一种快速检测水稻种子纯度和真伪的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种快速检测水稻种子纯度和真伪的鉴定方法，该方法包括下列步骤：首先是供试材料DNA的提取；其次是利用专利中的SCAR标记对提取的DNA进行PCR扩增检测；第三是是扩增DNA片段的比较分析。该套标记的发明用于水稻种子纯度和真伪鉴定，不仅具有环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异及实验结果的可靠性等基本特点，在应用上还具有快速、简便、低成本的优点，适合于构建植物品种的特异性指纹图谱、大样品的种子纯度快速分析、假冒伪劣品种的检测鉴定、分子标记辅助育种、基因克隆等方面的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用分子标记检测技术领域，更具体涉及一种快速定性快速分析大样品水稻种子的纯度、鉴定假冒伪劣品种和构建多品种的特异性指纹图谱的方法，该方法还适用于分子标记辅助选择育种，同时可以将SCAR标记作为探针，筛选基因组文库，应用于图位克隆构建重叠群。

背景技术

水稻是我国的第一大粮食作物，尤其杂交稻占水稻播种总面积的60％左右，播种面积大、种子销售利润高，在我国粮食生产中占有十分重要地位。在水稻品种繁殖、杂交水稻制种过程中不育系或恢复系育性不稳、机械混杂、生物学混杂等都会降低种子纯度，影响水稻产量，给生产者和经营者带来较大的商业风险。此外，人为造假导致的坑农事件曾经给农业生产带来巨大损失。为了确保生产用种安全，常规的种子纯度鉴定方法是赴海南加代种植，进行形态学鉴定。这种方法不仅受生长季节和环境的限制，而且鉴定周期长，费时费工，不利于种子鉴定的商品化运作和司法举证。因此，开发不受环境影响、快捷经济、可靠的种子指纹鉴定技术就显得十分必要。我国加入WTO和UPOV组织后，一个新品种的推广、产权保护都必须提供该品种的特异鉴定标记和DNA指纹，从这个意义上讲，建立品种特异性标记指纹也势在必行。

品种指纹包括蛋白质指纹和DNA指纹两类。蛋白质指纹是20世纪80年代发展起来的一项种子鉴定技术，包括种子贮藏蛋白、同工酶和等位酶鉴定等，是利用不同品种在蛋白质组成成分上的差异来反映作物遗传组成的不同。小麦、大麦醇溶蛋白PAGE，豌豆、黑麦草种子蛋白PAGE，杂交玉米醇溶蛋白等电聚焦电泳等已成为国际种子检测协会(ISTA)的标准检验技术。DNA指纹是近年来随着分子标记的发展而建立起来、直接检测不同品种间基因组DNA序列多态性的品种鉴定技术。在过去20年中，随着基因组计划研究的不断深入，DNA分子标记得到了迅速发展并被广泛用于分子生物学研究的各个领域。已经发展起来的分子标记多达60多种，如以传统的Southern杂交为基础的RFLP、SSCP、RFLP、DGGE-RFLP分子标记，以PCR为基础的RAPD、STS、EST、SCAR、RP-PCR、AS-PCR、SSCP-PCR标记，以基因组序列为基础的SNP、InDel、cSSR标记等，这些标记无疑为各种植物(品种)DNA指纹鉴定提供了坚实的技术基础。

李云海等(1999，2000)曾利用RAPD和SSR技术分别分析了具有多种质源和较大应用面积的24个水稻胞质雄性不育系、1个光(温)敏核不育系、3个保持系和5个生产中应用较广的恢复系。平均每个RAPD引物具有3.4条多态性片断，每对SSR引物可检测到5.1个等位基因。聚类分析表明，生产上主要应用的不育系遗传背景单一。唐梅等(2000，2002)用RAPD标记检测16个杂交水稻骨干保持系，从250个引物中筛选出10个引物，扩增出84条带。品种间多态性频率为72.6％，遗传距离在0.0526～0.2152之间，69％的保持系聚为一类；用4对AFLP引物组合对10个恢复系，5个不育系进行了AFLP多态性分析。共扩出165条多态性带，多态性为66.43％，但亲本间遗传距离小。段世华等(2001，2002)应用RAPD和SSR标记分析了我国杂交水稻35个主要恢复系的多态性。从258个RAPD引物中筛选出13个，检测出多态性片段93条，但是大部分材料的遗传相似系数在0.80以上；25对SSR引物检测到65个等位基因，平均每对引物检测到2.6个等位基因，但遗传差异小。近年来许多研究者尝试利用分子标记进行杂交组合及亲本的区别鉴定，并取得了一些进展。研究表明，利用多条分子标记可以区分某些组合及其亲本。李莉等(2000)对协优63、64及其亲本进行RAPD和SSR分析，筛选出9个随机引物和13对SSR引物分别可以在供试的水稻组合与亲本之间，以及杂交组合之间进行区别和鉴定。向太和等(2000)筛选出8个随机引物，稳定扩增出的12个强的多态性标记能够有效地区别汕优63、汕优64和汕优晚3及其亲本。毛加宁等(2002)筛选出6个引物，扩增出20个强多态性标记，能有效地区分红莲2号、汕优63、马协63三组三系杂交水稻中不育系、保持系、恢复系和F1。

