公开/公告号CN101597349A
专利类型发明专利
公开/公告日2009-12-09
原文格式PDF
申请/专利权人 武汉大学;
申请/专利号CN200910063169.0
申请日2009-07-14
分类号C08F26/02(20060101);C08F8/42(20060101);C08G69/48(20060101);C08B37/08(20060101);C12N15/63(20060101);C12N15/82(20060101);C12N15/85(20060101);
代理机构42208 武汉天力专利事务所;
代理人程祥;冯卫平
地址 430072 湖北省武汉市武昌珞珈山
入库时间 2023-12-17 23:05:55
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-07-05
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C08F26/02 授权公告日:20110511 终止日期:20180714 申请日:20090714
专利权的终止
2013-02-27
专利权的转移 IPC(主分类):C08F26/02 变更前: 变更后: 登记生效日:20130124 申请日:20090714
专利申请权、专利权的转移
2011-05-11
授权
授权
2010-02-03
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-12-09
公开
公开
技术领域
本发明涉及苯硼酸修饰的阳离子聚合物及其合成方法和作为非病毒基因载体的应用。
背景技术
近年来,基因工程在全世界范围内取得了举世瞩目的成就。该技术是在生物体外,通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”,对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞内进行无性繁殖,使重组基因在受体细胞内表达,产生出人类所需要的基因产物。
基因工程在农牧业生产上的应用主要是培育高产、优质或具有特殊用途的动植物新品种。通过基因工程技术,可获得高产、稳产和具有优良品质的农作物,可加快农作物新品种的培育,也使开发农作物新品种的时间大为缩短。科学家将某些特定基因与病毒DNA构成重组DNA,然后通过感染或微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中,由这种受精卵发育成的动物可以获得人们所需要的各种优良品质。
基因治疗是用于人体的基因工程,它是用正常的基因整合入细胞,以校正和置换致病基因的一种治疗方法。利用基因可以治疗很多种疾病,例如传染病,癌症,遗传缺损,艾滋病,帕金森病等等。治疗基因通过基因传递系统运送到目标部位。而目前,基因药物缺乏安全有效的传递系统被认为是临床应用上最大的障碍之一。病毒载体的免疫原性,潜在的致癌性,及成本较高等缺点限制了它的广泛应用。非病毒载体,具有临床上的安全性,优良的生物相容性,载药量大,低毒性以及可大规模生产等优点。这些促使人们致力于高效低毒性的非病毒载体材料的研究。在众多的非病毒基因载体中,阳离子聚合物是常用的非病毒基因载体。它能与带负电的DNA形成紧密的纳米粒子,当阳离子聚合物上含有很多在弱酸性条件下可质子化的氨基时,在内体中具有“质子海绵”效应,有利于DNA从溶酶体中逃逸出来,产生高的转染效率。
蛋白质、糖类及核酸等生物大分子在各种生理和病理过程中起着极其重要的作用,结构合适的多苯硼酸化合物或聚合物通过基团之间的协同作用可以实现对具有重要生物功能的生物大分子的选择性结合。通过苯硼酸基团与生物大分子上的羟基、氨基等功能基团的可逆共价结合作用,我们设计并合成了一系列苯硼酸修饰阳离子聚合物。
本发明的目的是以苯硼酸修饰阳离子聚合物作为一类新的具有细胞穿透功能的非病毒基因载体的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种苯硼酸修饰的阳离子聚合物及其制备方法和用途,得到的苯硼酸修饰的阳离子聚合物作为载体材料具有与基因结合并带入细胞的能力,可以实现基因的高效率转染。
本发明提供的苯硼酸修饰的阳离子聚合物非病毒基因载体,其特征是所述载体中的苯硼酸具有以下通式:
其中,R是和硼酸基团处于苯环的邻位、间位或是对位的H或者含有1到10个碳原子的烷基或含氮、氧、硫、氯、溴、碘等杂原子的取代烷基;P为在pH为7的环境中带正电的天然或合成聚合物;1≤n≤20;P的分子量Mw为100到1000000之间,优选400到500000。
上述R的种类包括但不限于二烷基氨甲基、CH2OH(羟甲基)。
所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺或其衍生物、聚丙烯亚胺或其衍生物、多聚胺或其衍生物、聚酰胺-胺树形分子或其衍生物、碱性氨基酸聚合物或碱性氨基酸与其他氨基酸的共聚物或其衍生物、壳聚糖或其衍生物、鱼精蛋白或其衍生物、或明胶或其衍生物。
