在NADH或NADPH存在的条件下使用氧化还原酶/脱氢酶通过对映体选择性酶促还原开环二酮衍生物来制备开环醇衍生物的方法

摘要

本发明涉及通式I的开环二酮(Secodion)衍生物的对映体选择性酶促还原方法，其中环结构不包括杂原子、包括一个杂原子或包括数个杂原子，R

说明书

本发明涉及通式I的开环二酮(Secodion)衍生物的对映体选择性 酶促还原方法，其中在NADH或NADPH作为辅因子存在的条件下开环 二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原。

甾族激素的工业制备存在两条彼此独立的路线，即，一方面，从天 然存在的植物来源的甾族化合物开始，和另一方面，从前手性前体通过 对映体选择性合成的完全合成方式。在这两条路线中，甾族化合物全合 成是日益重要的，尤其是因为它还允许引入天然存在的甾族化合物不具 有的结构单元。

对映体纯的甾族化合物的全合成的关键组分是通式I的化合物，其 还被称为开环甾族化合物(Secosteroide)，8，14-开环-甾-四烯-14，17-二 酮(8，14-seco-gona-tetraen-14，17-dione)或开环二酮。这组的具体代表物 是诸如化合物甲基开环二酮(式II，13-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-甾 -1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮)和乙基开环二酮(式III，13-乙基-3-甲氧 基-8，14-开环-甾-1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮)，从这些化合物例如可 以制备具有药理学活性的化合物乙炔基雌甾二醇(式IV)和炔诺孕酮(式 V)。

式II                                  式III

式IV                                    式V

制备对映体纯的甾族化合物的关键步骤是通过将酮基团之一对映 体选择性还原成羟基，使式I(例如，II和III)的化合物转化为具有预先 形成的不对称C-13的光学活性化合物。随后可以通过环化将获得的光 学活性羟基开环甾族化合物(开环醇(Secole)，式VI到IX)进一步加工 为手性甾族化合物，同时保持手性。

通过式I化合物的酮基团的对映体选择性还原，理论上可以形成4 种光学活性化合物(式VI到IX)。

式VI的化合物(其中在第17位羟基显示β-构型)是尤其具有经济 利益的，因为它们产生天然雌酮的衍生物。这种化合物还被称为17-β- 羟基开环甾族化合物。

尤其在十九世纪六七十年代充分研究了借助于不同的微生物对通 式I的开环二酮衍生物的立体选择性还原。由此，能够证明假丝酵母属 (Candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、克勒克酵母属(Kloeckera)、 毕赤酵母属(Pichia)、隐球酵母属(Cryptococcus)、红酵母属 (Rhodotorula)、球拟酵母属(Torulopsis)和汉逊氏酵母属(Hansenula) 的不同酵母菌株能够将开环二酮还原成各种羟基化合物(US 3616226， US 1252524，US 3616225)。

尤其是，酵母属(Saccharomyces)的酵母，诸如葡萄汁酵母(S.uvarum) 可有利的用于制备例如相应的17-β-羟基开环甾族化合物(Kosmol等人； Liebigs Ann.Chem.701，199(1967))。其他酵母菌株诸如Saccharomyces drosophilarum优选地将开环二酮还原成对应的14-α-羟基开环甾族化合 物(Acta microbiol.Acad.Sci.hung.22，463-471(1975))。此外，还描述了 通过苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)还原开环二酮形成14-α-羟 基开环甾族化合物(Kosmol等人；Liebigs Ann.Chem.701，199(1967))。

在世界范围内孕激素和雌激素试剂被广泛用作避孕剂并在激素替 代疗法中使用。到目前为止雌激素和孕激素衍生物的大部分合成还基于 上述反应原理，其中的关键步骤是将开环二酮对映体选择性还原为相应 的17-β-羟基开环甾族化合物。

在这种情况下，迄今都是利用毕赤酵母属或酵母属的不同酵母菌株 以全细胞生物转化形式进行开环二酮衍生物的立体选择性还原。但是， 这些方法具有缺点，即只能实现远低于1％(通常从1到5g/l)的极低底 物浓度(US 3697379；Current Science，1984年2月5日，第53卷.第3期， 第124页；Indian Journal of Experimental Biology，第27卷，1989年8月， 第742-743页)。因此，尤其是大体积反应产物的再处理和分离及大量生 物质的分离变得非常复杂。就本发明人所知，到目前为止还没有分离、 鉴定和描述参与还原的酶。并且，还没有鉴定出编码氧化还原酶(通过 该氧化还原酶可以还原开环二酮衍生物)的DNA序列。

因此，本发明的目的是提供一种可以对映体选择性还原通式I的开 环二酮衍生物(尤其是式II和III的开环二酮衍生物)的方法。由此尤 其还应当可以制备相应的17-β-羟基开环甾族化合物。

第一个方面，根据本发明通过通式I的开环二酮衍生物的对映体选 择性酶促还原方法实现所述目的，

其中环结构不包括杂原子、包括一个杂原子或包括数个杂原子，

R₁是氢或C₁-C₄烷基，

R₂是氢、C₁-C₈烷基或现有技术已知的对OH的保护基，诸如酯，

R₃是氢、甲基或卤化物

所述结构单元

表示苯环或具有0、1或2个C-C双键的C₆环，

任选地在第6/7或7/8位包括双键，和

第1、2、4、5、6、7、8、9、11、12和16位的碳独立地被氢、C₁-C₄烷基、卤化物或苯基取代，

其中在NADH或NADPH作为辅因子存在的条件下开环二酮衍生物 被氧化还原酶/脱氢酶还原，

该方法的特征在于在反应批料中使用的开环二酮衍生物浓度≥10 g/l，并且由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD或NADP被连 续再生。

该方法代表了开环二酮衍生物的对映体选择性酶促还原相对于现 有技术的显著改进。本发明方法允许利用远远超过现有技术描述的浓度 范围的游离酶将开环二酮衍生物还原为不同的相应羟基开环甾族化合 物。