多条分子标记固然可以鉴定杂交组合的纯度和真实性，但无疑增加了鉴定的经济成本和时间。因此，开发单一的特异标记是杂交组合DNA指纹分析的首选。特异标记的筛选虽有报道，但应用还有局限。陈洪等(1996)筛选出随机引物P18可稳定地扩增出一条来源于父本明恢63的0.8kb左右的特异条带，且在18种不同类型的常用水稻品种中具有较高的特异性，在汕优63杂种纯度鉴定中，用P18可以鉴定出不育系、保持系和大部分水稻品种的机械混杂和人为造假等因素造成的假杂种，但无法分辨出具有0.8kb特异条带的一些水稻品种所造成的假杂种。杨蜀岚等(1998)筛选出的引物operon220能使培矮64s扩增出一条1.8kb的特异带，可以区别以它为母本的杂种种子及其它种子，同时还扩增出恢复系山青、特青的一条0.8kb左右的特性带，使它们的F1种子与母本培矮64s分开。从目前研究来看，某些组合可以利用单一的分子标记将杂种F1从其亲本中区分出来进行纯度鉴定。彭锁堂等(2003)用引物RM17对汕优63和两优培九进行了100粒单种子的鉴定，所测纯度与田间种植鉴定结果接近。但种子真实性问题还不能有效解决。

RAPD技术在种质鉴定中有广泛的应用前景，它所需的样品DNA量少，反应灵敏度高，没有组织和发育阶段的特异性，易于早期快速检测，能大量揭示从形态和生理生化指标上无法检测到的丰富差异，但这项技术还有不够稳定以及分析相对复杂的缺点。SCAR(特征性片段扩增区域，Sequence Characterized AmplifiedRegion)标记，利用基因组已知序列设计一对特异性扩增引物，对基因组限定区域可重复高特异性的扩增，并以此来作为基因组特定的标记。SCAR引物设计原则是根据原来RAPD引物再向内延伸10到15个碱基。这种高特异性的标记克服了RAPD标记的缺陷，并有以下优点：(1)用一对互补到专一基因组位点的长引物和严格的PCR条件，得到了可靠的可重复的带，它们对反应条件不敏感；(2)对于构建遗传图谱而言共显性的SCAR标记比显性的RAPD标记信息要多得多；(3)SCAR片段本身即是基于PCR技术的标记，可作为物理图谱与遗传图谱的锚定点，对于基于图谱的重叠克隆具有很高的实用价值，以此标记为锚定点或直接做染色体步查得到基因所在区域。从而为最终实现对生性状相关基因定位、遗传图谱构建，并为优良多基因聚合分子标记辅助选择育种，品种鉴定，性别鉴定奠定了试验基础。如将RAPD标记转化为SCAR-PCR标记后，则可以增强所获得的RAPD标记的特异性，并可简化PCR分析。本研究在对22种华中地区主要杂交籼稻亲本材料进行RAPD分析的基础上，建立25对特异SCAR分子标记，用于水稻品种纯度和真伪度的鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测水稻品种纯度和真伪的鉴定方法，该套标记的发明用于水稻种子纯度和真伪鉴定，不仅具有环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异及实验结果的可靠性等基本特点，在应用上还具有快速、简便、低成本的优点，适合于构建多品种的特异性指纹图谱、大样品的种子纯度快速分析、假冒伪劣品种的检测鉴定、分子标记辅助育种、基因克隆等方面的应用。该方法可以使原来盲目的大量的田间种植鉴定工作被简单的实验室操作所取代，能快速准确地鉴定水稻品种纯度和真伪，大幅度地减少了人力资源的浪费，提高了工作效率和准确度。将有力促进保护品种选育和合法经营者的合法权益以及育种研究的原始科技创新。

为了实现上述目的，本发明涉及以下技术措施：

1、水稻基因组DNA的提取

采用Murray和Thompson的CTAB法(Nucleic Acids Res.1980，8：4321-4325)提取DNA，简要如下：

(1)选择来自国际水稻所的IRRI011、IRRI012、IRRI013、IRRI014、IRRI016、IRRI022、IRRI025、IRRI029、IRRI030、IRRI031、IRRI046、IRRI050、IRRI053、IRRI057、IRRI060、IRRI066、IRRI078、IRRI081、IRRI086、IRRI087、IRRI099和IRRI111共22个农家种(见下表)，分别取0.1g水稻嫩叶，剪碎0.3cm×0.5cm左右小片段装入一1.5ml离心管中，然后加入一颗直径3mm的普通钢珠，在细胞破碎仪(德国RETSCH公司，TissueLyser II型)上将叶片研磨成浆，加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min。

(2)在水浴后的离心管中加入500μl氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，充分混匀，台式离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管。

(3)加入600μl冷冻的国产无水乙醇，充分混匀，4oC或冰上放置20min，12000rpm离心15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min滤干酒精，然后将DNA溶于30μl TE，-20oC保存；使用时稀释至50ng/μl。

2、RAPD筛选材料：

标准的RAPD-PCR扩增反应体系(体积为10μl)，组成如下：

总DNA                    1.0μl(50ng)

10×PCR buffer(pH8.3)    1.0μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μm dNTP               0.8μl

