在氨基脲敏感性胺氧化酶存在下测定有机亚甲胺稳定性的方法

摘要

本发明提供在氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)或含有SSAO活性的生物样品存在下，测定亚甲胺、亚甲胺类化合物或含亚甲胺部分的化合物的稳定性的方法。所公开的方法可被设计成用于高通量筛选应用的测定形式。

说明书

本发明提供在氨基脲(semicarbazide)敏感性胺氧化酶(SSAO)或含有 SSAO活性的生物样品的存在下，测定亚甲胺(methyleneamine)、亚甲胺类 化合物或含有亚甲胺部分的化合物的稳定性的方法。所公开的方法可以设 计为用于高通量筛选应用的测定形式。

发明背景

氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)广泛地分布于组织中，尤其是血管中， 说明这种酶对令循环亚甲胺失活起作用(Lyles，Prog.Brain Res.， 106：293-303，1995)。许多研究人员将他们的精力集中在寻找SSAO的内源 性配体和寻找这种酶的抑制剂上(Precious等人，Biochem.Pharmacol.， 37：707-713，1988；Crosbie和Callingham，J.Neural Transm.Suppl.， 41：427-432，1994；Elliot等人，Biochem.Pharmacol.38：1507-1515，1989； Boomsma等人，Comp.Biochem.Physiol.C Toxicol.Pharmacol.，126：69-78， 2000；Yraola等人，J.Med.Chem.49：6197-6208；WO 02/066669)。另一些 人则研究了SSAO的其他生理学作用。例如，SSAO，又称为血管黏着蛋 白-1(VAP-1)，已显示在炎症条件下上调，并介导淋巴细胞的结合(WO 98/53049)。本发明利用SSAO的酶活性来测量测试物质(test agent)在细胞 和生物样品中的代谢稳定性。

测试物质的代谢稳定性已经成为药物开发中的关键因素，因此，本发 明解决了鉴定由SSAO代谢的可能测试物质的问题。化学、分子生物学以 及高通量技术的进步，为药物开发程序提供了针对大量目标筛选数目庞大 的化合物以鉴定前导化合物的能力。然后，这些前导化合物经过更多选择 标准的检验，以鉴定出那些具有最佳“类药”(drug-like)性质(即充分 的物理化学稳定性、溶解性、安全性、功效、体内分布)的化合物。对于 在开发的早期阶段鉴定和排除那些不大可能具有“类药”性质的化合物(或 化合物种类)进行了显著的努力。药物在临床试验过程中失败的三个主要 原因是缺乏功效、不可接受的副作用和不利的ADME(吸收、分布、代谢、 排泄)性质。因此，一种化合物的最终成功不仅取决于其生物活性和效能， 还取决于其ADME性质/毒性性质。因此，前导物(lead)优化程序包括选择 具有期望ADME性质/毒性性质的药物的筛选，以提高新的前导化合物在 临床上获得成功的可能性。药物分子的代谢转化代表了药物得以从体内清 除的关键过程。鉴于SSAO在许多器官(bodily compartment)内的广泛分 布，我们相信SSAO可能是一种重要的影响药物潜在的代谢倾向的酶。因 此，本发明使用测定与SSAO接触(expose)的测试物质代谢稳定性的方法。 由涉及生物转化的酶尤其是SSAO来测定药物或其他测试物质的代谢的方 法对药物开发具有重要的含意。

在体外研究中，化合物A(美国专利第6,977,263B号)与包括人的不 同物种的血浆一起孵育。据观察，与绵羊、豚鼠、大鼠及小鼠相比，化合 物A在人的血浆中更为稳定，可达一小时。此外，在人的血浆内，无论是 否有氨基脲存在，在多达4小时内均未观察到化合物有显著的代谢或降解。 然而，首次人体临床研究(first in man)的药物动力学数据显示，同样的 化合物代谢迅速，而且其程度远高于用来自人和其他物种的血浆进行的体 外试验所显示的。随后的研究证实，膜结合的SSAO对该化合物在人体内 的代谢起主要作用。这些数据说明，在生理条件下，在人血浆中发现的可 溶性SSAO与膜结合的SSAO相比，不具有同样水平的酶活性和/或底物特异 性。因此，如化合物A所显示的，测定人的血浆稳定性并不能预测人体内 SSAO的稳定性，因此在选择药剂作为临床备选药物的过程中作用有限。

