(Z)－2－乙酰氧基－3－(3,4－二羟基苯基)丙烯酸及其合成方法和用途

摘要

本发明属药物合成领域，具体涉及式(I)结构的化合物(Z)－2－乙酰氧基－3－(3，4－二羟基苯基)丙烯酸及其合成方法和在药学上的应用。本发明从3，4－二羟基苯甲醛出发，与无水醋酐、无水醋酸钠和N－乙酰甘氨酸加热反应后，在9％盐酸中水解，反应温度为60℃至90℃，得产物。本发明化合物通过体内体外的药理实验，结果表明，该类化合物均具有较好的保护缺氧心肌细胞的作用，可制备治疗缺血性心脏病的药物。

说明书

技术领域

本发明属药物合成领域，具体涉及(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸及其合成方法和在药学上的应用。

技术背景

丹参素(化学名：D-(+)-β-3，4-二羟基苯基乳酸)是中药丹参中的一种主要有效成分，已有大量药理实验证明丹参素有抑制血小板合成、聚集，抑制TXA₂等收缩血管物质的释放，提高抗氧化酶活性，减少氧自由基的产生，增加冠脉血流量等药理作用。目前丹参素的来源主要是从中药丹参中提取，以丹参素为主要成分的多种中药复合制剂如复方丹参注射液、复方丹参滴丸等已广泛应用于临床。关于消旋丹参素的化学合成方法已有一些报道，例如：薛芬等(薜芬，戴华娟，丁丽蓉，上海第一医学院学报，1983，10(2)，133-136.)。由于丹参素结构中有两个极易被氧化的酚羟基，不宜利用直接拆分的方法对丹参素外消旋体进行手性拆分来获得天然的右旋丹参素。寻找新的丹参素的衍生物及其合成方法成为本领域研究人员的关注热点。

发明内容

本发明的目的是提供新结构的化合物(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸。

本发明的另一目的是提供(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸的合成方法。

本发明提供的化合物(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸具有式(I)的结构：

本发明还提供了上述化合物的合成方法。

本发明按下述反应流程制备所述的化合物：

上述步骤1：3，4-二羟基苯甲醛、无水醋酐、无水醋酸钠、N-乙酰甘氨酸一起加入反应瓶中，加热至100℃反应2小时，倒入冷水中(Harington，C.R.；Randall，S.S.Biochem.J.1931，25，1028-1031.)，或，3，4-二羟基苯甲醛与无水醋酐、无水醋酸钠先在室温下反应3小时，向反应液中加入N-乙酰甘氨酸，加热至100℃反应2小时，再倒入冷水中；

步骤2：步骤1所得产物在9％盐酸中60℃反应3小时至24小时，反应温度为60℃～90℃，得产物(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸。

本发明的进一步目的是提供合成的(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸对缺血缺氧心肌的保护作用。

按常规方法通过体外培养原代心肌细胞，建立心肌细胞缺氧模型，实验分为正常对照组：不给于药物干预，不缺氧缺糖；模型组：不给于药物干预，缺氧缺糖5h；用药组：分别给予药物10^-8mol/L、10^-7mol/L、10^-6mol/L，缺氧缺糖，检测(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸对缺氧心肌细胞的保护作用；

通过急性和慢性大鼠心肌梗死模型，检测(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸对缺氧心肌的保护作用，

体内和体外的药理实验结果表明，本发明合成的化合物对缺血心肌具有保护作用，可降低心肌细胞LDH漏出率，升高细胞内SOD活性，降低细胞内脂质过氧化产物MDA的产生，并能够影响bax、bcl-2基因及蛋白的表达，具有抗凋亡作用。本发明化合物可制备治疗缺血性心脏病的药物。

附图说明

图1是(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸的单晶结构图。

图2是丹参素衍生物对缺氧心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的影响。

图3是丹参素衍生物对缺氧心肌细胞内超氧化物岐化酶(SOD)活性的影响。

图4是丹参素衍生物对缺氧心肌细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的影响。

图5是丹参素衍生物对缺氧心肌细胞内抗凋亡蛋白bcl-2mRNA表达的影响。

图6是丹参素衍生物对缺氧心肌细胞内促抗凋亡蛋白bax mRNA表达的影响。

图7是丹参素衍生物对缺氧心肌细胞内凋亡蛋白caspase-3mRNA表达的影响。

具体实施方式

本发明通过下列各实施例更具体描述了本发明的化合物及其合成方法。

实施例1按下述反应流程，制备(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸

在250mL茄形瓶中加入3，4-二羟基苯甲醛10.8g，0.078mol与无水醋酐30mL，32.4g，0.319mol无水醋酸钠6.4g，0.078mol，室温下反应3小时，以石油醚/乙酸乙酯(V/V＝2∶1)为展开剂，TLC显示原料点(R_f＝0.3)消失，出现新点(R_f＝0.4)。继续向反应液中加入N-乙酰甘氨酸(9.2g，0.0789mol)，加热至100℃反应2小时，TLC显示产物点的R_f值仍为0.4，停止反应，将反应液趁热倒入400mL冷水中，过夜，有黄色固体析出，将固体过滤后溶于乙酸乙酯重结晶，得到中间体(1)黄色固体(Z)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸12.08g，收率48％，mp 183-185℃(文献值：186-187℃)(Wong，H.Synthesis.1992，793-797).¹H NMR(400MHz CDCl₃)δ2.08(s，3H，2-NHCOCH₃)，2.28(2s，6H，3’-CH₃COO，4’-CH₃COO)，7.06(s，1H，3-H)，7.14(m，3H，2’-H，5’-H，6’-H)，8.01(s，1H，2-NHCOCH₃)；