一单位Taq酶              0.5μl

5pM的引物              0.5μl

去离子无菌水(ddH₂O)    5.6μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：94℃5min

35cycle：94℃1min；37℃1min；72℃1.5min

1cycle：72℃10min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物用1.5％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)中电泳，凝胶成像仪中观察有无多态性并照相保存。

3、重复性验证多态性和标记片段的回收、检测：

如果检测出RAPD特异性标记片段，再以20μl的反应体系用同种引物S1224(上海生工)来扩增含RAPD特异性标记片段的材料，并进行阴性对照，扩增产物在1.0％(质量比)琼脂糖凝胶中(含0.5μg/ml EB)电泳分离。

在紫外透照仪上，用无菌刀片挖出琼脂糖凝胶上的目标，带放入无菌Eppendorf管，用天平称量琼脂糖凝胶重量，并估算体积(1g≈1ml)，用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒按照其操作要求回收RAPD特异性标记片段DNA。

(1)向吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，室温(20-25℃，以下相同)12000rpm离心1min，倒上清液。

(2)向盛胶的1.5ml EP管中加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴5-10min，其间翻转温和，直到琼脂糖凝胶完全熔化。

(3)所得胶融化液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，室温12000rpm离心30-60sec，倒洗液。

(4)于CA2中加入700μl漂洗液PW(已加无水乙醇)，室温12000rpm离心30-60sec，倒洗液。

(5)于CA2中加入500μl漂洗液PW，室温12000rpm离心30-60sec，倒洗液。

(6)室温12000rpm离心2min，开盖室温放置10-20min，晾干。

(7)CA2柱放一干净的1.5ml EP管中，滴加洗脱缓冲液EB 30μl，室温放置2min。

(8)室温12000rpm离心2min，收集DNA溶液。

(9)并吸取5μl在浓度为1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)中电泳检测。

4、标记带的连接、转化与克隆：

用Takara公司的pMD18-T载体建立6μl的反应体系，16℃连接过夜，连接反应体系如下：

Solution I(2×)                3.0μl

Vector(pMD18-T)                0.3μl

DNA                            2.7μl

热激法将连接产物转化到大肠杆菌DH5α(大肠杆菌K-12的衍生菌)感受态细胞里。

(1)取分装好的DH5α感受态EP管(200μl)，置于冰盒中。

(2)加6μl连接产物于感受态DH5α中。

(3)42℃热激90s，立即置于冰盒中2min。

(4)加入900μl LB培养基(不加氨苄)于感受态EP管中。

(5)37℃，150rpm摇床摇1h，观察浑浊度。

(6)吸出100μl培养物涂于含X-gal和IPTG的氨苄青霉素LB选择培养基。

(7)于37培养箱中培养14h。

观察菌落(E.coli DH5α)的长势，挑选白色菌落(E.coli DH5α)(5个)，摇菌保种(37℃，150rpm培养16h)，并做菌液PCR检测，菌液PCR扩增反应(体积为10μl)，组成如下：

菌液(E.coli DH5α)              1.0μl

10×PCR buffer(pH8.3)           1.0μl

25mM MgCl₂                      0.6μl

25μm dNTP                      0.8μl

一单位Taq酶                     0.5μl

5pM的M13引物F(通用)             0.25μl

5pM的M13引物R(通用)             0.25μl

去离子无菌水(ddH₂O)             5.6μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：95℃5min

35cycle：95℃1min；55℃1min；72℃1min

1cycle：72℃5min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物在浓度为1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)中电泳，在凝胶成像仪中观察并照相保存，观察阳性克隆的比例。

5、测序、引物设计与引物合成：

(1)菌种送至联合基因公司进行DNA测序。

(2)利用Generunner软件对测序结果进行序列分析并设计成SCAR引物，命名为SC10.2(SC代表SCAR标记，10代表在10号染色体，2代表该染色体上的第2个分子标记)，由上海英骏公司合成。

(3)在GRAMENE网站上进行Sequences-BLAST，筛选出25对均匀分布于水稻12条染色体、特异性好的SCAR分子标记，根据其在染色体上的分布命名；SCAR分子标记的设计原则是根据原来RAPD引物再向内延伸8到12个碱基，根据筛选引物的多态性及其在条染色体上平均，选择其中25对特异性好的SCAR分子标记，平均分布于12条染色体上，具体序列等参数见下表。

  序列  号  SCAR标  记编号  引物序列  退火  温度  扩增片断  大小  染色体定位  1  SC1.1  F：CCTGTTCCCGCGCACGC  R：CCTGTTCCCGCAACAATCC  60℃  776bp  1号染色体  2  SC1.2  F：CCGAGCCGTCAATCACTCAC  R：ACACCGATGGAACAGGGTTG  63℃  594bp  1号染色体  3  SC1.3  F：AATTAAGCCTCGTTGTCG  R：TTTCACCCATCTCACACG  53℃  817bp  1号染色体  4  SC2.1  F：TTGCTCACGGGCAGAGAGA  R：TTGCTCACGGCTGACGGGA  61℃  503bp  2号染色体  5  SC2.2  F：GGCGCGTTAGGCTGTCGTGT  R：GGCGCGTTAGACGGGGCG  65℃  1045bp  2号染色体  6  SC3.1  F：TGGTCGGGTGAGAGAAAAG  R：GGTCGGGTGCCAACCTTG  60℃  638bp  3号染色体  7  SC3.2  F：ACTGGGTCGGCAAATCCTG  R：ACTGGGTCGGCTTGGGAAA  60℃  1435bp  3号染色体  8  SC4.1  F：CAGCACTGACAGGACGAG  R：CAGCACTGACTTCAAATGG  58℃  857bp  4号染色体