附图的简要说明

图1显示了人SSAO的氨基酸序列(Genbank登录号Q16853；SEQ ID NO：1)。

图2显示了人SSAO的核苷酸序列(Genbank登录号NM_00374；SEQ ID NO：2)。

图3显示了化合物A的化学结构。

发明详述

本文引用的所有出版物均作为参考引入本文。除非另行定义，本文使 用的所有技术术语和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员 所通常理解的意义相同。

本说明书和随附的权利要求书中所使用的术语目的仅在于说明特定的 实施方案，其在说明书中的用途并非意在限制本发明的范围。除非上下文 另有明确说明，一个词语的单数形式意在包括其复数形式。例如，单数形 式的“一个/种”、“一个/种”和“该”意在也包括其复数形式。而且，提 到一种物质时也可能包括两种或多种物质的混合物。因此，术语“一种物 质”涵盖多种物质，包括其混合物和/或对映异构体。还应注意，除非上下 文另有明确说明，术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用。应进一步 理解，当用于本说明书时，术语“包含”和/或“包含了”规定了所述特征、 步骤、要素和/或组分的存在，但并不排除存在或增加一种或多种其他特征、 步骤、要素、组分和/或其集合。

此外，依照本发明，可能会采用在本领域的技术范围内的常规分子生 物学、微生物学、重组DNA技术和分析技术。这些技术在文献中均有充 分说明。见例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.(本文称为“Sambrook等人，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach，卷I和卷II(D.N.Glover编，1985)； Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Nucleic Acid Hybridization [B.D.Hames和S.J.Higgins编(1985)]；Transcription and Translation [B. D.Hames和S.J.Higgins编，(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney 编(1986)]；Immobilized Cells and Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal， A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编)， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)；A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism，G.Evans(2004)。

本发明的实施方案是由氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)催化的代谢鉴 定测试物质的代谢稳定性的方法，该方法包括：(a)培养表达SSAO的细 胞；(b)将测试物质加入该细胞；(c)将该测试物质与细胞孵育预定的一段 时间；(d)在该预定时间内，测量在含有表达的SSAO的细胞存在下剩余 的测试物质量；以及(e)将该预定时间内测试物质的量与对照中测试物质 的量作比较，以得出一数值；该数值则表明在含有表达的SSAO的细胞存 在下该测试物质的代谢稳定性。

本领域技术人员将会认识到进行此方法时可用细胞裂解物来代替细 胞。因此，本发明的实施方案是由氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)催化的代 谢鉴定测试物质的代谢稳定性的方法，该方法包括：(a)培养表达SSAO 的细胞；(b)裂解细胞以形成细胞裂解物；(c)将测试物质加入该细胞裂解 物；(d)将该测试物质与细胞孵育预定的一段时间；(e)在该预定时间内， 测量在含有表达的SSAO的细胞裂解物存在下剩余的测试物质量；以及(f) 将该预定时间内测试物质的量与对照中测试物质的量作比较，以得出一数 值；该数值则表明在含有表达的SSAO的细胞裂解物存在下该测试物质的 代谢稳定性。另一个实施方案则将步骤(b)和步骤(c)结合为单个步骤。

本发明的另一实施方案是在生物样品中用SSAO催化的代谢来鉴定测 试物质的代谢稳定性的方法，该方法包括：(a)获得含有SSAO的生物样 品；(b)将测试物质加入该生物样品；(c)将该测试物质与生物样品孵育预 定的一段时间；(d)在该预定时间内，测量测试物质的量；以及(e)将该预 定时间内测试物质的量与对照中测试物质的量作比较，以得出一数值；该 数值则表明在含有SSAO的生物样品存在下该测试物质的代谢稳定性。

本发明的实施方案采用原代细胞培养物或市售的细胞系。作为非限制 性实例，所用的细胞可获自美国组织培养公司(American Tissue Culture Company)。在一个实施方案中，使用了CHO细胞。细胞可以是原核细胞 或真核细胞。本发明的范围不受所用细胞类型的限制。

生物样品可包括但不限于组织或体液、组织切片例如活检或尸检样品， 以及出于组织学目的而取得的冷冻切片。这些样品包括血液、唾液、组织、 培养的细胞(例如原代培养物、外植体和转化细胞)、部分器官或整个器 官(例如肝脏、肺脏、回肠、动脉、脐带)、粪便、尿等。生物样品可以 取自真核生物体，包括哺乳动物如灵长类(例如黑猩猩、猕猴或人类)、 奶牛、狗、猫、啮齿动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔子)、或鸟类、爬 行动物，或鱼类。本发明一个实施方案的非限制性实例是研究特定的测试 物质或化合物是否在一种组织(tissue compartment)内比在其他组织内具 有发生代谢的较高风险，或反之，是否具有较高的代谢稳定性，例如化合 物是否在肝脏内比在肺脏内具有较高的代谢稳定性。此外，生物样品可加 工以提供其细胞组分的悬浮液，或用于细胞组分的原代培养。