第二个方面，根据本发明通过通式I的开环二酮衍生物的对映体选 择性酶促还原方法实现上述目的，其中在NADH或NADPH作为辅因子 存在的条件下开环二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原，该方法的特征 在于所述氧化还原酶/脱氢酶

a)包括与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5至少50％氨基酸相同的氨基酸序列，

b)由核酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10编码，或

c)由严格条件下与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、 SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10杂交的核酸序列编码。

本发明人已经鉴定出能够将开环二酮衍生物还原为羟基开环甾族 化合物并且可以在工业规模上重组产生的氧化还原酶。与目前使用的全 细胞方法相比，按照本发明的方法可以实现显著更高的底物浓度。

在本发明的方法中，具有序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氧化还原酶或可衍生自这些多肽 的多肽可以分别以完全纯化的状态，部分纯化的状态或作为包含多肽 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5 的细胞而被使用。由此，所用细胞可以天然、透化或裂解状态提供。优 选地，氧化还原酶及可由其衍生的衍生物可分别在合适的宿主生物诸如 大肠杆菌(Escherichia coli)中过表达，并且重组多肽被用于通式I的 开环二酮衍生物的还原。

例如从生物橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)DSM 635的基 因组可获得编码具有SEQ ID NO：1的多肽的DNA序列SEQ ID NO：6。

例如从生物Rubrobacter xylanophilus DSM 9941的基因组可获得编 码具有SEQ ID NO：2的多肽的DNA序列SEQ ID NO：7。

从酵母木兰假丝酵母(Candida magnoliae)CBS 6396可获得编码具 有SEQ ID NO：3的多肽的DNA序列SEQ ID NO：8。

例如通过同源性筛选从木兰假丝酵母(Candida magnoliae)DSMZ 70638可获得SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的氧化还原酶。

在严格条件下例如与SEQ ID NO：6杂交的核酸序列应被理解为可以 通过集落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA杂交法或可比较的方法利用SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：6的部分序列作为DNA探针鉴定出的多核苷酸。 为了这个目的，在60℃0.7-1M NaCl溶液中，固定在滤器上的多核苷酸 与诸如SEQ ID NO：6杂交。按照例如分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或类似出版物的描述进行杂交。随后，在65℃用0.1到2倍 SSC溶液洗涤滤器，其中1倍SSC溶液理解为由150mM NaCl和15mM 柠檬酸钠组成的混合物。

在上述严格条件下与序列表的多核苷酸SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10杂交的多核苷酸应 该与多核苷酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10显示至少60％的序列同一性，更好的是同一性为 至少80％，甚至更好的是同一性为95％。

在另一个方面，根据本发明通过通式I的开环二酮衍生物的对映体 选择性酶促还原方法实现上述目的，其中在NADH或NADPH作为辅因 子存在的条件下开环二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原，该方法的特 征在于所述氧化还原酶/脱氢酶长度为230到260个氨基酸，并包括选自 [序列SEQ ID NO：18到SEQ ID NO：42]：

nalvtgasrgig，nalvtggsrgig，nalitggsrgig，nalitgasrgig，nalitggsrgmg，halvtgasrgig，

gysvtla，gynvtla，gysvtlv，gynvtlv，

fkgaplpa，fkaaplpa，

fvsnag，ffsnag，fvcnag，fvanag，

spialtkal，spvaltkti，spialtktl，spvamtkal，sqialtkal，

avysask，avysatk，

pikgwi和pisgwi，

的一个或数个部分序列。

在本发明的方法中，NADH或NADPH被用作辅因子。术语“NADP” 理解为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，“NADPH”理解为还原型烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸磷酸。术语“NAD”表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，术语“NADH” 表示还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

根据所述方法的优选实施方案，在反应批料中使用的开环二酮衍生 物浓度≥10g/l，并且由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD或 NADP被连续再生，所述氧化还原酶/脱氢酶

a)包括与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5至少50％氨基酸相同的氨基酸序列，

b)所述氧化还原酶/脱氢酶由核酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10编码，或

c)所述氧化还原酶/脱氢酶由严格条件下与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10杂交的核酸序列编 码。

根据所述方法另一个优选的实施方案，反应批料中使用的开环二酮 衍生物浓度≥10g/l，并且由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD 或NADP被连续再生，所述氧化还原酶/脱氢酶长度为230到260个氨 基酸，包括选自[序列SEQ ID NO：18到SEQ ID NO：42]：

nalvtgasrgig，nalvtggsrgig，nalitggsrgig，nalitgasrgig，nalitggsrgmg，halvtgasrgig， gysvtla，gynvtla，gysvtlv，gynvtlv，fkgaplpa，fkaaplpa，fvsnag，ffsnag，fvcnag，fvanag， spialtkal，spvaltkti，spialtktl，spvamtkal，sqialtkal，avysask，avysatk，pikgwi和pisgwi 的一个或数个部分序列。

在根据本发明第二和第三个方面的方法中，由氧化还原酶/脱氢酶形 成的氧化的辅因子NAD或NADP优选的被连续再生。

根据本发明所有方法的优选实施方案，通过醇的氧化来再生氧化的 辅因子NAD或NADP。

在这种情况下，伯醇和仲醇诸如乙醇，2-丙醇，2-丁醇，2-戊醇， 3-戊醇，4-甲基-2-戊醇，2-己醇，2-庚醇，2-辛醇或环己醇优选地被用作 共底物。以总体积计，用于再生的共底物比例为5到95％(体积比)。