  9  SC4.2  F：CCCCTCACGACGATTCTAG  R：CCCCTCACGATATCGATTAAG  60℃  780bp  4号染色体  10  SC5.1  F：GGACACAGAGGAATGAGGAA  R：GGACACAGAGCTTTCACTTT  59℃  809bp  5号染色体  11  SC5.2  F：TGCCTCGCCAACTATCTTA  R：TGCCTCGCCATTCACCAAG  58℃  925bp  5号染色体  12  SC6.1  F：CCGTCCCTGATCAAAG  R：CCGTCCCTGACTAAGTAC  53℃  806bp  6号染色体  13  SC6.2  F：CTGTCTGTGGTCGATCGA  R：CTGTCTGTGGGAGTGGAG  57℃  823bp  6号染色体  14  SC7.1  F：ACAACGCCTCATAACAAAG  R：TGCCTAGGAGCCTAGCAG  56℃  906bp  7号染色体  15  SC7.2  F：CTGATCGCGGACTCATAGAT  R：CTGATCGCGGCCCAAGTAC  61℃  632bp  7号染色体  16  SC8.1  F：CCTGGAGCTTAGAGAGAC  R：AGCTTGTCCGAGAATGTC  56℃  568bp  8号染色体  17  SC8.2  F：CTGTCTGTGGTCTCGATAT  R：CTGTCTGTGGGAGTGGAG  57℃  514bp  8号染色体  18  SC9.1  F：GGATCGTCGGCGCAGGGGA  R：GGATCGTCGGGACACGAAGT  65℃  870bp  9号染色体  19  SC9.2  F：TCTGGACGGACGTGTTGAC  R：TCTGGACGGATTCCGGAC  58℃  373bp  9号染色体  20  SC10.1  F：ACGACGAAAATACCACAGC  R：TCCTCGTGGGAACGGTCC  58℃  812bp  10号染色体  21  SC10.2  F：GGACACCACTAATACAGCC  R：GGACACCACTGTAAAAATAGC  60℃  756bp  10号染色体  22  SC11.1  F：ACGCCAGTTCAGCAGGATC  R：CGCCAGTTCCCGTATTCG  60℃  778bp  11号染色体  23  SC11.2  F：GGAGTGGACTAAGAAACAG  R：GGAGTGGACTGCAAAGTAAA  56℃  630bp  11号染色体  24  SC12.1  F：ACCCCCCACTCAGGCACC  R：ACCCCCCACTAACGACCC  60℃  573bp  12号染色体  25  SC12.2  F：AGTCCGCCTGCAGTAAG  R：AGTCCGCCTGGGATAATG  56℃  162bp  12号染色体

6、SCAR标记的PCR验证：

用合成的SCAR引物对原材料的阳性株和阴性株进行PCR验证，PCR扩增反应体系(体积为10μl)，组成如下：

DNA模板                  1.0μl(约50ng)

10×PCR buffer(pH8.3)    1.0μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μm dNTP             0.8μl

一单位Taq酶            0.3μl

5pM的SCAR引物F         0.25μl

5pM的SCAR引物R         0.25μl

去离子无菌水(ddH₂O)    5.8μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：94℃5min

30cycle：94℃1min；50～60℃1min(据具体引物的设计情况而定)；

72℃1.5min

1cycle：72℃10min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物在(Sigma公司PCR专用)1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)中电泳分离，在凝胶成像仪中观察并照相保存，比较退火温度、扩增带的大小是否与理论分析的一致，验证分子标记的准确性。

7、供试材料DNA的提取：

采用Murray和Thompson的CTAB法(Nucleic Acids Res.1980，8：4321-4325)提取DNA，简要如下：

(1)分别取0.1g供试材料的水稻嫩叶，剪碎0.3cm×0.5cm左右小片段装入一1.5ml离心管中，然后加入一颗直径3mm的普通钢珠，在细胞破碎仪(德国RETSCH公司，TissueLyser II型)上将叶片研磨成浆，加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min。

(2)在水浴后的离心管中加入500μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀，台式离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管。

(3)加入600μl冷冻的国产无水乙醇，充分混匀，4℃或冰上放置20min，12000rpm离心15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于30μl TE，-20℃保存；使用时稀释至50ng/μl。

8、SCAR标记对供试材料的PCR扩增检测：

用合成的25对SCAR引物对所有检测材料进行PCR验证，PCR扩增反应体系(体积为10μl)，组成如下：

DNA模板                  1.0μl(50ng)

10×PCR buffer(pH8.3)    1.0μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μm dNTP               0.8μl

一单位Taq酶              0.3μl

5pM的SCAR引物F           0.25μl

5pM的SCAR引物R           0.25μl

去离子无菌水(ddH₂O)      5.8μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：94℃5min