本发明的实施方案是使用来自人类受试者或非人类受试者的生物样 品，以量化测试物质的代谢稳定性。生物样品可以是来自非人动物或人的 一种或多种器官的器官样品、来自非人动物或人的一种或多种组织的组织 样品，以及来自非人动物或人的一种或多种细胞或来自细胞培养物的细胞 样品。对于动物实验，生物样品可包括例如经过尸检或活检而取得的目标 器官组织，也可以是体液如血液。对于临床使用，样品可包括体液，如血 液、血清、血浆、尿、滑液、脊髓液、脑脊液、精液或淋巴液，以及取自 活检的身体组织。参照物或对照物为本领域技术人员已知。参照物或对照 物可包括但不限于来自无恙受试者的生物样品，该受试者为非人动物或人。 此外，参照物或对照物可以是来自未经治疗的受试者的生物样品。可选地， 参照物或对照物可取自治疗前、治疗中及治疗后的同一受试者。参照物或 对照物可取自同一受试者，但是是与鉴定测试物质代谢稳定性所用的细胞 源、组织源或器官源不同的细胞、组织或器官样品。参照物或对照物不一 定非得是生物样品，而可以是一种具有已知程度(amount)SSAO活性的样 品。参照物或对照物可以是一种不被SSAO代谢的物质，或能被SSAO代 谢且易被SSAO代谢的程度已知的物质。

本发明提供了鉴定测试物质的代谢稳定性和易代谢性的方法。本文所 用的术语“测试物质”是指任何能受SSAO酶活性影响或影响SSAO酶活 性的分子，例如蛋白质、非蛋白质有机化合物或药物。对于可被测定的测 试物质并无特别限制。在本发明的实施方案中，测试物质是化合物。测试 物质的实例包括单一物质或低、中或高分子量的化学分子库。物质可采取 测试物质库的形式，例如可充分提供各种各样的物质、或相反地只限于相 似的结构或特征的组合库或随机库。物质可以任选地与一种融合配偶体相 连，所述融合配偶体例如靶向化合物、拯救化合物(rescue compound)、 二聚化化合物、起稳定作用的化合物、可寻址的化合物(addressable compound)以及其他部分。传统上，通过鉴定具有一些期望性质或活性(例 如抑制活性或调节活性)的测试物质(称为“前导化合物”或“先导”)， 可产生具有有用性质的新化学个体。然后，将前导化合物作为支架(scafford) 用于产生该前导化合物的变体，并进一步评价那些变体化合物的性质及活 性。本领域技术人员将会理解，通过鉴定代谢稳定性从而鉴定潜在前导化 合物的易代谢性，并鉴定或选择那些最不易被SSAO代谢的化合物，使用 本发明来优化化合物的选择的应用。

本发明的SSAO是全长SSAO或其保留全部或部分酶活性的片段。部 分酶活性可以是总酶活性的30％或以上，例如40％或50％。非限制性实 例是从非人类物种中分离出来的SSAO。其他物种的非限制性实例包括啮 齿类动物如大鼠、小鼠和豚鼠，或非人类灵长类例如猴子或黑猩猩。另一 非限制性实例是如SEQ ID NO：1所公开的全长人SSAO，或其具有亚甲胺 氧化酶活性的片段。

代谢稳定性或易代谢性是本领域技术人员理解的本领域术语。代谢稳 定性是指测试物质或药物分子在给定条件下进行代谢的敏感性或程度。因 此，代谢程度越高，则代谢稳定性越低。代谢稳定性是决定药物、化合物 或测试物质的口服生物利用率和全身清除率的若干主要决定因素之一。作 为非限制性例子，当药物经口服施用之后，它首先在胃肠道和肠上皮遇到 代谢酶。当它经由肠上皮被吸收进血流之后，通过门静脉被递送到肝脏。 药物在其进入全身循环系统之前可被肠和肝脏的代谢有效地清除，此过程 被称为首过代谢(first pass metabolism)。药物在肝内及肝外组织内的代 谢稳定性或易代谢性将最终决定全身循环系统内的药物浓度，并影响其半 寿期及在体内的停留时间。通常被称为I相代谢(Phase I metabolism)的 生物转化类型包括氧化、还原以及水解，其主要作用是通过将极性官能团 显露(unveil)或引入分子(OH、SH、NH₂或CO₂H)而增加其亲水性并 加强药物的排泄。II相反应(Phase II reaction)或共轭反应通过修饰官能 团以形成O-或N-葡糖苷酸、硫酸酯、α-羧酰胺(carboxyamide)以及谷 胱甘肽(glutathionyl)加合物而进一步提高药物的极性。本发明的实施方 案是药物、化合物或测试物质对SSAO代谢的代谢稳定性或易代谢性。