具有通式R_XR_YCHOH的仲醇优选被用于辅因子再生，其中R_X和 R_Y彼此独立的是氢、分枝或未分枝的C₁-C₈烷基并且C_总数≥3。

根据本发明方法另一个优选的实施方案，还添加氧化还原酶/脱氢酶 用于辅因子的再生。

合适的NADH依赖性醇脱氢酶例如可获自面包酵母，近平滑假丝酵 母(Candida parapsilosis，CPCR)(US 5,523,223和US 5,763,236，Enzyme Microb.Technol.，1993，15(11)：950-8)，Pichia capsulata(DE 10327454.4)， 红串红球菌(Rhodococcus erythropolis，RECR)(US 5,523,223)，褐色诺卡 氏菌(Norcardia fusca)(Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(10)，1999，第 1721-1729页；Appl.Microbiol.Biotechnol，2003，62(4)：380-6；Epub 2003 年4月26日)或赤红球菌(Rhodococcus ruber)(J.Org.Chem.，2003， 68(2)：402-6)。这些醇脱氢酶的合适共底物是，例如，已经提及的仲醇诸 如2-丙醇(异丙醇)，2-丁醇，2-戊醇，4-甲基-2-戊醇，2-辛醇或环己 醇。

用于NADPH再生的合适仲醇脱氢酶是例如上文描述的及从乳杆菌 目生物分离的那些仲醇脱氢酶，诸如高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)(US 5,200,335)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(DE 19610984A1； Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.2000年12月；56 Pt 12：1696-8)，稍 小乳杆菌(Lactobacillus minor)(DE 10119274)，肉色明串珠菌 (Leuconostoc carnosum)(A 1261/2005，Kl.C12N)，或所述来自布氏热 厌氧菌(Thermoanerobiumm brockii)，Thermoanerobium ethanolicus或拜 氏梭状芽孢杆菌(Clostridium beijerinckii)的那些仲醇脱氢酶。

但是，原则上其他酶系统也可用于辅因子再生。例如，可以利用 NAD或NADP依赖性甲酸脱氢酶进行辅因子再生(Tishkov等人，J. Biotechnol.Bioeng.[1999]64，187-193，Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase)。 甲酸脱氢酶的合适共底物是，例如，甲酸盐诸如甲酸铵、甲酸钠或甲酸 钙。

本发明方法获得的TTN(总转换数＝还原的开环二酮化合物的摩尔 数/使用的辅因子的摩尔数)范围通常是10²到10⁵，但是优选≥10³。

根据优选的实施方案，在含水有机两相系统中实施本发明的方法。

因此，开环二酮衍生物的转化发生在两相系统中，其包含诸如，用 于辅因子再生的2-醇、氧化还原酶、水、辅因子和开环二酮化合物。但 是，还可以包括另外的有机溶剂，这些有机溶剂不参与辅因子再生，即， 不包含任何可氧化的羟基。二乙醚、叔丁基甲醚、二异丙醚、二丁醚、 醋酸乙酯、醋酸丁酯、庚烷、己烷、甲苯、二氯甲烷、环己烷或其混合 物优选被用作另外的有机溶剂。

因此，两相系统中不可与水共混的有机组分的比例相对于反应批料 总体积可以为10％到90％，优选20％到80％。水相的比例相对于反应批 料总体积可以为90％到10％，优选80％到20％。

还可以向水中添加缓冲剂，诸如，磷酸钾、Tris/盐酸、甘氨酸或三 乙醇胺缓冲剂，其pH值为5到10，优选的6到9。此外，所述缓冲液 可以包含稳定或活化上述两种酶的离子，诸如，镁离子或锌离子。

此外，在本发明方法中可以使用稳定所用酶的其他添加剂，例如， 甘油，山梨糖醇，1，4-DL-二硫苏糖醇(DTT)或二甲基亚砜(DMSO)。

根据水相计算，辅因子NAD(P)H的浓度为0.001mM到10mM，尤 其是0.01mM到1.0mM。根据所用酶的特性，温度可以是10℃到70℃， 优选20℃到35℃。

通常，有待还原的开环二酮衍生物难溶于水。因此，在反应期间底 物可以以完全或不完全溶解状态存在。如果底物不完全溶于反应混合 物，则底物的一部分以固体形式存在，从而可以形成第三固相。在转化 期间反应混合物还可能暂时形成乳状液。

在本发明的方法中，按总体积计算，反应批料中使用的通式I的开 环二酮衍生物的量优选为10g/l到500g/l，更优选为25g/l到300g/l， 尤其优选为50g/l到200g/l。

本发明优选实施方案的特征还在于13-乙基-3-甲氧基-8，14-开环-甾 -1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮(乙基开环二酮-式III)或13-甲基-3-甲氧 基-8，14-开环-甾-1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮(甲基开环二酮-式II)被 用作开环二酮衍生物。

在例如由玻璃或金属制成的反应容器中实施本发明的方法。为了这 个目的，将组分分别转移入反应容器，并在例如氮气或空气的气氛中搅 拌。根据使用的开环二酮化合物及氧化还原酶，反应时间为1小时到7 天，尤其是2小时到48小时。在此期间，至少50％的开环二酮化合物 被还原为对应的羟基开环甾族化合物。

下面，将通过实施例更详细的阐述本发明。

实施例1

从橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auratiacus)DSM 635克隆氧化还原酶

A)橙色绿屈挠菌DSM 635的培养

在48℃光照环境的细菌培养箱中，橙色绿屈挠菌DSM 635的细胞 在下列培养基(pH 8.2)中培养：0.1％酵母抽提物，0.1％甘氨酰甘氨酸， 0.01％Na₂HPO₄x2H₂O，0.01％MgSO₄x7H₂O，0.01％KNO₃，0.05％ NaNO₃，0.01％NaCl，0.005％CaCl₂x2H₂O，5ml 0.01％Fe(III)柠檬酸 盐溶液，1ml痕量元素溶液SL-6[500μl/l H₂SO₄，2.28g/l MnSO₄xH₂O， 500mg/l ZnSO₄x7H₂O，500mg H₃BO₃，25mg/l CuSO₄x5H₂O，25mg/l Na₂MoO₄x2H₂O，45mg/l CoCl₂x6H₂O]。在培养的第12天，通过离 心从培养基分离细胞，并在-80℃保存。

B)扩增编码选择性氧化还原酶的基因

按照Manniatis&Sambrook的“Molecular Cloning(分子克隆)”中描 述的方法提取基因组DNA。获得的核酸用作含特异性引物的聚合酶链式 反应(PCR)的模板，所述特异性引物源自NCBI数据库编号76258197公 开的基因序列。在这种情况下，引物在其5′末端分别配置有核酸内切酶 Nde I和Hind III或Sph I的限制性酶切位点(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13)，以便随后克隆入表达载体。