30cycle：94℃1min；50～60℃1min(据具体引物的设计情况而定)；

72℃1.5min

1cycle：72℃10min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物在浓度为1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)中，在凝胶成像仪中观察并照相保存。

9、样品的相似性检测：

(1)对所有25对SCAR引物扩增、电泳检测，统计分析扩增图谱。如果所有分析材料只有一条扩增带，那么有带记为1，无带记为0；如果所有分析材料中有的有一条以上扩增带，那么最大的带记为1，其次记为2，依此类推，而无带的则分别记为0；

(2)通过NTSYS程序运算进行聚类分析，建立相似性树状图，从而达到水稻种子纯度和真伪鉴定的目的。

本发明的优点

本发明与传统鉴定方法相比具有以下优点和效果：

(1)快速、准确、可靠：核酸提取加上PCR反应，总共仅需3-4小时。

(2)可同时进行高通量的样品检测：一次PCR反应可以检测96个材料。

(3)设备简单，只需要PCR仪、电泳仪、台式离心机等即可，普通的分子生物学实验室皆可完成。

(4)方法简便、操作方便：PCR反应不需要特别的技术培训，一般的大学毕业生或经过短暂培训的实验员均可独立操作。

(5)采用高压对SCAR-PCR产物进行快速电泳，所用的琼脂糖材料节省并可反复利用、电泳时间短，这为采用分子方法鉴定大批量杂交种子的纯度与真实性提供了快速简单的检测SCAR-PCR扩增产物的方法。

(6)SCAR标记用于品种和种子纯度鉴定，不仅具有环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异及实验结果的可靠性等基本特点，在应用上还具有快速、简便、低成本的优点，适合于大量样品的快速分析。

(7)本探究筛选出25对特异性好的SCAR标记，均匀分布于水稻12条染色体上(除1号染色体上三对SCAR标记外，其余每条染色体上两对SCAR标记)，较全面系统，并且对湖北省杂交组合区试水稻品种进行了鉴定，提供了一套可用于鉴定这些杂交稻组合及其亲本的参考图谱，为供试杂交稻及其种子纯度的简便、高效鉴定提供了基础。

(8)此套标记还可用于分子标记辅助选择育种，同时可以将SCAR标记作为探针，筛选基因组文库，为图位克隆构建重叠群。

附图说明

图1：RAPD随机引物S1244在12个不同农家水稻品种的PCR扩增图谱。Marker，DNA分子量标记DL2000；1-12分别为IRRI011、IRRI012、IRRI013、IRRI025、IRRI029、IRRI031、IRRI057、IRRI066、IRRI078、IRRI086、IRRI087、IRRI099。其中IRRI057和IRRI078各有一条750bp左右特异性条带。其它材料均无。

图2：特异性条带回收后检测图谱。Marker，DNA分子量标记DL2000；1为回收IRRI057的750bp左右特异性条带。

图3：菌液PCR检测图谱。Marker，DNA分子量标记DL2000；1-5为从X-gal和IPTG的氨苄青霉素LB选择培养基挑选的单克隆做菌液PCR检测后的图，显示均为阳性克隆。

图4：本专利中筛选出的25对特异性SCAR分子标记，均匀分布于水稻12条染色体上，并根据其在染色体上的分布命名成SCAR标记。

图5：利用设计的SC10.2标记对原RAPD筛选的材料进行DNA扩增验证。只有在IRRI057和IRRI078材料中扩增出唯一的一条756bp扩增带，而该对引物在其他供试水稻材料中无相应的扩增带。Marker，DNA分子量标记DL2000。

图6：SCAR标记SC10.2对区试杂交组合材料的分析。Marker，DNA分子量标记DL2000；1，2为湖北省杂交组合(早稻)2个材料11-01、11-02；3-12为国家杂交组合(早稻)10个材料C-1、C-3、C-4、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12；13-38为湖北省杂交组合(中稻)25个材料2101、2102、2103、2104、2105、2106、2107、2108、2109、2110、2111、2112、2201、2202、2203、2204、2205、2206、2207、2208、2209、2210、2211、2212、B1、B2。

图7：应用平均距离法(UPGMA)聚类分析所检测的76个杂交稻组合，通过NTSYS程序运算建立聚类图。

具体实施方式

一种利用分子标记快速检测水稻种子纯度和真伪的鉴定方法，具体步骤如下：

1、水稻基因组DNA的提取：

采用Murray和Thompson的CTAB法(Nucleic Acids Res.1980，8：4321-4325)提取DNA，简要如下：

(1)选择来自国际水稻所的IRRI011、IRRI012、IRRI013、IRRI014、IRRI016、IRRI022、IRRI025、IRRI029、IRRI030、IRRI031、IRRI046、IRRI050、IRRI053、IRRI057、IRRI060、IRRI066、IRRI078、IRRI081、IRRI086、IRRI087、IRRI099和IRRI111共22个农家种(见下表)，分别取0.1g水稻嫩叶，剪碎0.3cm×0.5cm左右小片段装入一1.5ml离心管中，然后加入一颗直径3mm的普通钢珠，在细胞破碎仪(德国RETSCH公司，TissueLyser II型)上将叶片研磨成浆，加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min。