在250mL茄形瓶中加入中间体(1)(2g，0.012mol)，9％盐酸50mL，加热至60℃，原料未全溶，反应3小时，反应液中有粉红色固体析出，以乙酸乙酯/乙酸(V/V)＝8∶1为展开剂，TLC显示紫外灯下原料点(R_f＝0.6)消失，出现新点(R_f＝0.5)，浸磷钼酸后新点能烤出蓝色，原料点不能烤出蓝色，停止反应，冷却至室温，过滤得红色固体(2)1.27g，收率86％。红色固体为本化合物，在水中反复重结晶得无色片状晶体。X线单晶衍射确证结构，，mp 229-230℃ ¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ2.13(s，3H，2-OCOCH₃)，6.77(d，1H，J＝8.21Hz，5’-H)，6.96(d，1H，J＝8.41Hz，2’-H)，7.16(d，1H，J＝1.95Hz，6’-H)，7.38(s，1H，3-H).¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)δ22.58，116.28，117.55，123.50，124.89，126.60，137.09，146.35，148.81，168.68，173.46.MS(ESI)m/z：238(M⁺).

实施例2(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸单晶的培养及晶体结构的测定

取所制得的化合物(2)，溶于水，室温下静置数天，析出无色片状晶体，选取大小为0.421mm×0.347mm×0.250mm的化合物单晶，在Bruker Smart CCD单晶衍射仪上，采用石墨单色化的Mo Kα(λ＝0.071073nm)辐射源，在20℃以ω-2θ扫描方式收集数据，确证其分子结构(图1)。

分子式：C₁₁H₁₀O₆.分子量：238.19.晶体属单斜晶系.空间群为P2(1)/c.晶胞参数：a＝1.05986(13)nm，b＝0.93423(11)nm，c＝1.19601(15)nm.V＝1.0751(2)nm³.数据收集的θ范围从2.12到26.50°.Z＝4.Dc＝1.472g/cm³.F(000)＝496.优化方法：full-matrix least-squares on F².Goodness-of-fit on F²：1.075.最终偏离因子R为[I＞2σ(I)]：0.0610，0.1776.R(all data)：0.0700，0.1858.Largest diff.peak andhole：0.695 and-524e/nm³。

实施例3(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸对缺氧心肌细胞的保护实验

按常规方法，通过原代培养新生大鼠心肌细胞，建立心肌细胞缺氧模型。实验分为正常对照组：不给于药物干预，不缺氧缺糖；模型组：不给于药物干预，缺氧缺糖5h：用药组：分别给予药物10^-8mol/L、10^-7mol/L、10^-6mol/L，缺氧缺糖。结果显示，本发明中的化合物可降低缺氧心肌细胞LDH漏出率，正常对照组细胞内LDH为100％，各用药组与缺氧组细胞内LDH与正常对照组的差值为LDH漏出率。与缺氧组比较，本化合物能降低细胞内LDH漏出率(图2)；可提高细胞内超氧化物岐化酶(SOD)活性，与缺氧组比较，化合物2能升高细胞内SOD活性(图3)；可抑制细胞内脂质过氧化产物(MDA)的产生，与缺氧组比较，本化合物能降低细胞内MDA的含量(图4)；可促进抗凋亡基因bcl-2的表达。与缺氧组比较，本化合物可升高细胞内抗调亡基因bcl-2mRNA的表达(图5)；可抑制促凋亡基因bax的表达，与缺氧组比较，本化合物可降低细胞内促调亡基因bax mRNA的表达(图6)；可抑制凋亡基因caspase-3的表达，与缺氧组比较，本化合物可降低细胞内调亡基因caspase-3mRNA的表达(图7)。

实施例4(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸对急性心肌梗死和慢性心衰的保护实验

成年健康SD大鼠，预给药1周，麻醉后开胸，结扎左冠状动脉前降支，制备心肌梗死模型，术后继续给药两天，处死，取血浆及心肌组织，检测血浆中心激酶如乳酸脱氢酶、肌酸激酶的活性，心肌组织匀浆，分别检测梗死面积、炎性因子、抗氧化、抗凋亡等蛋白的基因及蛋白表达水平；

成年健康SD大鼠，制备心肌梗死模型，术后两天存活的大鼠，随机分组，连续给药6周，处死，取血浆及心肌组织，检测血浆中心激酶如乳酸脱氢酶、肌酸激酶的活性，心肌组织匀浆，分别检测炎性因子、抗氧化、抗凋亡等蛋白的基因及蛋白表达水平；

结果表明，(Z)-2-乙酰氧基-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸能够减小梗死面积，降低血清中心激酶活性，并具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，证实本发明化合物对急性心肌梗死和慢性心衰有保护作用。