在含有500ng基因组DNA的PCR缓冲液[10mM Tris-HCl，(pH 8.0)； 50mM KCl；10mM MgSO₄；1mM dNTP Mix；在每一情形下20pMol引 物和2.5U Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)]中和如下温度循环进行 扩增：

循环1：94℃，2min

循环2x30：94℃，30sec

56℃，30sec

68℃，60sec

循环3：68℃，7min

4℃，∞

获得的大小约750bp的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上纯化后分别用 核酸内切酶Nde I和Hind III或核酸内切酶Sph I和Hind III限制性酶切， 将其分别连接入pET21a载体(Novagen)或pQE70载体(Qiagen)的骨架(该 骨架已经用相同的核酸内切酶处理)。将2μl连接批料转化入大肠杆菌 Top 10 F′细胞(Invitrogen)后，分别通过核酸内切酶Nde I和Hind III或核 酸内切酶Sph I和Hind III的限制性分析检测氨苄青霉素(或卡那霉素)抗 性菌落的质粒DNAs中大小为750bp的插入物的存在。来自所述片段阳 性的克隆的质粒制品被用于序列分析，随后将其分别转化入大肠杆菌 BL21 Star(Invitrogen)和大肠杆菌RB791(genetic stock，Yale)。

实施例2

重组绿屈挠菌氧化还原酶在大肠杆菌中的表达

用表达构建体转化的大肠杆菌菌株BL21 Star(Invitrogen，Karlsruhe， 德国)和RB791(E.coli genetic stock，Yale，USA)分别在含有氨苄青霉素 (50μg/ml)或羧苄青霉素(50μg/ml)的200ml LB-培养基(1％胰蛋白胨， 0.5％酵母抽提物，1％NaCl)中培养，直至550nm测量的光密度(OD)达 到0.5。通过添加浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组 蛋白的表达。在25℃和220rpm诱导8小时或16小时后，收获细胞并 冷冻于-20℃。为了进行活性试验，将10mg细胞与500μl 100mM TEA 缓冲液pH 7.0和500μl玻璃珠混合，利用球磨机消化10分钟。然后所 获裂解物在稀释状态下进行相应的测量。活性试验组成如下：870μl 100 mM TEA缓冲液pH 7.0，160μg NADH，10μl稀释的细胞裂解物。通过 向反应混合物中添加100μl 100mM底物溶液开始反应。

为了大量回收酶，将30g细胞重悬于150ml三乙醇胺缓冲液(100 mM，pH 7，2mM MgCl₂，10％甘油)，并使用高压匀浆器消化。随后，将 酶溶液与150ml甘油混合，-20℃保存。

实施例3

生物的培养及乙基开环二酮(式III)还原转化后的筛选

为了进行筛选，酵母菌株粉状毕赤氏酵母(Pichia farinosa)DSM 70362，Candida gropengiesseri MUCL 29836，Candida vaccinii CBS 7318， 粉状毕赤氏酵母(Pichia farinosa)DSM 3316，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CBS 1508和木兰假丝酵母(Candida magnoliae)CBS 6396在 下列培养基中培养：酵母抽提物(5)，蛋白胨(5)和葡萄糖(20)(括号中数 字的单位都是g/l)。培养基在121℃灭菌，酵母在25℃140转每分的摇 床上培养，无需进一步的pH调节。

在下列全细胞生物转化批料中检测式III的乙基开环二酮向对应羟 基开环甾族化合物的还原转化：将一批次中400mg新收获的细胞与50 mg葡萄糖、10mg式III的乙基开环二酮和900μl 100mM三乙醇胺缓 冲液(TEA)pH 7.0在28℃和1400rpm振荡24小时。随后，所述批料用 1ml二氯甲烷抽提，离心，用氮气干燥，在容纳于乙腈后进行HPLC分 析。

筛选结果概述于表1。

表1

菌株CBS 6396显示乙基开环二酮的最高转化，因此被挑选为制备 cDNA文库的起始生物。

实施例4

从木兰假丝酵母CBS 6396制备cDNA文库及克隆氧化还原酶

A)cDNA文库的分离(全部和mRNA)及制备

将600mg新鲜细胞重悬于2.5ml冰冷却的LETS缓冲液。向所述 细胞悬液中添加5ml(约20g)玻璃珠，所述玻璃珠已用硝酸洗涤并用3 ml苯酚平衡(pH 7.0)。全体批料交替经30秒的涡旋和30秒的冰上冷却 处理，共10分钟。随后，添加5ml冰冷却的LETS缓冲液，再将其激 烈涡旋混合。在4℃将所述细胞悬液用11000g离心5分钟。回收水相， 并用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(24∶24∶1)抽提两次。然后用氯仿抽 提。在最后一次抽提后，在-20℃通过添加1/10体积的5M LiCl₂沉淀总 RNA 4小时。

将获得的1mg总RNA通过Oligo-dT纤维素(NEB Biolabs)以富集 mRNA分子。在随后的沉淀后，5μg mRNA用于cDNA合成(pBluescript IIXR cDNA文库构建试剂盒，Stratagene)。按照制造商的说明书将构建的 文库转化入XL-10 Gold大肠杆菌并筛选ADH的活性。利用NADPH或 NADH分别作为辅因子和乙基开环二酮(式III)作为底物，根据吸光度的 降低鉴定并分离出克隆(cM4)。利用引物T7和引物T3测序从所述克隆 分离的质粒，获得789bp的ORF。所述片段编码大小为262个氨基酸的 融合蛋白，由β-半乳糖苷酶的a-片段和推定的短链醇脱氢酶序列组成。