  编号  材料名称  来源国家  IRRI 011  O.SATIVA.US037TOS7614/US037  Cameroon  IRRI 012  O.SATIVA-US037.TUS10822/USO23  Cameroon  IRRI 013  O.SATIVA-CHIKON SHONI/113/83/050  Bagladesh  IRRI 014  O.SATIVA-LALCHI AUS/113/83/056  Bagladesh  IRRI 016  O.SATIVA-BJANAM/115/83/012  Bhutan  IRRI 022  O.SATIVA-HANGIMOTHA/17/84/019  Srilanka  IRRI 025  O.SATIVA-MAGODAAL/17/84/080  Srilanka

  IRRI 029  O.SATIVA-ALOR KUNING/44-13/84/005  Indonesia  IRRI 030  O.SATIVA-LEKAT GAYO  Indonesia  IRRI 031  O.SATIVA-YARKYAW HTUN/MY90-C31  Myanmar  IRRI 046  O.SATIVA-DEKALE/MY92-S28  Myanmar  IRRI 050  O.SATIVA-BIJRI/41  India  IRRI 053  O.SATIVA-DUDH MALAI/19  India  IRRI 057  O.SATIVA-BOOTI/1018(2)  Pakistan  IRRI 060  O.SATIVA-JIBONI/57/85/195  Malaysia  IRRI 066  O.SATIVA-JIBONI/57/85/195  Malaysia  IRRI 078  O.SATIVA-MAMANAYO  Malaysia  IRRI 081  O.SATIVA-KAPHOOR.SAI/175  India  IRRI 086  O.SATIVA-GANJA PAK.ACC.3084/1568(1)  Pakistan  IRRI 087  O.GLABERRIMA-ESSANIOUNIAYE/TOG12345/SG393  Senegal  IRRI 099  O.SATIVA-KRTTKAI.SL.III-1//IRIPI/11  Bangladesh  IRRI 111  O.SATIVA-I-JAE/086/88/112  Thailand

(2)在水浴后的离心管中加入500μl氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，充分混匀，台式离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管。

(3)加入600μl冷冻的国产无水乙醇，充分混匀，4oC或冰上放置20min，12000rpm离心15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min滤干酒精，然后将DNA溶于30μl TE，-20oC保存；使用时稀释至50ng/μl。

2、RAPD筛选材料：

标准的RAPD-PCR扩增反应体系(体积为10μl)，组成如下：

总DNA                    1.0μl(50ng)

10×PCR buffer(pH8.3)    1.0μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μm dNTP               0.8μl

一单位Taq酶              0.5μl

5pM的引物                0.5μl

去离子无菌水(ddH₂O)      5.6μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：94℃5min

35cycle：94℃1min；37℃1min；72℃1.5min

1cycle：72℃10min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物用1.5％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)中电泳，凝胶成像仪中观察有无多态性并照相保存。如用RAPD引物S1224(上海生工)筛选12种农家水稻材料，其中在两种材料IRRI057和IRRI078扩出一条750bp左右特异性条带，而其它材料均IRRI011、IRRI012、IRRI022、IRRI025、IRRI029、IRRI046、IRRI057、IRRI066、IRRI078、IRRI086、IRRI087、IRRI099无(图1)。

3、重复性验证多态性和标记片段的回收、检测：

如果检测出RAPD特异性标记片段，再以20μl的反应体系用同种引物S1224(上海生工)来扩增含RAPD特异性标记片段的材料，并进行阴性对照，扩增产物在1.0％(质量比)琼脂糖凝胶中(含0.5μg/ml EB)电泳分离。

在紫外透照仪上，用无菌刀片挖出琼脂糖凝胶上的目标，带放入无菌Eppendorf管，用天平称量琼脂糖凝胶重量，并估算体积(1g≈1ml)，用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒按照其操作要求回收RAPD特异性标记片段DNA。

(1)向吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，室温(20-25℃，以下相同)12000rpm离心1min，倒上清液。

(2)向盛胶的1.5ml EP管中加入3倍体积的溶胶液PN，50oC水浴5-10min，其间翻转温和，直到琼脂糖凝胶完全熔化。

(3)所得胶融化液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，室温12000rpm离心30-60sec，倒洗液。

(4)于CA2中加入700μl漂洗液PW(已加无水乙醇)，室温12000rpm离心30-60sec，倒洗液。

(5)于CA2中加入500μl漂洗液PW，室温12000rpm离心30-60sec，倒洗液。

(6)室温12000rpm离心2min，开盖室温放置10-20min，晾干。

(7)CA2柱放一干净的1.5ml EP管中，滴加洗脱缓冲液EB 30μl，室温放置2min。

(8)室温12000rpm离心2min，收集DNA溶液。

(9)并吸取5μl在浓度为1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)中电泳检测。例如图2显示的是从IRRI057回收的一条750bp左右特异性条带。