本发明的实施方案从人类和其他物种选择最相关的生物样品，以检验 对于SSAO代谢的代谢稳定性。例如，以肝为基础的代谢负责大部分药物 的代谢清除，因此，关于首过代谢的考虑可集中于肝脏代谢，有时也可集 中于肠代谢。SSAO在组织和生物体液中的普遍存在以及它在许多组织(如 肺和血管)中特别高的活性，使得必须在使用肝脏之外，还使用适当生物 样品或以其取代肝脏来检验测试物质在SSAO存在下的代谢稳定性。除了 肠和肝脏的首过代谢以外，测试物质与SSAO的接触在除了肠和肝脏组织 以外的部位(例如门静脉、血管和肺脏)也可受首过代谢的限制。测试物 质针对不同形式的SSAO可显示出不同的代谢稳定性。不同的生物样品可 含有不同形式的SSAO。非限制性实例是，测试物质对于人血浆中的可溶 形式SSAO可显示出相应的代谢稳定性，但相对于组织中的膜结合SSAO 可显示出高得多的代谢稳定性。此外，在可比较的测定条件下，动物物种 可显示出比人体内所发现的可溶性SSAO活性高得多或低得多的血浆内可 溶性SSAO活性。

本发明的实施方案使用不同的化学抑制剂以抑制不同形式的胺氧化酶 活性，并将观察到的代谢不稳定性归结为SSAO催化的或单胺氧化酶 (MAO)-A或MAO-B催化的代谢。非限制性实例是添加肼屈嗪作为一种非 针对性(non-discriminating)胺氧化酶抑制剂，添加氯吉灵作为MAO-A 特异性抑制剂，添加帕吉林作为混合的MAO-A和MAO-B抑制剂，以及 添加氨基脲和溴乙基胺作为SSAO特异性抑制剂。

本发明另一非限制性实例是测定测试物质在经过药物或药物组合治疗 的个体中的代谢稳定性，以确定与对照受试者相比，测试物质在这样的个 体中代谢稳定性是否有变化。本领域技术人员将会理解从患有一种或多种 疾病、或经处理诱发一种或多种疾病、或经手术或基因改变、或用某药物、 化合物或测试物质预处理的人类或非人类受试者身上获得生物样品的有用 性。非限制性实例包括利用本发明来测定与未患病的器官相比，可能受疾 病损害的器官内测试物质的代谢稳定性。作为其他非限制性实例，化合物 的代谢稳定性可在获自患哮喘的人类受试者的肺组织内评估，并与来自年 龄一致受试者或对照受试者健康的肺组织内化合物的代谢稳定性作比较。 另一非限制性实例是与“年老”的或“老化”的肝脏相比，研究生物样品 (如“年轻”的肝脏)中化合物的代谢稳定性；其中“年轻”、“年老” 和“老化”均按照所研究的具体物种来定义。

本发明的实施方案使用了同种(homogeneous)细胞群体或一种生物样 品。本发明的另一实施方案使用异质细胞群体或一种以上生物样品的组合。 为了完成本发明的方法，所述细胞或生物样品可以是任何类型或以任何比 例使用。

本发明的实施方案使用表达SSAO的重组细胞。本发明的重组表达载 体包含核酸分子，其以适合于自身在宿主细胞中表达的形式存在。因此， 本发明的重组表达载体可包括一种或多种调控序列，选择该调控序列的基 础是待用于表达的宿主细胞，该调控序列与待表达的核酸有效地连接。在 重组表达载体中，“有效地连接”意在表示目的核苷酸序列是以能使其表 达(例如，在体外转录/翻译系统内表达或当载体被引入宿主细胞时在宿主 细胞内表达)的方式与一个或多个调控序列连接。术语“调控序列”意在 包括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这 样的调控序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology第185卷，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中有所描 述。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表 达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员将会理解， 表达载体的设计可取决于这样的因素：如对待转化的宿主细胞的选择、期 望的蛋白质表达水平等。本发明的表达载体可被导入宿主细胞，以产生如 本文所述的核酸编码的蛋白质或肽。