B)通过PCR合成编码来自木兰假丝酵母CBS 6396的短链ADH的 全长转录物

构建特异性引物用于后续将全长转录物克隆入合适的表达系统。在 这种情况下，分别具有Nde I和Sph I识别序列的5′引物和分别具有XhoI 和SacI识别序列的3′引物被修饰(SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17)。从木兰假丝酵母表达文库的克隆(cM4)分离的质 粒DNA用作聚合酶链式反应的模板。在含有50ng模板的PCR缓冲液 [10mM Tris-HCl，(pH 8.0)；50mM KCl；10mM MgSO₄；1mM dNTP Mix； 在每一情形下20pMol引物和2.5U Platinum Pfx DNA聚合酶 (Invitrogen)]中和下面温度循环条件下进行扩增：

循环1：94℃，2min

循环2x30：94℃，15sec

58℃，30sec

68℃，75sec

循环3：68℃，7min

4℃，∞

获得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上纯化后分别用核酸内切酶Nde I和Xho I或核酸内切酶Sph I和Sac I限制性酶切，将其分别连接入 pET21a载体(Novagen)或pQME70载体的骨架(该骨架已经用相同的核酸 内切酶处理)。将2μl连接批料转化入大肠杆菌Top 10 F′细胞(Invitrogen) 后，分别通过核酸内切酶Nde I和Xho I或核酸内切酶Sph I和Sac I的 限制性分析检测氨苄青霉素(或卡那霉素)抗性菌落的质粒DNAs中大小 为750bp的插入物的存在。对表达构建体pET21-MgIV和pQME70-MgIV 进行测序。编码短链氧化还原酶的木兰假丝酵母基因具有共729bp(包 含于SEQ ID NO：8)的开放阅读框，其对应于243个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：3)。

实施例5

重组氧化还原酶在大肠杆菌细胞中的表达

用分别编码氧化还原酶的表达构建体pET21-MgIV和 pQME70-MgIV分别转化感受态的大肠杆菌StarBL21(De3)细胞 (Invitrogen)和RB791细胞(大肠杆菌genetic stock，Yale，USA)。然后将用 表达构建体转化的大肠杆菌菌落分别在200ml含有50μg/ml氨苄青霉 素或40μg/ml卡那霉素的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物， 1％NaCl)中培养，直至在550nm时测量的光密度达到0.5。通过添加0.1 mM浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。在25℃和 220rpm诱导16小时后，收获细胞并冷冻于-20℃。为了进行活性试验， 将10mg细胞与500μl 100mM TEA缓冲液pH 7.0、1mM MgCl₂和500 μl玻璃珠混合，利用球磨机消化10分钟。然后所获裂解物在稀释状态 下进行相应的测量。

活性试验组成如下：960μl 100mM TEA缓冲液pH 7.0，1 bmM MgCl₂，160μg NADH，10μl稀释的细胞裂解物。通过向反应混合物中 添加10μl 100mM底物溶液(溶于70％甲醇)开始反应。

为了大量回收酶，将30g细胞重悬于150ml三乙醇胺缓冲液(100 mM，pH 7，2mM MgCl₂，10％甘油)，并用高压匀浆器消化。随后，将酶 溶液与150ml甘油混合，在-20℃保存。

实施例6

通过氧化还原酶SEQ ID NO：1还原乙基开环二酮(式III)

为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下800μl缓冲液(100mM磷 酸钾，pH＝7，2mM MgCl₂)，1.2ml 2-丙醇，0.08mg NAD，100mg乙 基开环二酮(式III)和1ml酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：1(参见实施例 3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育24小时。96小时 后，＞90％的使用的乙基开环二酮(式III)被还原。

在反应完成时，通过用二氯甲烷抽提对反应混合物进行再处理，分 离包含产物的有机相，通过蒸发/馏出溶剂获得17-β-羟基化合物(乙基开 环醇(Ethylsecol))。

然后通过HPLC将乙基开环二酮转化为乙基开环醇(Ethylsecol)。 为了这个目的，使用乙腈和水作为流动相的分离柱EC125/4 Nucleodur 100-5C18ec(Machery-Nagel，Düren，德国)。为了进行分析，使用流动相 中乙腈比例从30％到70％的线性梯度。通过与参照物比较进行反应产物 的鉴定。

实施例7

通过氧化还原酶SEQ ID NO：2还原乙基开环二酮(式III)

为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下250μl缓冲液(100mM三乙 醇胺，pH＝8，2mM MgCl₂)，250μl 4-甲基-2-戊醇，0.02mg NAD，25mg 乙基开环二酮(式III)和25μl酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：2(参见实施 例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育96小时。96小 时后，＞30％的使用的乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。

在反应完成时，通过用二氯甲烷抽提对反应混合物进行再处理，分 离包含产物的有机相，通过蒸发/馏出溶剂获得17-β-羟基化合物(乙基开 环醇(Ethylsecol))。

实施例8

通过氧化还原酶SEQ ID NO：3还原乙基开环二酮(式III)

为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下100μl缓冲液(100mM三乙 醇胺，pH＝7，2mM MgCl₂)，400μl 4-甲基-2-戊醇，0.02mg NADP，25 mg乙基开环二酮(式III)和100μl酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：3(参见 实施例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育72小时。 72小时后，＞95％的所用乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。

实施例9

通过氧化还原酶SEQ ID NO：4还原乙基开环二酮(式III)

为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下200μl缓冲液(100mM三乙 醇胺，pH＝9，2mM MgCl₂)，300μl 2-庚醇，0.025mg NADP，100mg 乙基开环二酮(式III)和50μl酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：4(参见实施 例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育72小时。72小 时后，＞80％的所用乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。

实施例10

通过氧化还原酶SEQ ID NO：5还原乙基开环二酮(式III)

为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下300μl缓冲液(100mM三乙 醇胺，pH＝7，2mM MgCl₂)，1.2ml 4-甲基-2-戊醇，0.12mg NADP，150 mg乙基开环二酮(式III)和0.6ml酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：5(参见 实施例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育72小时。 72小时后，＞90％的所用乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。

