中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗

摘要

本发明公开了一种中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗，由人巨细胞病毒核苷酸串联序列CTL·Th和腺病毒表达载体pAd5F35组成，其中所述人巨细胞病毒核苷酸串联序列CTL·Th含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列包含人巨细胞病毒15种编码蛋白的83个抗原表位的核苷酸序列，且该序列覆盖14个HLA I等位基因位点和7个HLA II等位基因位点。显示HLA特异的HCMV串联表位核酸疫苗在中国人群的覆盖率平均为92.07％，分别在病毒的黏附、复制、组装及再激活过程防止HCMV疾病的形成。体外实验证明本发明的疫苗具有较强的免疫效果，克服了以往HCMV疫苗单一抗原免疫原性弱、免疫范围局限缺点。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸疫苗及其构建和应用，特别是一种人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗即中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗及其构建和应用。

背景技术

HCMV疾病已成为器官移植和宫内感染常见及重要的并发症，是导致移植失败和胎儿死亡及畸形的重要原因。已有的HCMV疫苗存在免疫原性弱、免疫范围局限、免疫反应小等缺点，不能非常有效地防治HCMV病毒感染，主要是因为：(1)抗原分子中真正能引起免疫应答的部分是与宿主人类白细胞抗原(HLA)分子特异性结合的抗原表位，是诱导机体免疫应答的必需的最基本的结构和功能单位；而HCMV基因组全长235kb，编码165个抗原基因，抗原表位极其复杂，单一抗原分子所含的局限抗原表位引起的机体免疫应答较弱，无法完全预防或消除HCMV感染；(2)不同HCMV抗原表位是通过不同HLA基因位点提呈来激活免疫应答的，然而人群中HLA遗传背景复杂，单一抗原分子难以覆盖HLA位点不同的整个人群。虽有学者考虑使用多抗原疫苗，但载体的有限容量及大分子蛋白可能造成的免疫病理反应亦限制了多个抗原在同一载体中的应用。如何在有限的载体容量下大大增强核酸疫苗的免疫原性，而且同时制备的核酸疫苗免疫应答人群覆盖面广，是当前HCMV核酸疫苗研究的难点。国外对HCMV表位疫苗的研究针对的免疫覆盖人群为欧洲及非洲人群，他们的HLA遗传背景与中国人群HLA分布情况不同，其研制的表位疫苗在中国人群很难被HLA分子提呈，不能引起有效的保护性免疫应答。目前国内尚未见有关HCMV多表位疫苗的报道，且中国人口和民族的空间分布极度不均匀，人群HLA基因频率和单倍型频率的空间分布呈现高度异质性，因而研制针对中国人群HLA分布特点的免疫效果强大的HCMV串联表位疫苗是我国HCMV防治领域的关键所在。

疫苗研究的另一关键因素为疫苗载体的选择，近20年来，只有少数几种病毒如逆转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：①携带外源基因并能包装成病毒颗粒；②介导外源基因的转移和表达；③对人体不致病；④在环境中不会引起增殖和传播。其中复制缺陷型腺病毒表达载体pAd5F35在日本Hiroyuki Mizuguchi教授的研究下发展迅速，已被广泛应用于病毒疫苗、肿瘤疫苗的研究中，pAd5F35被美国FDA批准可以应用到临床研究中。腺病毒Ad5F35介导的基因转移具有以下优点：①可以在人细胞中快速、高水平地表达目的蛋白，因为含目的基因的重组腺病毒DNA是游离于细胞基因组外的，不整合入宿主基因组，所以目的蛋白质得到瞬时的高水平表达，研究表明腺病毒Ad5F35在人的造血祖细胞、树突状细胞、间充质干细胞的转导效率优于Ad5型腺病毒，和Ad35型腺病毒类似，并具有低毒性；②腺病毒Ad5F35经由细胞表面受体CD46转导入细胞，CD46受体在有核细胞上均有表达；③可以将外源基因转到分裂及不分裂的细胞中表达；④可插入高达8kb的外源片段。

发明内容

本发明的目的是提供一种中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗及其构建和应用。

为达到以上目的，本发明根据中国多表位疫苗设计的HLA I积累表型频率空间预测系统(《免疫学杂志》2005年第21卷第2期，P136)，对所选的14个HLA基因位点组合进行预测，显示在中国人群的覆盖率达92.07％。

