奶牛血液中分离出的抗菌肽及其编码序列和用途

摘要

本发明涉及一种从奶牛血液中分离出的具有抗菌活性的抗菌肽及其编码序列和用途。所述抗菌肽具有序列表SEQ ID NO：1中1至25位的氨基酸序列。该抗菌肽除具有一般抗菌肽抗菌谱广、杀菌快速、高度的选择性、不产生耐药性、无致畸作用的共性之外，还具有下列特点：(1)结构简单、人工合成方便，应用于哺乳动物无抗原性；(2)本发明抗菌肽分离于奶牛血液的红细胞，而红细胞为动物血液成分之一，参与血液循环过程，不存在溶血毒性，或溶血率值极低。该抗菌肽可用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染的药物，还可应用于牛奶保鲜或其它食品防腐剂及饲料防霉剂等领域。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种从奶牛血液中分离出的具有抗菌活性的抗菌肽及其编码序列和用途。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides)是生物细胞基因编码产生的一类具有抗菌活性的多肽，是机体在生物进化过程中为适应环境与自身生存而产生的天然免疫活性分子，是天然免疫的重要介质。抗菌肽分子量小，肽链一般为10～50个氨基酸残基。目前发现抗菌肽除了具有广谱的抗菌(革兰阳性菌和革兰阴性菌)活性外，还对真菌(如白色念珠菌等)、病毒(如流感病毒、艾滋病病毒等)、寄生虫(如线虫、鞭毛虫等)及肿瘤等具有极强的杀灭能力，更为重要的是抗菌肽对正常的真核细胞几乎没有作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，同时无免疫原性，不会产生过敏反应。抗菌肽的杀菌机理与抗生素完全不同，抗菌肽一般是通过作用于靶细胞的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，导致细菌细胞质膜通透性增大，引起胞内水溶性物质大量渗出而达到广谱抗菌的效果。因此，病原菌对抗菌肽一般不会产生耐药性。

目前，在治疗细菌性疾病是主要依赖于抗生素，抗生素的使用为人类解除细菌性感染发挥了巨大的作用。但是，由于长期滥用抗生素，细菌耐药性越来越强，耐药菌株感染病例越来越多，不仅使得许多曾经高度有效的抗生素药物失效，而且对人类生命健康构成了严重的威胁。当前，对病毒性疾病主要依赖于疫苗接种，但发病后几乎无药可治；对寄生虫性疾病基本不治疗或不预防。每年由此造成的经济损失相当巨大。

抗菌肽和小分子化学抗生素相比有以下特点：(1)高效性，对病原生物最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)为0.25～4μg/L；(2)广谱性，对细菌、真菌、病毒、寄生虫、肿瘤细胞均具有作用；(3)低毒性，由于人类与哺乳动物的正常细胞结构与病原生物和肿瘤细胞的不同，抗菌肽在起作用的浓度范围内，对正常机体组织细胞的毒性很小；(4)稳定性，经100℃处理30min或用pH值远偏离中性、较大离子强度的溶液处理后仍可保留生物活性。某些多肽能在溶液中形成多聚体结构或与细胞膜脂质结合，获得抵抗蛋白酶水解的能力；(5)迅速的杀菌能力，在体外实验中，大多数抗菌肽在有效MIC的条件下，5min即能杀死99.7％的病原体；(6)抗菌肽还具有提高机体免疫系统功能、提高饲料转化率、促进动物生产等功能。

抗菌肽对食品中的多种革兰氏阳性及阴性细菌均有较强的杀灭作用，能快速抑制微生物的生长，人、畜食后易被体内蛋白酶水解消化且无毒副作用，在酸性条件下活性很强，具有良好的溶解性和稳定性，是一种极具发展前景的新型食品防腐剂；抗菌肽还能在发酵过程中定向培养或杀死某些菌种，或在食物中定向保存有益菌群(如乳酸菌)和防止有害菌群异常发酵。大多数活性肽还具有良好的溶解性、热稳定性以及在高浓度状态下呈低黏度等加工特性，如大豆多肽、菜籽多肽等，可添加到食品中，制作各种功能食品，且仍能保持原有的生理活性，也可以直接制成口服剂型药品、保健品、营养品等。在动物饲料抗菌肽添加剂研究方面，可用基因工程方法生产环保型抗菌肽添加剂，以减少或避免抗生素添加剂引发的负面问题。抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡，并易在动物体内残留，严重影响了畜产品的品质和人类的健康。

抗菌肽具有独特的抗菌机制及广谱而不产生耐药性的优越性质，它的出现为人们寻找理想的抗菌药物和食品添加剂提供了新的方向，为人类战胜耐药微生物带来了新的契机，抗菌肽也因此具有巨大的应用潜力。

