异三尖杉酯碱(isoharringtonine)对三阶性乳腺癌的抑制作用研究

摘要

在乳腺癌所有亚型中，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是恶性程度较高的一种，在临床上表现为高转移，高复发和低治愈率的特点。由于缺乏ER受体、PR受体和HER2受体不表达或低表达，因此靶向特异受体的激素治疗无法应用于TNBC的治疗。新辅助治疗方案是用于TNBC治疗的主要手段，并在临床上取得了一定的治疗效果，但是所用的化疗药物会诱使肿瘤细胞产生药物耐药性和无法克服乳腺癌的复发问题。而目前的肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞是肿瘤细胞中能够自我更新，分化和增殖，起始肿瘤的发生，具有类似正常干细胞特性的一小群细胞，因而又被称为肿瘤起始细胞(tumor initiation cells，TICs)，对肿瘤的发生发展，肿瘤的耐药性，肿瘤的复发起至关重要的作用。因此，对于肿瘤干细胞和靶向乳腺癌干细胞药物的研究成为日益受关注的焦点。
　　多种信号通路参与肿瘤干细胞的调控，相关的信号通路主要有以下几种:Wnt信号通路、Notch信号通路、Hedgehog信号通路、TGF-β/BMP信号通路以及Jak/Stat信号通路等。例如Wnt信号通路促进干细胞相关的转录因子NANOG,SOX2和OCT4表达，而STAT3能够与NANOG的启动子区结合启动NANOG的转录，从而影响的细胞的干性。在乳腺癌中，对与乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)群CD44+CD24-细胞的稳态维持，JAK2/STAT3信号通路是必须的。
　　异三尖杉酯碱(isoharringtonine，IHT)，是一种从三尖杉(Cephalotaxus harringtonia)中提取的生物酯碱类化合物，与高三尖杉酯碱(homoharringtonine，HHT)是类似物。目前关于IHT的研究报道甚少，而对于HHT的研究则很多。在临床上，HHT主要用于骨质增生综合征，慢性白血病和急性白血病的治疗。HHT可以促进细胞的凋亡和抑制JAK1/STAT3信号通路。虽然关于HHT对乳腺干细胞的作用效果并没有研究，但是其作用机制暗示了HHT可能会抑制BCSCs，IHT对肿瘤干细胞也有抑制效果，机制也可能相似。在本研究中，基于IHT与HHT的结构的不同，我们探究了IHT对乳腺癌细胞干细胞的抑制作用和机制。
　　目前TNBC的治疗药物会诱使乳腺癌于细胞的增加而改变乳腺的异质性提高对治疗药物的耐药性，如紫杉醇，且并不能抑制乳腺癌的复发。而目前认为乳腺癌干细胞参与起始乳腺的发生发展，乳腺细胞的转移，免疫系统的逃逸和对转移灶微环境的改造，由于上述因素进而导致乳腺癌化疗药物的耐药性，因此靶向乳腺癌干细胞的治疗方案成为克服以上问题的一个研究关注点。本研究通过MTS实验检测IHT对TNBC细胞增殖的作用，wound healing assay实验分析IHT对细胞迁移的影响，流式细胞术探究IHT对TNBC癌干细胞的抑制效果以及对STAT3蛋白水平和NANOG的转录水平检测揭示IHT可能的机制。结果显示，在0nM到300nM和0nM到600nM浓度范围内的IHT处理细胞24h后，IHT可以抑制TNBC细胞系HCC1806和HCC1937细胞的增殖，随着浓度升高，抑制效果越显著，而在此浓度范围内并不引起HCC1806或HCC937的凋亡或死亡。同样的浓度和处理条件下，IHT不仅对HCC1806或HCC1937细胞的迁移有显著的抑制效果，而且也能减少细胞群中BCSCs(CD44+CD24-)细胞的比例，soft-agar clone和tumorsphere形成分析佐证了流式细胞术的结果。Western blot的检测结果发现，在以上浓度的IHT处理HCC1806或HCC1937细胞24h后，p-STAT3的水平显著下降，同时我们检测了STAT3的下游基因NANOG的转录水平，发现NANOG的转录受抑制效果显著，而NANOG是肿瘤干细胞的稳态维持的关键转录因子，虽然IHT的机制与HHT类似，能够抑制STAT3的蛋白水平，但不同的是，IHT并不导致细胞的凋亡。虽然在蛋白水平并未检测到EMT标记分子和细胞周期蛋白的变化，但根据结果分析，IHT很可能通过对STAT3/NANOG信号通路的抑制达到对BCSCs的抑制，而变现为抑制TNBC的增殖和迁移。在动物模型实验中，单独使用IHT对TNBC并无效果。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 三阴性乳腺癌

1．2 乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)

1．3 肿瘤干细胞与分子标记

1．4 BCSCs与细胞干性调节通路

1．4．1 BeSts与Writ信号通路

1．4．2 BCSCs与Notch信号通路

1．4．3 BCSCs与Hedgehog信号通路

1．4．4 BCSCs与TGF-β／BMP信号通路

1．4．5 BCSCs与Jak／Stat信号通路

1．4．6 Jak／Stat信号通路抑制剂

1．6 研究目的与意义

第二章 IHT对TNBC细胞的抑制作用

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 化合物

2．2．2 细胞

2．2．3 主要试剂

2．2．4 主要仪器

2．2．5 主要溶液与其配制

2．3 实验方法

2．3．1 MTS检测细胞的增殖

2．3．2 Wound healing assay检测IHT对TICBC细胞迁移抑制

2．3．3 检测IHT对TNBC细胞soft-agar clone的抑制作用

2．3．4 分析IHT对TNBC细胞中BCSCs的影响——CD44和CD24双染检测

2．3．5 Tumorsphere形成分析检测IHT对HCC937细胞中的BCSCs影响

2．3．6 Western blot检测IHT对STAT3蛋白水平的影响

2．3．7 RT-qPCR检测NANOG的mRNA水平

2．4 实验结果

2．4．1 IHT抑制TNBC细胞的增殖

2．4．2 IHT抑制TNBC细胞的迁移

2．4．3 IHT抑制HCC1806细胞的soft-agar clone的形成

2．4．4 IHT减少TNBC细胞中BCSCs的比例

2．4．5 IHT下调p-STAT3而抑制NANOG的转录

2．5 讨论

参考文献

附表

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文