本发明还提供了上述苯硼酸修饰的阳离子聚合物非病毒基因载体的合成方法,其特征是具有如下反应步骤:将邻位、间位或对位的具有式I结构的苯硼酸和如上所述的阳离子聚合物溶于甲醇或N,N-二甲基甲酰胺等溶剂中,在20~60℃反应2~48小时后得到浅黄色固体或液体,此粗产品经沉淀或透析等方法纯化后得到苯硼酸修饰的阳离子聚合物;苯硼酸与阳离子聚合物的摩尔比为1~20∶1;式I中,X为卤代烷基,醛基,或酰卤、酸酐、活性酯等易于与氨基反应的基团;R是和硼酸基团处于邻位、间位或是对位的H或者含有1到10个碳原子的烷基或含氮、氧、硫、氯、溴、碘等杂原子的取代烷基,包括但不限于二烷基氨甲基(CH2NR2)、CH2OH等基团。
式I:
本发明提供的苯硼酸修饰的阳离子聚合物与外源基因结合作为基因载体的应用:
苯硼酸修饰的阳离子聚合物作为基因载体,通过合适的转导方法,可把目的基因带入人体细胞和各种动植物细胞,用于人体基因治疗和动植物的基因转导。
(1)苯硼酸修饰的阳离子聚合物基因载体的人体及动物细胞基因转导:把苯硼酸修饰的阳离子聚合物与外源基因(DNA或RNA)结合所形成的复合物与人体及动物细胞共培养,复合物可以转导入细胞。结果表明苯硼酸修饰的阳离子聚合物能有效转导基因,并能在细胞中高效表达。
(2)苯硼酸修饰的阳离子聚合物基因载体的植物细胞转导:把苯硼酸修饰的阳离子聚合物与外源基因结合所形成的复合物与植物细胞进行共同培养,苯硼酸修饰的阳离子聚合物能有效转导植物细胞并实现基因的表达。
本发明的技术效果:
一、本发明采用的阳离子聚合物为在生理环境中带正电的聚合物。他们具有氨基、胍基等在生理条件下带有正电荷的基团,可形成不同的酸碱缓冲体系,能有效结合DNA,携带DNA进入细胞,保护DNA免受细胞质中的溶酶体的降解。
二、本发明得到的苯硼酸修饰的阳离子聚合物能和蛋白质、多糖、核酸等生物大分子中的羟基、氨基等功能团形成可逆共价结合,提高载体材料与基因结合并将其带入细胞的能力,从而实现基因的高效率转染。
本发明的优点:所采用的阳离子聚合物本身即具有和DNA结合并介导基因转染的能力,再此基础上,本发明在阳离子聚合物上键接上能与生物大分子作用的苯硼酸基团,结果提高了载体材料与基因结合并带入细胞的能力,实现了基因的高效率转染。通过调节苯硼酸修饰的阳离子聚合物上的苯硼酸基团的数量和类型,以及阳离子聚合物的种类,可获得一系列具有较高转染效率的非病毒基因载体。
附图说明
图1为本发明的苯硼酸修饰的阳离子聚合物PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4装载荧光素酶质粒DNA在HepG2细胞中转导的效果图,其结果显示本发明的苯硼酸修饰的阳离子聚合物PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4能在HepG2细胞中有效转导该基因。
图2为本发明的苯硼酸修饰的阳离子聚合物PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4装载荧光素酶质粒DNA在COS7细胞中转导的效果图,其结果显示本发明的苯硼酸修饰的阳离子聚合物PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4能在COS7细胞中有效转导该基因。
图3为本发明的苯硼酸修饰的阳离子聚合物PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4装载荧光素酶质粒DNA在HeLa细胞中转导的效果图,其结果显示本发明的苯硼酸修饰的阳离子聚合物PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4能在HeLa细胞中有效转导该基因。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细的描述,但不限于实施例所公开的内容。实施例1:PEI1800-pPB1.9(PEI代表所述的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺;1800等数字代表聚乙烯亚胺的分子量,下同;PB代表阳离子聚合物上不同类型的苯硼酸基团,苯硼酸基团的具体结构如实施例中描述,下同;o,m,p分别代表苯硼酸上R基和硼酸基的相对位置分别是邻,间,对位;1.9代表每个聚乙烯亚胺分子上有1.9个苯硼酸基团,下同。)
将1.1mmol对-(溴甲基)苯硼酸用20ml甲醇溶解得到苯硼酸的甲醇溶液,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.56mmol PEI1800的甲醇溶液中,30℃下继续搅拌反应24小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺。测得1HNMR(300MHz,D2O):δ7.39(d,2H),7.11(d,2H),2.66-2.47(m,NCH2CH2N,NCH2CHPB),经核磁共振氢谱确定,最终产物为PEI1800-pPB1.9。
实施例2:PEI1800-pPB3.2