申请人选择了HCMV的15种抗原蛋白，在这些抗原中选取了83个表位，其中针对上述14个HLA I基因位点的CTL表位76个，针对HLA II基因位点的T辅助细胞(Th)表位7个，通过启动针对上述抗原表位的细胞和体液免疫应答，证实在病毒的黏附、复制、组装、免疫逃逸及再激活等各个过程中，可以防止HCMV疾病的形成。

本发明所述的中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗，由人巨细胞病毒核苷酸串联序列CTL·Th和腺病毒表达载体pAd5F35组成，其特征在于，所述人巨细胞病毒核苷酸串联序列CTL·Th含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列包含人巨细胞病毒15种编码蛋白的83个抗原表位的核苷酸序列，且该序列覆盖14个HLAI等位基因位点和7个HLA II等位基因位点。

其中，上述人巨细胞病毒的15种编码蛋白是指pp28，pp50，pp65，pp150，pp71，gH，gB，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，UL16和UL18；所述14个HLA I等位基因位点是指A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26，B35，B38，B8和B27；所述7个HLAII等位基因位点是指HLA-DR1，3，4，7，11，13和15。

如表1，2所示，其编码的表位序列分别来自人巨细胞病毒的15种抗原蛋白(pp28，pp50，pp65，pp150，pp71，gH，gB，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，UL16和UL18)，分别在病毒的黏附、复制、组装、免疫逃逸及再激活过程中表达；SYFPEITHI软件预测显示，它们能与14个HLA I等位基因位点(A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26，B35，B38，B8和B27)和7个HLA II等位基因位点(HLA-DR1，3，4，7，11，13，15)稳定结合并受其限制，中国人群覆盖率高达92.07％(75.49-99.99％)。应用MAPPP蛋白酶切预测系统对重组蛋白进行预测，结果显示产生的多肽可被水解成预期的表位。

本发明所述中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗的制备方法，其表位预测、基因重组、病毒包装步骤如下：

(1)、利用中国HLA I积累表型频率空间预测系统，对所选HCMV表位结合的14个HLA基因位点(A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26，B35，B38，B8和B27)组合进行预测，显示HLA特异的HCMV串联表位核酸疫苗在中国人群的覆盖率平均为92.07％(图1)。在HCMV的15种抗原蛋白(pp28，pp50，pp65，pp150，pp71，gH，gB，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，UL16和UL18)中选取83个表位，其中针对上述14个HLA I基因位点的CTL表位76个(表1)，针对HLA II基因位点的Th表位7个(表2)，理论上可以在各个阶段控制病毒的复制、防止HCMV疾病的形成。应用DNAMAN软件、Kozak规则及PubMedNucleotide NC_001347.Human herpesvirus 5 strain AD169 HCMV基因组得出了覆盖中国人群HLA特异的HCMV串联表位核苷酸序列，在起端加上了Kozak序列，可以获得多表位核苷酸序列在真核表达载体中的高效表达；末端加上了6个His标签序列，可以通过6×His抗体应用Western blot及细胞免疫化学方法检测HCMV多表位疫苗的表达；两端加入了Nhe I和Not I酶切位点，可以插入穿梭载体pHMCMV5载体的多克隆位点，有利于制备中国人群HLA特异的HCMV串联表位腺病毒载体核酸疫苗。

(2)、采用重叠区扩增基因拼接法(SOEing)和PCR技术成功合成了HCMV多表位疫苗全长基因CTL·Th(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)。利用同源重组技术，将CTL·Th基因插入穿梭载体pHMCMV5的Nhe I/Not I酶切位点，构建穿梭载体pHMCMV5-CTL·Th，应用Nhe I/Not I酶切分析和测序分析鉴定目的载体，证实已成功构建了穿梭载体pHMCMV5-CTL·Th。利用I-CeuI/PI-SceI双酶切和体外重组技术将穿梭载体上包含CMV启动子、目的基因和SV40 polyA尾的表达盒插入腺病毒表达载体pAd5F35，构建重组腺病毒疫苗表达载体Ad5F35-CTL·Th，应用Xho I和I-Ceu I/PI-SceI酶切分析和测序分析鉴定目的载体，证实已成功构建了重组腺病毒疫苗表达载体pAd5F35-CTL·Th。