自从世界上第一个抗菌肽天蚕素(cecropin)被发现以来，迄今已从生物界分离到750多种抗菌肽，它们的分布极其广泛，从哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类到植物、细菌和病毒等均有发现。目前，国内有较多的学者从不同陆生动物和水生动物体内分离到一些具有活性的抗菌肽。而在哺乳动物中发现的抗菌肽主要有三类，分别是防御素、cathelicidins和histatinst23。防御素根据氨基酸的数量、半胱氨酸的位置以及二硫键连接方式的不同，可分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素三类：α-防御素是美国Lehrer实验室从兔肺巨噬细胞中首先分离得到的阳离子性极强的小分子抗菌肽，主要存在于哺乳动物中性粒细胞、巨噬细胞和动物小肠的Paneth细胞内；β-防御素首先在牛的气管黏膜上皮细胞中发现，大小约38～42个氨基酸残基，由三个二硫键连接形成的β-折叠结构，三个二硫键的位点分别是1和5、2和4；3和6，主要存在于哺乳动物的皮肤、黏膜等上皮细胞中；θ-防御素是从猕猴的白细胞中分离出来的一种成环状结构的新型防御素，由18个氨基酸组成。cathelicidins是哺乳动物中另一大类抗菌肽，最初是从猪的白细胞中分离到的。这类肽以没有活性的前体形式贮存于中性粒细胞的分泌颗粒中，受到细胞刺激通过蛋白水解而释放，广泛存在于猪、羊、马、牛、豚鼠、兔子和山羊的嗜中性细胞中。哺乳动物抗菌肽的另一个家族是histatins，是从人的唾液中分离出的一组富含组氨酸的小的阳离子肽，相对分子质量为3000～4000。它们具有杀真菌和细菌的活性，目前仅发现于人类和旧大陆猴(Macaca fascicularis)中。

抗菌肽对哺乳动物正常细胞一般无损伤，但是大多数抗茵肽在高浓度下(少数抗茵肽甚至在低浓度下)有溶血作用，因而对哺乳动物正常细胞也有一定毒性。溶血作用与疏水残基含量有关，肽分子中疏水残基含量越高则往往溶血作用越强，抗菌肽溶血活性的存在是阻碍其应用的重要因素，今后的研究要保证抗菌肽抗菌活性的基础上消除其溶血活性，才能够真正促进抗菌肽在医药、食品等方面的应用推广。

目前，尚未见到从奶牛血液血红蛋白内进行抗菌肽的分离鉴定的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从奶牛血液中分离出的具有抗革兰阳性细菌、革兰阴性细菌及病原真菌活性的抗菌肽，测定了其氨基酸序列，并给出了该抗菌肽分离提纯方法，且指明了其用途。

一种奶牛血液中分离出的抗菌肽，具有下述氨基酸序列：

Asn-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Leu-Gln-Ala-Asp-Phe-Gln-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asn-Ala-Leu-Ala-His-Lys，其分子量为2668.03，等电点pI为7.15。

所述抗菌多肽的制备方法如下：

(1)血液的采集与处理无菌条件下收集健康奶牛的血液于含肝素的试管中，立即用0.9％的灭菌生理盐水洗涤红细胞2～4次，再用0.83％氯化铵溶液溶解红细胞，于4℃下离心去除白细胞后，将含血红素多肽的溶液经冻干后再用0.01％乙酸溶解；

(2)抗菌肽的纯化将粗提的血红素溶液通过离子交换柱，阳离子复合物结合阴离子树脂上，以25mM乙酸铵溶液洗去非阳离子分子，再以10％乙酸溶液洗脱阳离子分子，并收集该洗脱液，将收集的洗脱溶液以20mL/h的速率倒入阳离子交换柱子中，用双光束紫外可见分光光度计在波长为230nm处监测其吸光度，收集洗脱峰，冻干，以0.01％乙酸重悬，在反相高效液相色谱上以梯度化的30～35％乙腈和0.1％三氟乙酸进行，分别收集215nm处的肽，冻干，用0.01％醋酸溶解。

本发明所述抗菌肽也可以依据相关编码序列进行人工合成，其制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。

所述抗菌肽可用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染的药物。

所述药物含有上诉抗菌肽，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和/或添加剂。

所述抗菌肽还可用作饲料添加剂或食品添加剂。

本发明所具有的有益效果：

(1)抗菌谱广，对G+、G-细菌和真菌都有高效的抗菌作用；(2)杀菌快速；(3)高度的选择性，原核细胞、肿瘤细胞与正常的真核细胞膜结构不同，抗菌肽可以选择地作用于原核细胞、肿瘤细胞，而对正常细胞的作用不明显；(4)不产生耐药性；(5)无致畸作用。

本发明首次从奶牛血液中分离出了抗菌肽，除具有一般抗菌肽的共性之外，还具有下列特点：

(1)与其他来源的抗菌多肽相比，该抗菌多肽具有结构简单、人工合成方便，应用于哺乳动物无抗原性；

(2)本发明抗菌肽分离于奶牛血液的红细胞，而红细胞为动物血液成分之一，参与血液循环过程，不存在溶血毒性，或溶血率值极低，具有不产生耐药性、无致畸作用、不易产生蓄积中毒等一些安全无毒副作用的生物学特性。