4、标记带的连接、转化与克隆：

用Takara公司的pMD18-T载体建立6μl的反应体系，16℃连接过夜，连接反应体系如下：

Solution I(2×)                3.0μl

Vector(pMD18-T)                0.3μl

DNA                            2.7μl

热激法将连接产物转化到大肠杆菌DH5α(大肠杆菌K-12的衍生菌)感受态细胞里。

(1)取分装好的DH5α感受态EP管(200μl)，置于冰盒中。

(2)加6μl连接产物于感受态DH5α中。

(3)42℃热激90s，立即置于冰盒中2min。

(4)加入900μl LB培养基(不加氨苄)于感受态EP管中。

(5)37℃，150rpm摇床摇1h，观察浑浊度。

(6)吸出100μl培养物涂于含X-gal和IPTG的氨苄青霉素LB选择培养基。

(7)于37培养箱中培养14h。

观察菌落(E.coli DH5α)的长势，挑选白色菌落(E.coli DH5α)(5个)，摇菌保种(37℃，150rpm培养16h)，并做菌液PCR检测，菌液PCR扩增反应(体积为10μl)，组成如下：

菌液(E.coli DH5α)       1.0μl

10×PCR buffer(pH8.3)    1.0μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μm dNTP               0.8μl

一单位Taq酶              0.5μl

5pM的M13引物F(通用)      0.25μl

5pM的M13引物R(通用)      0.25μl

去离子无菌水(ddH₂O)      5.6μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：95℃5min

35cycle：95℃1min；55℃1min；72℃1min

1cycle：72℃5min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物在浓度为1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)中电泳，在凝胶成像仪中观察并照相保存，观察阳性克隆的比例。例如图3中鉴定的5个克隆均为阳性。

5、测序、引物设计与引物合成：

(1)菌种送至联合基因公司进行DNA测序。

(2)利用Generunner软件对测序结果进行序列分析并设计成SCAR引物，命名为SC10.2(SC代表SCAR标记，10代表在10号染色体，2代表该染色体上的第2个分子标记)，由上海英骏公司合成。

(3)在GRAMENE网站上进行Sequences-BLAST，筛选出25对均匀分布于水稻12条染色体、特异性好的SCAR分子标记，根据其在染色体上的分布命名(图4)；SCAR分子标记的设计原则是根据原来RAPD引物再向内延伸8到12个碱基，根据筛选引物的多态性及其在条染色体上平均，选择其中25对特异性好的SCAR分子标记，平均分布于12条染色体上，具体序列等参数见下表。

  序列  号  SCAR标  记编号  引物序列  退火  温度  扩增片断  大小  染色体定位  1  SC1.1  F：CCTGTTCCCGCGCACGC  R：CCTGTTCCCGCAACAATCC  60℃  776bp  1号染色体  2  SC1.2  F：CCGAGCCGTCAATCACTCAC  R：ACACCGATGGAACAGGGTTG  63℃  594bp  1号染色体  3  SC1.3  F：AATTAAGCCTCGTTGTCG  R：TTTCACCCATCTCACACG  53℃  817bp  1号染色体  4  SC2.1  F：TTGCTCACGGGCAGAGAGA  R：TTGCTCACGGCTGACGGGA  61℃  503bp  2号染色体  5  SC2.2  F：GGCGCGTTAGGCTGTCGTGT  R：GGCGCGTTAGACGGGGCG  65℃  1045bp  2号染色体  6  SC3.1  F：TGGTCGGGTGAGAGAAAAG  R：GGTCGGGTGCCAACCTTG  60℃  638bp  3号染色体  7  SC3.2  F：ACTGGGTCGGCAAATCCTG  R：ACTGGGTCGGCTTGGGAAA  60℃  1435bp  3号染色体  8  SC4.1  F：CAGCACTGACAGGACGAG  R：CAGCACTGACTTCAAATGG  58℃  857bp  4号染色体  9  SC4.2  F：CCCCTCACGACGATTCTAG  R：CCCCTCACGATATCGATTAAG  60℃  780bp  4号染色体  10  SC5.1  F：GGACACAGAGGAATGAGGAA  R：GGACACAGAGCTTTCACTTT  59℃  809bp  5号染色体  11  SC5.2  F：TGCCTCGCCAACTATCTTA  58℃  925bp  5号染色体

  R：TGCCTCGCCATTCACCAAG  12  SC6.1  F：CCGTCCCTGATCAAAG  R：CCGTCCCTGACTAAGTAC  53℃  806bp  6号染色体  13  SC6.2  F：CTGTCTGTGGTCGATCGA  R：CTGTCTGTGGGAGTGGAG  57℃  823bp  6号染色体  14  SC7.1  F：ACAACGCCTCATAACAAAG  R：TGCCTAGGAGCCTAGCAG  56℃  906bp  7号染色体  15  SC7.2  F：CTGATCGCGGACTCATAGAT  R：CTGATCGCGGCCCAAGTAC  61℃  632bp  7号染色体  16  SC8.1  F：CCTGGAGCTTAGAGAGAC  R：AGCTTGTCCGAGAATGTC  56℃  568bp  8号染色体  17  SC8.2  F：CTGTCTGTGGTCTCGATAT  R：CTGTCTGTGGGAGTGGAG  57℃  514bp  8号染色体  18  SC9.1  F：GGATCGTCGGCGCAGGGGA  R：GGATCGTCGGGACACGAAGT  65℃  870bp  9号染色体  19  SC9.2  F：TCTGGACGGACGTGTTGAC  R：TCTGGACGGATTCCGGAC  58℃  373bp  9号染色体  20  SC10.1  F：ACGACGAAAATACCACAGC  R：TCCTCGTGGGAACGGTCC  58℃  812bp  10号染色体  21  SC10.2  F：GGACACCACTAATACAGCC  R：GGACACCACTGTAAAAATAGC  60℃  756bp  10号染色体  22  SC11.1  F：ACGCCAGTTCAGCAGGATC  R：CGCCAGTTCCCGTATTCG  60℃  778bp  11号染色体  23  SC11.2  F：GGAGTGGACTAAGAAACAG  R：GGAGTGGACTGCAAAGTAAA  56℃  630bp  11号染色体  24  SC12.1  F：ACCCCCCACTCAGGCACC  R：ACCCCCCACTAACGACCC  60℃  573bp  12号染色体  25  SC12.2  F：AGTCCGCCTGCAGTAAG  R：AGTCCGCCTGGGATAATG  56℃  162bp  12号染色体