(3)、应用PacI线性化重组腺病毒表达载体pAd5F35-CTL·Th，用脂质体2000转染HEK293，包装成重组腺病毒Ad5F35-CTL·Th，待培养10±1天出现CPE效应时收取病毒；应用HEK293细胞大量扩增重组腺病毒Ad5F35-CTL·Th，扩增至五代，应用快速腺病毒感染性滴度(TCID50)检测试剂盒测定大量扩增后的的重组腺病毒的滴度，滴度为2.5×10⁹IU/L，证实成功包装出大量的Ad5F35-CTL·Th重组腺病毒疫苗。而且证实在包装细胞中，目的基因CTL·Th在mRNA和蛋白质水平均有表达。

(4)、应用Ad5F35-CTL·Th重组腺病毒转染外周血单个核细胞(PBMCs)，在转染后10天PBMCs仍保持90％以上的活性，说明重组腺病毒Ad5F35-CTL·Th毒性极低；而且HCMV多表位疫苗刺激PBMCs后，可引起HCMV特异性CTL的扩增，从而杀伤特异的靶细胞。

本发明所述中国人群HLA特异的HCMV多表位腺病毒核酸疫苗的免疫效果评价

(a)、利用EBV成功转化了PBMCs，建立了2株类淋巴母细胞系(1ymphoblastoidcell lines，LCL)；

(b)、应用HCMV多表位腺病毒载体疫苗Ad5F35-CTL·Th刺激HCMV健康携带者的PBMCs，体外高效扩增了抗原特异性CTL；

(c)、Ad5F35-CTL·Th编码的HCMV CTL表位可被细胞内源性加工提呈，从而被特异性CTL杀伤；Ad5F35-CTL·Th刺激PBMCs后，可引起HCMV特异性CTL的扩增，从而杀伤特异的靶细胞，而且随效靶比升高，Ad5F35-CTL·Th扩增的CTL细胞杀伤活性增强；

(d)、应用ELISPOT实验检测Ad5F35-CTL·Th刺激HCMV健康携带者的PBMCs和抗原特异性CTL分泌IFN-γ的情况，结果发现Ad5F35-CTL·Th可高效刺激PBMCs分泌IFN-γ，两次刺激扩增生成的CTL，可产生更高的大量分泌IFN-γ。

总之，本发明制备的中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗，包含15种HCMV病毒蛋白的83个抗原表位，覆盖14个HLA I等位基因位点和7个HLA II等位基因位点，中国人群覆盖率高达92.07％(75.49-99.99％)；且具有较强的免疫效果，克服了既往HCMV疫苗单一抗原免疫原性弱、免疫范围局限缺点。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1是本发明在中国人群的覆盖频率预测结果图。结果显示，本发明的HLA组合(A2，A24，A1，A3，A11，A68，B44，B7，A23，A26，B35，B38，B8，B27)在中国人群覆盖率高达92.07％(75.49-99.99％)。

图2是本发明的HCMV多表位疫苗制备流程图。合成的多肽表位核苷酸片段通过酶切插入穿梭载体pHMCMV5，继而插入疫苗载体pAd5F35，转入包装细胞HEK293，产生腺病毒疫苗Ad5F35-CTL·Th。

图3是本发明的HCMV多表位疫苗免疫效果图。来自健康携带者JXX(HLAA2，A11，DR4，DR15)和ZNN(HLA A1，B44，B35，DR7，DR11)的PBMCs和自体的感染了Ad5F35-CTL·Th(MOI 50∶1和25∶1)的PBMCs在效靶比2∶1下共培养7天，然后用Ad5F35-CTL·Th感染的(MOI 50∶1)x-射线照射的自体的LCL细胞再次刺激共培养，于第10天进行体外表位特异性T细胞的杀伤活性试验，用单个肽段(20μg/ml)刺激的LCL为靶细胞，效靶比为10∶1。HCMV多表位疫苗刺激PBMCs后，可引起HCMV特异性CTL的扩增，从而杀伤特异的靶细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗的制备