附图说明

图1为对粗提液进行离子交换色谱法的结果图；

图2为对图1中阳离子峰进行RP-HPLC的结果图；

图3为对本发明抗菌肽的质谱检测结果图。

具体实施方式

实施例1：血液的采集与处理

在健康奶牛屠宰后，通过无菌方法将其血液收集于含肝素(15IU/ml)的试管中，置于冰浴中，于1h内送至实验室，立即用0.9％的灭菌生理盐水洗涤红细胞3次，再用0.83％氯化铵溶液溶解红细胞(体积比为3∶1)。于4℃700×g离心15min去除白细胞后，将含血红素多肽的溶液经冻干后再用0.01％乙酸溶解。

实施例2：抗菌肽的纯化

用离子交换柱层析(阳离子肽的可逆吸附，而负离子固定的离子交换柱)对粗提的血红素溶液进行分离其中的抗菌肽。将粗提的样品通过离子交换柱。阳离子复合物结合阴离子树脂上，通过25mM乙酸铵洗去非阳离子分子，再通过10％乙酸洗脱阳离子分子。将收集的溶液以20mL/h的速率倒入柱子中，用双光束紫外可见分光光度计在波长为230nm处监测其吸光度。分别收集洗脱峰5mL/峰)，冻干，用0.01％乙酸重悬。结果分离后，共有4个峰，E1为阴离子峰，E2、E3和E4为阳离子峰，参见图1，经抗菌活性检测(实施例3的方法)，发现峰液E1无抗菌活性，而峰液E2、E3和E4具有抗菌活性。

将峰液E2、E3和E4混合后用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离有活性的肽。用梯度化的30～35％乙腈和0.1％三氟乙酸在Jupiter(5U C18)分离柱上进行，分别收集215nm处的肽，冻干，用0.01％醋酸溶解。分离后，共有7个峰，参见图2，分别检测7个峰液的抗菌活性。

实施例3：抗菌活性检测

用平板扩散法测定离子交换法和反相高效液相色谱法分离肽的抗微生物活性(受试菌株为金黄色葡萄球菌NCTC 4163、大肠杆菌O111和白色念珠菌3135A)。

将上述3种受试微生物涂布在已消毒的含营养物质的下层琼脂培养基(10mL胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤(为Cole-Parmer公司产品)，10g超纯的琼脂(Sigma A-6013)，1L蒸馏水，pH 7.4)上，用打孔器打孔，孔径约2mm，酒精灯稍加热进行封底后，用移液器向每孔中加入浓度为0.8μg/ml的测试样品5μL，每个平板包括阳性对照和阴性对照。阳性对照采用通用的抗生素：多粘霉素B针对革兰阴性菌，尼生素(乳酸链球菌肽)针对革兰阳性菌，制霉素针对酵母。阴性对照采用0.01％醋酸，因为使用其溶解样品。将平板静置1h，以使测试液扩散入琼脂中。然后，再添加一层琼脂培养基(50℃左右，营养成分同下层培养基)。平板在37℃培养过夜，第二天早晨，记录孔周边的透明圈的直径。

离子交换法获得的4个峰液经抗菌活性检测后，仅阳离子峰具有较强的抗菌活性(参见表1)。对HPLC分离后的7个峰液进行抗菌活性检测，发现峰4对3种受试微生物具有较强的抗菌活性(参见表2)。因此，峰4所含的抗菌肽(即本发明所述抗菌肽)可望在治疗动物细菌性疾病和真菌性疾病方面有着很好的应用前景。根据已知抗菌肽的一般特性，峰4所含抗菌肽在抗菌药物的应用以及饲料防霉和牛奶保鲜等方面也具有一定的应用潜能。

表1离子交换法粗提肽的抗菌活性     单位：mm

表2RP-HPLC纯化肽的抗菌活性        单位：mm

实施例4：质谱分析

通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱来分析纯化肽的分子量大小。取0.5μL峰4样品(50μL总样品，HPLC处理)和0.5μL基质(10mg/mL α-氰-4-羟基苯丙烯酸，用0.1％三氟乙酸和60％乙腈配制)置于不锈钢片上，使其在室温下干燥。在阳离子极激发荧光阈值时用恒温生物分析仪收集数据。在内校正的指示下，因电喷射的电离作用，样品(对前样品用50％MeCN进行1∶1稀释)以3μL/min的速率直接注入质谱仪(使用电喷射离子化探针)，喷射电压设定在5kV，鞘气(N₂)设定大约33单位，毛细管温度在220℃。通过一系列的扫描收集数据，数据取平均值后产生观察的光谱值。

结果所分离的抗菌肽的分子量为2668.03，氨基酸序列为：Asn-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Leu-Gln-Ala-Asp-Phe-Gln-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asn-Ala-Leu-Ala-His-Lys。

实施例5：等电点分析

打开DNAStar软件中EditSeq，打开file，点击“new”中“new protien”，输入氨基酸序列，即可获得等电点的数据。本分离肽的等电点为7.15。

SEQUENCE LISTING

<110>河南科技学院

<120>奶牛血液中分离出的抗菌肽及其编码序列和用途

<130>天然抗茵肽的研究进展及应用前景

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>25

<212>PRT

<213>奶牛

<400>1

Asn Glu Phe Thr Pro Val Leu Gln Ala Asp Phe Gln Lys Val Val Ala

1               5                   10                  15

Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys

            20              25