变。

材料消毒处理：三尖杉种子采摘后用湿布包好，置于4℃下暂存。带回实验室后用洗涤剂漂洗干净，用自来水冲洗3个小时后把水沥干，在超净工作台内以75％的酒精消毒消毒30秒钟，用0.1％升汞(HgCl₂，该0.1％升汞配制为1克升汞加1000毫升蒸馏水)消毒15分钟，无菌水冲3～4遍，消毒滤纸吸干表面水分。

诱导培养：用眼科镊和手术刀在无菌的条件下取生长饱满的胚，直接接种于所述芽诱导培养基上；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000Lx；诱导培养的时间15～20天；

增殖培养：将经过诱导培养的生长健壮的三尖杉幼苗切成带腋芽的茎段(2叶2芽，接种在所述芽增殖培养基中，进行大量繁殖；100～150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000Lx；增殖培养的时间20～25天；

诱导生根：将增殖培养养出来的长到3cm以上的无根幼苗单株切下，带有2～3片叶子，转移到所述生根培养基中；100～150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000Lx；生根培养的时间25～30天；

试管苗完成：当试管苗长至3～4cm高，有2～3条形态正常的根，有完整须根，长度2～3cm时，完成三尖杉胚的离体培养及植株再生培养。

试管苗移栽：完成的三尖杉试管苗进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3～5天后打开瓶盖，3天后取出苗，洗去根部培养基，移入装有珍珠岩、土壤(质量比)1∶1混合的基质中，保湿遮阴，3周后成活率可达90％以上。