1.表位的预测及确定

利用中国HLA I积累表型频率空间预测系统(《免疫学杂志》2005年第21卷第2期，P136)，选取14个HLA I基因位点进行组合，如图1所示，本发明的HCMV多表位疫苗中国人群HLA覆盖率高达92.07％(75.49-99.99％)。然后在HCMV的15种抗原蛋白(pp28，pp50，pp65，pp150，pp71，gH，gB，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，UL16，UL18)中选取83个表位，其中针对上述14个HLA I基因位点的CTL表位76个(表1)，针对HLAII基因位点的Th表位7个(表2)，理论上可以在各个阶段控制病毒的复制、防止HCMV疾病的形成；所选取的83个串联表位的SYFPEITHI软件预测分数均在14分以上，多数在20-30分之间，表明均能被HLA分子特异性结合提呈；MAPPP软件预测分数多在0.500以上，证明形成的多肽在细胞内可被降解为相应的表位；疫苗核苷酸序列中引入Kozak规则，加入6个His鉴定标签，然后将得到的疫苗核苷酸序列输入DNAMAN软件，确定了覆盖中国人群HLA特异的HCMV串联表位核苷酸序列两端的酶切位点是Nhe I和Not I酶切位点，可以插入穿梭载体pHMCMV5载体的多克隆位点。

表1  HLA I基因位点限定的HCMV CTL表位和预测

表2  HLA-II类分子限制的Th表位及SYFPEITHI分数

2.多表位疫苗全长基因的合成

根据选择的表位，采用重叠区扩增基因拼接法(SOEing)和PCR技术合成HCMV多表位疫苗全长基因CTL·Th。

(1)、通过软件对基因序列进行分析，将基因分成3段(A、B、C)分别合成，设计合成了112条正反向引物，单数为正向引物，双数为反向引物，另设计一条引物更换酶切位点，测序引物5个。

(2)、然后基因合成PCR扩增，每段基因合成均使用二次扩增。A段基因分成两段合成：A-1(引物A1至A18)，A-2(引物A19至A38)；B段基因分成两段合成：B-1(引物B1至B28)，B-2(引物B29至B56)；C段基因合成(引物C1至C18)。扩增条件以A段基因A-1片段合成为例：

第一次扩增的50ul反应体系中含：模板(A1至A18每个引物各2pmol)，正向引物(A1)及反向引物(A18)各5pmol，PFU酶(2.5U/ul)1ul，10mM dNTP 1ul，10×buffer5ul，用水补足至50ul；反应条件：94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，25个循环。

第二次扩增的50ul反应体系中含：2ul模板(第一次扩增PCR产物)，正向引物(A1)及反向引物(A18)各10pmol，PFU酶(2.5U/ul)1ul，10mM dNTP 1ul，10×buffer 5ul，用水补足至50ul；反应条件：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环。

将第二次扩增的PCR产物电泳切胶纯化，其他片段扩增以此类推，最终得到5条基因片段，编号分别为A-1，A-2，B-1，B-2，C。

(3)、拼接全长基因，以拼接A段基因为例：

50ul的PCR扩增体系中含：30ng模板(基因片段A-1和A-2)，正向引物(A1)及反向引物(A38)，PFU酶(2.5U/ul)1ul，10mM dNTP 1ul，10×buffer 5ul，用水补足至50ul；反应条件：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环。

以此类推，最终通过重叠延伸PCR法将A，B，C三段基因拼接成全长基因，回收纯化末端加A后克隆入T载体中，测序验证(序列如SEQ ID No.1所示)。其中连接体系为：T载体30ng，目的基因60ng，连接酶(5U/ul)0.5ul，Buffer 1.5ul，补足水至15ul，22℃连接1小时，转化即可。

3.腺病毒疫苗载体的制备

如图2所示，以Nhe I/Not I双酶切将合成的CTL·Th片段从T载体克隆入穿梭载体pHMCMV5载体，构建穿梭载体pHMCMV5-CTL·Th，用Nhe I/Not I双酶切和I-CeuI/PI-SceI双酶切鉴定穿梭载体pHMCMV5-CTL·Th；利用I-CeuI/PI-SceI双酶切和体外重组技术将穿梭载体上包含CMV启动子、目的基因和SV40polyA尾的表达盒插入腺病毒表达载体pAd5F35，构建重组腺病毒疫苗表达载体pAd5F35-CTL·Th，应用I-CeuI/PI-SceI双酶切和XhoI酶切鉴定重组腺病毒表达载体pAd5F35-CTL·Th。