将2.2mmol对-(溴甲基)苯硼酸用20ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.56mmol PEI1800的甲醇溶液中,20℃下继续搅拌反应36小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺,测得1H NMR(300MHz,D2O):δ7.41(d,2H),7.13(d,2H),2.68-2.50(m,NCH2CH2N,NCH2CHPB),经核磁共振氢谱确定,最终产物为PEI1800-pPB3.2。
实施例3:PEI1800-pPB5.4
将4.4mmol对-(溴甲基)苯硼酸用40ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.56mmol PEI1800的甲醇溶液中,50℃下继续搅拌反应18小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺,测得1H NMR(300MHz,D2O):δ7.38(d,2H),7.10(d,2H),2.65-2.45(m,NCH2CH2N,NCH2CHPB),经核磁共振氢谱确定,最终产物为PEI1800-pPB5.4。
实施例4:PEI25000-pPB8
将5mmol邻-(溴甲基)苯硼酸用60ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.5mmol聚乙烯亚胺PEI25000的甲醇溶液中,30℃下继续搅拌反应24小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺,测得1H NMR(300MHz,D2O):δ7.37(d,2H),7.10(d,2H),2.64-2.46(m,NCH2CH2N,NCH2CHPB),经核磁共振氢谱确定,最终产物为PEI25000-pPB8。
实施例5:PEI800-SS2.6-pPB4(PEI800-SS2.6代表每个分子上有2.6个巯基的分子量为800的聚乙烯亚胺PEI800-SH2.6氧化后的交联产物,其制备方法参考文献Peng,Q.,Zhong,Z.L.,and Zhuo,R.X.(2008)Disulfide cross-linked polyethylenimines(PEI)preparedvia thiolation of low molecular weight PEI as highly efficient gene vectors.Bioconjugate Chem.19,499-506.)
将3.5mmol邻-(溴甲基)苯硼酸用60ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.5mmol PEI800-SS2.6的甲醇溶液中,45℃下继续搅拌反应24小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的双硫键交联的聚乙烯亚胺,测得1H NMR(300MHz,D2O):δ7.39(d,2H),7.11(d,2H),3.14-2.46(m,NCH2CH2N,NCH2CHMeS,NCH2CHPB),1.25-1.05(m,CH3),经核磁共振氢谱确定,最终产物为PEI800-SS2.6-pPB4。
实施例6:PLL4300-oPB3.2(PLL代表所述的聚合物为聚-L-赖氨酸)
将2.2mmol邻-(氯甲基)苯硼酸用20ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.56mmol聚赖氨酸PLL4300的甲醇溶液中,60℃下继续搅拌反应48小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的聚赖氨酸,测得1H NMR(300MHz,D2O):δ7.33(d,2H),7.17(d,2H),4.20(br,1H,COCH(R)NαH),3.93(br,1H,COCH(R)NαH),3.81(br,1H,COCH(R)NαH2),3.62(br,1H,COCH(R)NαH2),3.21-3.05(m,2H,CH2 NεH,CH2 NεPB),2.98-2.86(m,2H,CH2 NεH2,CH2 NεHPB),1.86-1.30(brm,6H,CH2),经核磁共振氢谱确定,最终产物为PLL4300-oPB3.2。
实施例7:PKR11000-oPB3.2(PKR代表所述的阳离子聚合物为赖氨酸和精氨酸的共聚产物)
把60.0mmol L-赖氨酸盐酸盐和60.0mmol氢氧化钾在研钵中混匀,研磨成浆状,再向其中加入120.0mmol L-精氨酸,混合均匀后,将白色固体混合物移入一个250ml三口烧瓶中,在氩气保护和机械搅拌的条件下,加热反应混合物至160℃反应48小时,得到黄色固体。加入200ml甲醇,超声溶解大部分固体。过滤,向滤液中逐滴加入四氢呋喃,分级沉淀,得到赖氨酸和精氨酸的共聚产物,由元素分析法测得产物中碳原子的含量为45.05%,氮原子的含量为20.10%,氢原子的含量为7.92%,经确定,最终产物为(Lys)0.8-(Arg)0.2,该产物由凝胶渗透色谱法测得其分子量Mw为1.1×104g/mol。
