三尖杉细胞培养及其三尖杉酯碱次生代谢的研究

摘要

三尖杉(Cephalotaxus fortunei Hook．f.)是我国特有的树种之一，其枝叶、树皮等提取的多种生物碱被临床证明是一种新型的抗癌药物，同时又是材用和园林绿化用的优良树种。然而，三尖杉植物生长缓慢，自然资源有限，有效生物碱含量低，无法满足临床上日益增长的需要。本研究运用植物细胞培养技术，分别对三尖杉愈伤组织的诱导，愈伤组织培养体系和悬浮细胞培养体系的建立及其三尖杉酯碱次生代谢的调控等方面进行研究，为进一步扩大培养生产抗癌药物提供实验基础。主要研究结果如下： 1．愈伤组织诱导：三尖杉愈伤组织较容易诱导，各种培养基很大范围内都可以产生愈伤组织。最佳愈伤组织诱导培养基为：MS+NAA3.0mg/L+6-BA0.1mg/L。三尖杉外植体取材应选择在3-5月刚抽梢出来的茎段，其愈伤组织诱导率最高达89.93％，且外植体的污染率低。 2．愈伤组织继代培养：在继代培养中，以愈伤组织诱导培养基为基础，研究了基本培养基、蔗糖浓度、愈伤组织接种量、培养基pH值和植物激素对三尖杉愈伤组织生长的影响。结果表明，以6,7-V为基本培养基+NAA3.0mg/L+6-BA0.1mg/L，蔗糖30g/L，pH值为5.8的培养基，接种量为2.0g·40mL<'-1>的条件下，愈伤组织增殖效果最好。 3．愈伤组织培养中三尖杉酯碱代谢的调控：研究了愈伤组织培养中培养条件及天然有机营养物质对三尖杉酯碱代谢的影响。试验结果显示：MS基本培养基可以促进愈伤组织中三尖杉酯碱含量的增加，而6,7-v基本培养基可促进愈伤组织生物量的增加；添加0.1g/L蛋白胨时，愈伤组织干重增长率最高达到448.18％，但三尖杉酯碱含量并没有明显增加；添加0.1g/L的水解酪蛋白不仅愈伤组织干重增长率达到405.54％，而且三尖杉酯碱的含量也高达16.8μg·g<'-1>。 4．悬浮细胞培养体系的建立：在悬浮细胞培养中，蔗糖浓度低于30g/L时有利于细胞生长；摇床转速为80r·min<-1>，pH为5.8的培养条件有利细胞生长；高的细胞接种量(2.0g·30mL<'-1>)有利于细胞生物量合成；以6,7-v为基本培养基，添加3.0mg/L的NAA和0.01-0.05mg/L的6-BA组成的培养基，每30d继代一次，成功地建立三尖杉悬浮细胞培养体系，细胞增长率达到665.51％。 5．悬浮细胞培养中三尖杉酯碱代谢的调控:研究了培养条件、三尖杉酯碱代谢前体以及诱导子对三尖杉酯碱代谢的影响。结果表明以MS为基本培养基有利于三尖杉酯碱的代谢；培养基起始pH值为6.2时，三尖杉酯碱的代谢量最高；添加酪氨酸0.1mg/L苯丙氨酸0.5mg/L的代谢前体能显著提高三尖杉酯碱的代谢，三尖杉酯碱的含量(8.5μg·g<'-1>)比对照提高了77％；诱导子水杨酸和苯甲酸钠可以刺激三尖杉酯碱的代谢，而添加GA，并没有促进三尖杉酯碱含量的增加。

目录

论文说明：缩略词及专业名词

声明

摘要

1前言

2文献综述

2.1植物次生代谢的组织(细胞)培养技术研究进展

2.1.1影响植物组织(细胞)培养中次生代谢的因素

2.1.2提高植物次生代谢方法

2.2三尖杉属植物研究现状

2.2.1三尖杉属植物的形态特征和野生资源分布情况

2.2.2三尖杉属植物繁殖技术研究

2.2.3三尖杉体内生物碱的研究

3材料与方法

3.1试验材料

3.2试验操作技术

3.2.1愈伤组织培养试验操作技术

3.2.2三尖杉悬浮细胞培养试验操作技术

3.3试验设计

3.3.1三尖杉愈伤组织诱导试验

3.3.2三尖杉愈伤组织培养和次生代谢物调控试验

3.3.3三尖杉悬浮细胞培养的优化试验

3.3.4三尖杉悬浮细胞培养中三尖杉酯碱次生代谢调控研究

3.4试验分析方法

3.4.1愈伤组织诱导中感染率测定

3.4.2愈伤组织诱导率测定

3.4.3愈伤组织生物量测定

3.4.4三尖杉悬浮细胞培养参数的测定

3.4.5愈伤组织和悬浮细胞体内三尖杉酯碱的提取及含量测定

4结果与分析

4.1愈伤组织诱导

4.1.1外源激素对愈伤组织诱导的影响

4.1.2外植体来源和基本培养基对愈伤组织诱导的影响

4.1.3取材季节和取材部位对外植体感染率和愈伤组织诱导率的影响

4.2愈伤组织培养及三尖杉酯碱代谢的调控

4.2.1蔗糖浓度、接种量和pH值对愈伤组织生长的影响

4.2.2植物生长素对愈伤组织生长的影响

4.2.3基本培养基对愈伤组织生长及三尖杉酯碱含量的影响

4.2.4天然有机物对愈伤组织生长及其三尖杉酯碱含量的影响

4.2.5愈伤组织生长曲线

4.3三尖杉悬浮细胞培养的研究

4.3.1细胞生长曲线和三尖杉酯碱含量变化曲线的研究

4.3.2接种量、摇床转速和蔗糖浓度对三尖杉细胞生长的影响

4.3.3pH值对细胞生长及其三尖杉酯碱含量的影响

4.3.4基本培养基对细胞生长及其三尖杉酯碱含量的影响

4.3.5前体对细胞生长和三尖杉酯碱代谢的影响

4.3.6诱导子对三尖杉酯碱合成的影响

5结论

5.1愈伤组织诱导

5.2愈伤组织培养及次生代谢产物的调控

5.3三尖杉悬浮细胞培养及三尖杉酯碱代谢研究

5.4三尖杉愈伤组织和悬浮细胞培养细胞生长周期的研究

6讨论

6.1三尖杉愈伤组织诱导

6.2三尖杉愈伤组织培养及三尖杉酯碱的代谢

6.3悬浮细胞培养体系的建立

6.4悬浮细胞培养中三尖杉酯碱代谢调控的探讨

参考文献

致 谢

图版