4.腺病毒疫苗的病毒包装及大量扩增

应用Pac I线性化重组腺病毒疫苗表达载体pAd5F35-CTL·Th，产生ITR端，利用脂质体2000转染HEK293，包装Ad5F35-CTL·Th重组腺病毒：以合适的细胞密度接种HEK293细胞到60mm培养皿上，转染时细胞达到70-90％的融合；配制溶液1(240ul opti-MEM+10ul脂质体2000，总体积250ul，室温下温育5min)和溶液2(X ul opti-MEM+4ug Pac I酶切产物，总体积250ul)；脂质体2000与Pac I酶切产物DNA之比是2.5∶1，将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入培养皿中，摇动培养皿，轻轻混匀，在37℃5％CO2孵箱中孵育4-6小时；6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃5％CO2孵箱中继续孵育7-14天，观察细胞病变效应(CPE)；当CPE明显时，-80℃/37℃反复冻溶三次，离心收取重组腺病毒。

应用HEK293细胞大量扩增Ad5F35-CTL·Th重组腺病毒疫苗：在75cm²培养瓶中加入10ml 5％DMEM培养5×10⁶293细胞；取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入5％DMEM至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI值约为5；移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃5％CO2孵箱中培养90分钟，再加入9ml 5％DMEM；再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×10⁹～5×10¹⁰个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒；-80℃/37℃反复冻融3次，转入15ml无菌离心管中，1500rpm离心10分钟，收集上清冻存于-80℃；3个175cm²培养瓶中各加入10⁷293细胞进行培养；将3ml细胞裂解液上清加入12ml 5％DMEM中，混匀，移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃5％CO2孵箱中培养90分钟，此时MOI值约为25，加入5％DMEM至30ml；再培养48～72小时，此时10ml培养液病毒量约为3×10¹⁰～3×10¹¹；水平离心机1500rpm离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-80℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。

应用快速腺病毒感染性滴度(TCID50)检测试剂盒测定大量扩增后的重组腺病毒Ad5F35-CTL·Th的滴度是2.5×10⁹IU/L，

5.腺病毒疫苗的鉴定

应用重组腺病毒Ad5F35-CTL·Th转染PBMCs，于转染第5、7天收取细胞进行细胞免疫化学实验，重组腺病毒Ad5F35-CTL·Th在PBMCs的胞膜、胞浆均有表达；同时分别在转染第1、3、5、7、10天应用台盼兰染色观察PBMCs的细胞活性，在转染后10天PBMCs仍保持90％以上的活性，说明重组腺病毒Ad5F35-CTL·Th毒性极低。

6.腺病毒疫苗的功能性验证

(1)、利用EBV成功转化了PBMCs，建立了2株类淋巴母细胞系(lymphoblastoid celllines，LCL)；以HCMV特异肽段诱导的CTL细胞为效应细胞，以Ad5F35-CTL·Th感染16-18小时的HLA匹配的LCL细胞为靶细胞，进行杀伤性实验，结果发现Ad5F35-CTL·Th编码的HCMV CTL表位可被LCL细胞内源性加工提呈，从而被HCMV特异性CTL杀伤。

(2)、将效应细胞(Ad5F35-CTL·Th刺激PBMCs，形成HCMV特异性CTL细胞)与靶细胞(包被HCMV特异肽段的自体LCL细胞)混合作用，可发现Ad5F35-CTL·Th刺激PBMCs后，可引起HCMV特异性CTL的扩增，从而杀伤特异的靶细胞，而且随效靶比升高，Ad5F35-CTL·Th扩增的CTL细胞杀伤活性增强；

(4)、应用ELISPOT实验检测Ad5F35-CTL·Th刺激HCMV健康携带者的PBMCs和抗原特异性CTL分泌IFN-γ的情况，结果发现Ad5F35-CTL·Th可高效刺激PBMCs分泌IFN-γ，两次刺激扩增生成的CTL，可产生更高的大量分泌IFN-γ。

序列表

<110>山东大学齐鲁医院

<120>中国人群HLA特异人巨细胞病毒多表位腺病毒核酸疫苗

<141>2009-6-11

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2475

<212>DNA

<213>Human cytomegalovirus

<400>1

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