将2.2mmol邻-(氯甲基)苯硼酸用20ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.56mmol赖氨酸和精氨酸的共聚产物PKR 11000的甲醇溶液中,50℃下继续搅拌反应36小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的阳离子聚合物,测得1H NMR(300MHz,D2O):δ7.33(d,2H),7.15(d,2H),4.30(br,1H,COCH(R)NαH),4.04-3.95(br,1H,COCH(R)NαH),3.75-3.81(br,1H,COCH(R)NαH2),3.58(br,1H,COCH(R)NαH2),3.28(m,2H,CH2 NεH;m,2H,CH2NεH2;br,1H,COCH(R)NαH2),2.92-2.81(m,2H,CH2 NεH2,CH2 NεHPB),1.96-1.00(brm,6H,CH2;brm,4H,CH2),经确定,最终产物为PKR11000-oPB3.2。
实施例8:PAMAM18000-pPB12(PAMAM代表所述的阳离子聚合物为聚酰胺-胺树形聚合物,18000代表该聚酰胺-胺树形聚合物的分子量)
将7.5mmol 2-(二烷基氨甲基)-4-(溴甲基)-苯硼酸用20ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液加入15ml 0.50mmol聚酰胺-胺树形聚合物18000的甲醇溶液中,40℃下继续搅拌反应36小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的聚酰胺-胺阳离子聚合物,测得1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.43(d,2H),7.10(d,2H),3.25(m,2H,CH2),2.78-2.68(m,2H,CH2;2H,CH2;1H,CH2NHPB),2.44(s,4H,2CH2),1.65(s,2H,NH2),经确定,最终产物为PAMAM18000-pPB12。
实施例9:CTS100000-mPB10
将6.0mmol 2-(羟甲基)-3-(溴甲基)-苯硼酸用50ml甲醇溶解,在搅拌条件下,将苯硼酸的甲醇溶液逐滴加入15ml 0.5mmol壳聚糖CTS100000的甲醇溶液中,油浴60℃下继续搅拌反应48小时,减压旋蒸,除去大部分甲醇,将粗产物加入乙醚中沉淀,静置后倾去上层溶液,收集沉淀物,干燥后得到苯硼酸修饰的壳聚糖,测得1HNMR(300MHz,D2O):δ7.41(d,2H),7.15(d,2H),3.79-3.25(m,1H,CH;m,1H,CH;m,2H,CH2),2.89(m,1H,CHNHPB),1.84(m,1H,CH),经确定,最终产物为CTS100000-mPB10。
实施例10:
将实施例1-9制备的苯硼酸修饰的阳离子聚合物非病毒基因载体分别采用GelRed作为DNA荧光染料分子,把苯硼酸修饰的阳离子聚合物与DNA分别按不同的氮磷比复合之后用凝胶电泳法测定其结合能力,测定结果表明:按实施例1-9制备的基因载体皆能有效诱导DNA分子的缔合。
实施例11:
按实施例1、实施例2和实施例3制备的苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺非病毒基因载体PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4,分别体外转染HepG2,COS7和HeLa细胞,转染4小时后,用荧光测试仪测试荧光素酶报告基因在各种细胞中的表达,结果表明:苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺的非病毒载体PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4能有效转染细胞,在HepG2细胞上的转染效率是25KDa PEI的10倍,在COS7和HeLa细胞上的转染效率与25KDa PEI相当。
实施例12:
按实施例4~9制备的苯硼酸修饰的阳离子聚合物非病毒基因载体,分别体外转导HEK293细胞,转染36小时后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明:苯硼酸修饰的阳离子聚合物非病毒基因载体能有效转导该细胞。
实施例13:
按实施例1、实施例2和实施例3制备的苯硼酸修饰的阳离子聚合物非病毒基因载体PEI1800-pPB1.9、PEI1800-pPB3.2和PEI1800-pPB5.4,分别体外转导水稻愈伤组织细胞,转染48小时后,荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白在水稻伤愈组织细胞中得到表达。
机译: 氟康唑单水合物的合成方法,氟康唑(变体)的结晶修饰II的合成方法,氟康唑的结晶修饰I的合成方法
机译: 使用包含苯硼酸的修饰核苷酸进行核酸测序的方法
机译: 聚乙二醇修饰的干扰素α2a及其合成方法和应用