序列表

<110>IEP GmbH

<120>在NADH或NADPH存在的条件下使用氧化还原酶/脱氢酶通过对映体

选择性酶促还原开环二酮衍生物来制备开环醇衍生物的方法

<130>I 11005

<160>42

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>252

<212>PRT

<213>橙色绿屈挠菌DSM 635

<400>1

Met Glu Pro Pro Phe Ile Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala

1               5                   10                  15

Ala Gly Ile Gly Arg Ala Ser Ala Leu Ala Phe Ala Arg Glu Gly Ala

            20                  25                  30

Lys Val Val Val Ala Asp Val Asn Val Glu Gly Gly Glu Glu Thr Ile

        35                  40                  45

Ala Leu Cys Arg Ala Leu Asn Thr Asp Ala Met Phe Val Arg Cys Asp

    50                  55                  60

Val Ser Gln Arg Asp Glu Val Glu Arg Leu Ile Ala Leu Ala Val Asp

65                  70                  75                  80

Thr Phe Gly Arg Ile Asp Phe Ala His Asn Asn Ala Gly Ile Glu Gly

                85                  90                  95

Val Gln Ala Met Leu Ala Asp Tyr Pro Glu Glu Val Trp Asp Arg Val

            100                 105                 110

Ile Glu Ile Asn Leu Lys Gly Val Trp Leu Cys Met Lys Tyr Glu Ile

        115                 120                 125

Arg His Met Leu Lys Gln Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Thr Ser Ser

    130                 135                 140

Val Ala Gly Leu Ala Gly Ser Arg Gly Val Ser Ala Tyr Val Ala Ser

145                 150                 155                 160

Lys His Gly Ile Val Gly Ile Thr Lys Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

                165                 170                 175

Arg Asn Gly Ile Arg Val Asn Ala Ile Cys Pro Gly Thr Ile His Thr

            180                 185                 190

Ala Met Ile Asp Arg Phe Thr Gln Gly Asp Pro Gln Leu Leu Ala Gln

        195                 200                 205

Phe Ala Glu Gly Glu Pro Ile Gly Arg Leu Gly Ser Pro Glu Glu Val

    210                 215                 220

Ala Asn Ala Val Ile Trp Leu Cys Ser Asp Lys Ala Ser Phe Val Thr

225                 230                 235                 240

Gly Ala Thr Leu Ala Val Asp Gly Gly Arg Leu Ala

                245                 250

<210>2

<211>249

<212>PRT

<213>Rubrobacter xylanophilus DSM 9941

<400>2

Met Leu Glu Gly Lys Val Ala Val Ile Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ile

1               5                   10                  15

Gly Arg Ala Thr Ala Leu Lys Phe Ala Arg Glu Gly Ala Arg Val Val

            20                  25                  30

Ala Ala Glu Leu Asp Glu Arg Gly Gly Glu Gly Val Val Arg Glu Val

        35                  40                  45

Arg Ser Leu Gly Gly Glu Ala Val Phe Val Arg Thr Asp Val Ser Glu

    50                  55                  60

Phe Ala Gln Val Glu Asp Ala Val Glu Arg Ala Val Gly Glu Tyr Gly

65                  70                  75                  80

Thr Leu Asp Val Met Phe Asn Asn Ala Gly Ile Gly His Tyr Ala Pro

                85                  90                  95

Leu Leu Glu His Glu Pro Glu His Tyr Asp Arg Val Val Arg Val Asn

            100                 105                 110

Gln Tyr Gly Val Tyr Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Gly Arg Lys Met Val

        115                 120                 125

Ala Leu Lys Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asn Thr Ala Ser Val Tyr Ala

    130                 135                 140

Phe Leu Ala Ser Pro Gly Val Ile Gly Tyr His Ala Ala Lys Gly Ala

145                 150                 155                 160

Val Lys Met Met Thr Gln Ala Ala Ala Leu Glu Leu Ala Pro His Gly

                165                 170                 175

Ile Arg Val Val Ala Ile Ala Pro Gly Gly Val Asp Thr Pro Ile Ile

            180                 185                 190

Gln Gly Tyr Lys Asp Met Gly Leu Gly Glu Arg Leu Ala Arg Gly Gln

        195                 200                 205

Met Arg Arg Arg Leu Gln Thr Pro Glu Gln Ile Ala Gly Ala Val Ala

    210                 215                 220

Leu Leu Ala Thr Asp Glu Ala Asp Ala Ile Asn Gly Ser Val Val Met

225                 230                 235                 240

Thr Asp Asp Gly Tyr Ala Glu Phe Lys

                245

<210>3

<211>243

<212>PRT

<213>木兰假丝酵母CBS 6396

<400>3

Met Ser Ala Thr Ser Asn Ala Leu Ile Thr Gly Ala Ser Arg Gly Met

1               5                   10                  15

Gly Glu Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Val Thr

            20                  25                  30

Leu Ala Ser Arg Gly Ile Glu Gln Leu Asn Ala Ile Lys Glu Lys Leu

        35                  40                  45

Pro Ile Val Lys Lys Gly Gln Gln His Tyr Val Trp Gln Leu Asp Leu

    50                  55                  60

Ser Asp Ile Glu Ala Ala Ser Thr Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

65                  70                  75                  80

Ser Ser Tyr Asp Val Phe Phe Ser Asn Ala Gly Val Val Asp Phe Ala

                85                  90                  95

Pro Phe Ala Asp Gln Ser Glu Thr Ala Gln Lys Asp Leu Phe Thr Val

            100                 105                 110

Asn Leu Leu Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys Thr Ile Val Lys Ala Ile

        115                 120                 125

Ala Asp Lys Pro Arg Glu Thr Pro Ala His Ile Ile Phe Thr Ser Ser

    130                 135                 140

Ile Val Gly Ile Arg Gly Val Pro Asn Val Ala Val Tyr Ser Ala Thr

145                 150                 155                 160

Lys Gly Ala Ile Asp Ser Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Phe Gly