6、SCAR标记的PCR验证：

用合成的SCAR引物对原材料的阳性株和阴性株进行PCR验证，PCR扩增反应体系(体积为10μl)，组成如下：

DNA模板                  1.0μl(约50ng)

10×PCR buffer(pH8.3)    1.0μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μm dNTP               0.8μl

一单位Taq酶              0.3μl

5pM的SCAR引物F           0.25μl

5pM的SCAR引物R           0.25μl

去离子无菌水(ddH₂O)    5.8μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：94℃5min

30cycle：94℃1min；50～60℃1min(据具体引物的设计情况而定)；

72℃1.5min

1cycle：72℃10min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物在(Sigma公司PCR专用)1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)中电泳分离，在凝胶成像仪中观察并照相保存，比较退火温度、扩增带的大小是否与理论分析的一致，验证分子标记的准确性。如：用SCAR引物SC10.2对原12个水稻农家种基因组DNA进行扩增，获得了预期结果，只有在IRRI057和IRRI 078两材料中扩增出一条756bp的带，而其他供试水稻材料中没有相应的扩增带(图5)。

7、供试材料DNA的提取：

采用Murray和Thompson的CTAB法(Nucleic Acids Res.1980，8：4321-4325)提取DNA，简要如下：

(1)选择国家和湖北省杂交稻稻区域试验材料76个，分别取0.1g水稻嫩叶，剪碎0.3cm×0.5cm左右小片段装入一1.5ml离心管中，然后加入一颗直径3mm的普通钢珠，在细胞破碎仪(德国RETSCH公司，TissueLyser II型)上将叶片研磨成浆，加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min。

(2)在水浴后的离心管中加入500μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀，台式离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管。

(3)加入600μl冷冻的国产无水乙醇，充分混匀，4℃或冰上放置20min，12000rpm离心15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于30μl TE，-20℃保存；使用时稀释至50ng/μl。

8、SCAR标记对供试材料的PCR扩增检测：

用合成的25对SCAR引物对所有检测材料进行PCR验证，PCR扩增反应体系(体积为10μl)，组成如下：

DNA模板                  1.0μl(50ng)

10×PCR buffer(pH8.3)    1.0μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μmdNTP                0.8μl

一单位Taq酶              0.3μl

5pM的SCAR引物F           0.25μl

5pM的SCAR引物R           0.25μl

去离子无菌水(ddH₂O)      5.8μl

反应物混合后离心，用矿物油(Sigma公司PCR专用)覆盖，PCR扩增在东胜BS096型PCR仪上进行，PCR反应程序如下：

1cycle：94℃5min

30cycle：94℃1min；50～60℃1min(据具体引物的设计情况而定)；

72℃1.5min

1cycle：72℃10min

store：4℃；

电泳检测：扩增后的产物在浓度为1.0％(质量比)琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)中，在凝胶成像仪中观察并照相保存。如SCAR标记SC10.2在湖北国家杂交早稻组合11-01、11-02；国家杂交早稻组合C-1、C-4、C-6、C-8、C-9、C-10、C-12；湖北省杂交中稻组合2106、2110、2205、2208有一条756bp的特异性条带(图6)。

9、样品的相似性检测：

(1)用所有25对SCAR引物扩增、电泳检测，统计分析所有扩增带谱，如果所有分析材料只有一条扩增带，那么有带记为1，无带记为0；如果所有分析材料中有的有一条以上扩增带，那么最大的带记为1，其次记为2，依此类推，而无带的则分别记为0，见下表。

SCAR标记SC1.1-SC12.2扩增片断统计表

(2)根据NTMAS(Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version1.60，F.James Rohlf)中的Jaccard公式计算各材料间的相似系数(GS)，应用平均距离法(UPGMA)进行聚类分析，通过NTSYS程序运算建立聚类图。例如，用这25对引物组合可以把76种杂交组合材料分成76种，可以有效地区分开这76个品种。经聚类分析，结果表明(图7)：杂交组合B6与C6遗传相似性(GS)均在0.96以上，说明其彼此间的遗传关系很近，差异较小，但是彼此间并不完全相同，利用这套分子标记可以将它们完全区分开来。