                165                 170                 175

Pro Lys Asn Ile His Val Asn Cys Val Asn Pro Gly Thr Thr Arg Thr

            180                 185                 190

Glu Met Thr Lys Gly Val Asp Leu Ala Ala Phe Gly Asp Val Pro Ile

        195                 200                 205

Lys Gly Trp Ile Glu Val Asp Ala Ile Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu

    210                 215                 220

Ile Lys Ser Lys Asn Ile Thr Gly Gln Ser Leu Val Val Asp Asn Gly

225                 230                 235                 240

Phe Gly Val

<210>4

<211>241

<212>PRT

<213>木兰假丝酵母DSM 70638

<400>4

Met Thr Ser Thr Pro Asn Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile

1               5                   10                  15

Gly Ala Ser Ala Ala Ile Lys Leu Ala Gln Glu Gly Tyr Ser Val Thr

            20                  25                  30

Leu Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys Leu Thr Glu Val Lys Asp Lys Leu

        35                  40                  45

Pro Ile Val Arg Gly Gly Gln Lys His Tyr Val Trp Gln Leu Asp Leu

    50                  55                  60

Ala Asp Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Ala Ala Pro Leu Pro Ala

65                  70                  75                  80

Ser Ser Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gln Phe Ser

                85                  90                  95

Pro Thr Ala Glu His Thr Asn Ser Glu Trp Leu Asn Ile Met Thr Ile

            100                 105                 110

Asn Leu Val Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Gln Ala Val

        115                 120                 125

Ser Gly Arg Ser Ser Glu Asn Pro Phe Gln Ile Val Phe Ile Ser Ser

    130                 135                 140

Val Ala Ala Leu Arg Gly Val Ala Gln Thr Ala Val Tyr Ser Ala Ser

145                 150                 155                 160

Lys Ala Gly Thr Asp Gly Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Leu Gly

                165                 170                 175

Pro Gln Gly Val His Val Asn Val Val Asn Pro Gly Trp Thr Lys Thr

            180                 185                 190

Asp Met Thr Glu Gly Val Glu Thr Pro Lys Asp Met Pro Ile Lys Gly

        195                 200                 205

Trp Ile Gln Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Arg

    210                 215                 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Ala Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Phe Ser

225                 230                 235                 240

Thr

<210>5

<211>241

<212>PRT

<213>木兰假丝酵母DSM 70638

<400>5

Met Thr Thr Thr Ser Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile

1               5                   10                  15

Gly Ala Ala Ser Ala Ile Lys Leu Ala Gln Glu Gly Tyr Asn Val Thr

            20                  25                  30

Leu Ala Ser Arg Ser Val Asp Lys Leu Asn Glu Val Lys Ala Lys Leu

        35                  40                  45

Pro Ile Val Gln Asp Gly Gln Lys His Tyr Ile Trp Glu Leu Asp Leu

    50                  55                  60

Ala Asp Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

65                  70                  75                  80

Arg Ser Tyr Asp Val Phe Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Ala Phe Ser

                85                  90                  95

Pro Thr Ala Asp His Asp Asp Lys Glu Trp Gln Asn Leu Leu Ala Val

            100                 105                 110

Asn Leu Ser Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Asp Val

        115                 120                 125

Ser Glu Arg Pro Val Asp Lys Pro Leu Gln Ile Ile Tyr Ile Ser Ser

    130                 135                 140

Val Ala Gly Leu His Gly Ala Ala Gln Val Ala Val Tyr Ser Ala Ser

145                 150                 155                 160

Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Met Arg Ser Val Ala Arg Glu Val Gly

                165                 170                 175

Pro Lys Gly Ile His Val Asn Ser Ile Asn Pro Gly Tyr Thr Lys Thr

            180                 185                 190

Glu Met Thr Ala Gly Ile Glu Ala Leu Pro Asp Leu Pro Ile Lys Gly

        195                 200                 205

Trp Ile Glu Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu Ala Lys

    210                 215                 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Ile

225                 230                 235                 240

Ala

<210>6

<211>759

<212>DNA

<213>橙色绿屈挠菌DSM 635

<400>6

atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt  60

cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat  120

gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc  180

gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac  240

acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg  300

ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc  360

tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg  420

aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc  480

aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt  540

cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt catactgcga tgatcgaccg ctttacccag  600

ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg  660

cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc  720

ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc ctggcgtaa                         759

<210>7

<211>750

<212>DNA

<213>Rubrobacter xylanophilus DSM 9941

<400>7

atgctcgagg ggaaggtcgc ggtcatcacg ggggccggaa gcggcatagg ccgggccacc  60

gcgctcaagt tcgcccgcga gggggcccgg gtcgtcgccg ccgagctcga cgagcgcggc  120

ggggaggggg tggtccggga ggtgcgcagc ctcgggggcg aggcggtctt cgtccggacc  180

gacgtctcgg agttcgcgca ggtggaggac gccgtcgagc gggcggtcgg ggagtacggc  240

accctcgacg tgatgttcaa caacgccggc atcgggcact acgcccccct gctggagcac  300

gagcccgagc actacgaccg ggtggtccgg gtgaaccagt acggcgtcta ctacgggata  360

ctcgccgccg ggagaaagat ggtcgccctg aagaaccccg gcttgatcat caacaccgcc  420

tcggtctacg ccttcctcgc ctcgccgggg gtcatcggct accacgccgc caagggggcg  480

gtcaagatga tgacccaggc ggcggcgctg gagctcgccc cgcacggcat aagggtcgtc  540

gccatcgccc cgggcggggt ggacaccccc atcatccagg gctacaagga catggggctc  600

ggcgagaggc tggcccgcgg ccagatgcgc cgccggctcc agacccccga gcagatcgcc  660

ggggcggtcg ccctgctcgc caccgacgag gccgacgcca taaacggctc ggtggtcatg  720

accgacgacg gctacgcgga gttcaagtag                                   750

<210>8

<211>732

<212>DNA

<213>木兰假丝酵母CBS 6396

<400>8

atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca  60

gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag  120

ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg  180

cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc  240

agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac  300

caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg  360

accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc  420

ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta cagcgccacc  480

aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc  540

cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc  600

gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgagg tcgatgcgat tgccgacgct  660

gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga  720

ttcggtgttt aa                                                      732

<210>9

<211>726

<212>DNA

<213>木兰假丝酵母DSM 70638

<400>9

atgacatcta cacctaatgc cctcatcacg ggaggcagcc gcggcattgg cgcttccgcc  60

gccatcaaac tggctcaaga agggtacagc gtcacgctgg cgtcccgcga ccttgagaaa  120

cttactgagg tcaaggacaa gctgccaatc gtgagaggtg gacagaaaca ctacgtttgg  180

cagctcgatc ttgccgatgt ggaggctgca tcgtctttca aggcggctcc tctgccggcc  240

agcagctacg atttgtttgt ttcgaacgcc ggaattgccc agttctcgcc tacggcagag  300

catactaata gtgagtggct gaacattatg accattaact tagtgtcccc gattgccctg  360

acgaaggctc ttttgcaggc cgtttctggg aggtcgagcg agaacccgtt tcagatcgtc  420

ttcatctcgt cggttgcagc actacgtggc gttgcacaaa cggccgtcta cagtgcgtcg  480

aaggctggta ctgatggatt cgcacgctca cttgctcgcg aactaggtcc tcaaggtgtt  540

catgtgaacg tggtgaaccc tggctggact aagacagaca tgacggaagg agtcgaaacc  600

ccaaaggaca tgcccattaa gggctggatc cagcctgagg caattgctga tgctgtagta  660

ttccttgcga ggtcgaaaaa cattaccggc gcgaatattg tagtggacaa tggtttctcg  720

acgtaa                                                             726

<210>10

<211>726

<212>DNA

<213>木兰假丝酵母DSM 70638

<400>10

atgacgacta cttcaaacgc gcttgtcact ggaggcagcc gcggcattgg cgctgcctcc  60

gccattaagc tggctcagga gggctacaat gttacgctgg cctctcgcag tgttgataaa  120

ctgaatgaag taaaggcgaa actcccaatt gtacaggacg ggcagaagca ctacatttgg  180

gaactcgatc tggctgatgt ggaagctgct tcgtcgttca agggtgctcc tttgcctgct  240

cgcagctacg acgtctttgt ttcgaacgcg ggcgtcgctg cgttctcgcc cacagccgac  300

cacgatgata aggagtggca gaacttgctt gccgtgaact tgtcgtcgcc cattgccctc  360

acgaaggccc tcttgaagga tgtctccgaa aggcctgtgg acaagccact gcagattatc  420

tacatttcgt cggtggccgg cttgcatggc gccgcgcagg tcgccgtgta cagtgcatct  480

aaggccggtc ttgatggttt tatgcgctcc gtcgcccgtg aggtgggccc gaagggcatc  540

catgtgaact ccatcaaccc cggatacacg aagactgaaa tgaccgcggg cattgaagcc  600

cttcctgatt tgcctatcaa ggggtggatc gagcccgagg caattgctga cgcggttctg  660

tttctggcaa agtccaagaa tatcaccggc acaaacattg tggtcgacaa tggcttgatt  720

gcttaa                                                             726

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工构建物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(38)

<400>11

ggaattccat atgatggagc cacctttcat tgggaagg                          38

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工构建物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<400>12

cccaagctta ttattacgcc aggcggccac catc                              34

<210>13

<211>34

<212>DNA

<213>人工构建物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<400>13

cccaagctta ttattacgcc aggcggccac catc     34

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>人工构建物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(35)

<400>14

ggaattccat atgatgtctg ctacttcgaa cgctc    35

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>人工构建物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(33)

<400>15

ccgctcgagt tattaaacac cgaatccgtt gtc      33

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>人工构建物

<400>16

cacatgcatg cagatgtctg ctacttcgaa cgctc    35

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>人工构建物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<400>17

gcccgagctc ttattaaaca ccgaatccgt tgtc    34

<210>18

<211>12

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>18

Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly

1               5                   10

<210>19

<211>12

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>19

Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly

1               5                   10

<210>20

<211>12

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>20

Asn Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly

1               5                   10

<210>21

<211>12

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>21

Asn Ala Leu Ile Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly

1               5                   10

<210>22

<211>12

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>22

Asn Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Met Gly

1               5                   10

<210>23

<211>12

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>23

His Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly

1               5                   10

<210>24

<211>7

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>24

Gly Tyr Ser Val Thr Leu Ala

1               5

<210>25

<211>7

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>25

Gly Tyr Asn Val Thr Leu Ala

1               5

<210>26

<211>7

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>26

Gly Tyr Ser Val Thr Leu Val

1               5

<210>27

<211>7

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>27

Gly Tyr Asn Val Thr Leu Val

1               5

<210>28

<211>8

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>28

Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

1               5

<210>29

<211>8

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>29

Phe Lys Ala Ala Pro Leu Pro Ala

1               5

<210>30

<211>6

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>30

Phe Val Ser Asn Ala Gly

1               5

<210>31

<211>6

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>31

Phe Phe Ser Asn Ala Gly

1               5

<210>32

<211>6

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>32

Phe Val Cys Asn Ala Gly

1               5

<210>33

<211>6

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>33

Phe Val Ala Asn Ala Gly

1               5

<210>34

<211>9

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>34

Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu

1               5

<210>35

<211>9

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>35

Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys Thr Ile

1               5

<210>36

<211>9

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>36

Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Thr Leu

1               5

<210>37

<211>9

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>37

Ser Pro Val Ala Met Thr Lys Ala Leu

1               5

<210>38

<211>9

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>38

Ser Gln Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu

1               5

<210>39

<211>7

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>39

Ala Val Tyr Ser Ala Ser Lys

1               5

<210>40

<211>7

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>40

Ala Val Tyr Ser Ala Thr Lys

1               5

<210>41

<211>6

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>41

Pro Ile Lys Gly Trp Ile

1               5

<210>42

<211>6

<212>PRT

<213>人工构建物

<400>42

Pro Ile Ser Gly Trp Ile

1               5