本文所用的术语“超量表达”指在通常表达多肽的细胞中，多肽表达 的水平超过了其正常的表达水平，或在通常不表达该多肽的细胞中表达。 例如，与通常表达该多肽的野生型细胞中该多肽的表达相比，该多肽的表 达可能增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 100％或更多。该多肽的突变体、变体或类似物也可能超量表达。

本文所用的术语“瞬时”表达是指与细胞染色体分离的一个或多个外 源性核酸分子的表达。瞬时表达一般在引入外源性核酸之后2-3天内达到 最高，然后会降低。

本文所用的术语“稳定”表达是指已成为细胞染色体的一个整合部分 的一个或多个外源性核酸分子的表达。一般而言，稳定表达基因的载体包 括一种或多种选择标记。

转化细胞、非转化细胞、原代培养物以及生物样品的细胞培养技术是 本领域内众所周知的。生物标本或培养细胞可储存起来直至需要使用时。 培养基可特别设计或经商业渠道购买。

本发明的实施方案涉及裂解细胞。可通过加入含有去污剂的裂解缓冲 液来裂解细胞。但是，本发明并不限于在裂解缓冲液中使用去污剂的方法， 而可包括适合于裂解细胞的任何方法。例如，可通过接触高渗缓冲液、超 声处理或冻融来裂解细胞。裂解细胞的这些方法及其他方法是本领域技术 人员众所周知的。

本发明的实施方案使用对照。对照这一术语是本领域技术人员充分理 解的。恰当的对照可能取决于所用的测定参数或所研究的实验问题。对照 可以是一组特定的测定条件或在测定中添加或除去特定的化合物。因此， 对照的非限制性实例是指这样一种情况，其中测试物质是在表达SSAO的 细胞或细胞裂解物不存在的条件下孵育。若该试验条件或所添加的对照化 合物导致了预期的反应，则该对照可被认为是阳性对照。例如，如果预期 所研究的物质能被代谢，则阳性对照将是能被SSAO代谢的化合物。此外， 阳性对照可以是被SSAO代谢为已知的代谢副产物的化合物。阳性对照的 非限制性例子是添加苄胺。对照也可以是阴性对照。阴性对照可以是一组 特定的测定条件或在测定中添加或除去特定化合物，而不会导致预期反应。 例如，如果预期所研究的物质能被代谢，则阴性对照为预期不会被代谢。 阴性对照的非限制性实例是添加不含亚甲胺基且不被SSAO代谢的苯甲酸 (benzyoic acid)。一组特定的测定条件作为阴性对照的非限制性实例可以是 添加靶向SSAO酶活性的抑制剂如肼屈嗪，其中SSAO活性被抑制。对照 可以是“媒介物”(vehicle)对照。例如，如果测试物质能溶于DMSO， 则媒介物对照是不含测试物质的DMSO。对照可以是仅仅使用历史资料。

本发明的实施方案是在预定时间内，测量在SSAO存在下孵育的测试 物质的量，并将该预定时间内测试物质的量与对照中测试物质的量作比较， 以测定在SSAO存在下该测试物质的代谢稳定性。对本领域技术人员很明 显的是，测试物质的代谢稳定性可通过该测试物质的消失来测定，或者可 选地，通过该测试物质的一种或多种代谢产物的出现来测定。本发明的其 他实施方案是除了测定该测试物质的量以外，还测定该测试物质的一种或 多种代谢产物的出现，或以测定该测试物质的一种或多种代谢产物的出现 取代对该测试物质的量的测定。

测试物质的量或该测试物质的一种或多种代谢产物的出现，可通过本 领域技术人员可得的任何技术来测定。非限制性实例包括质谱分析法、高 压液相层析法(HPLC)、液相层析/质谱分析法、液相层析/质谱分析法/质谱 分析法以及液相层析/放射性检测(radiomatic detection)。此外，测试物 质的量或该测试物质的一种或多种代谢产物的出现，可通过使用指示分子 如放射性同位素、荧光染料或抗体来测定。本发明并不受该测试物质或该 测试物质的任何一种或多种代谢产物的测量方法的限制。

该测试物质可用放射性同位素加以标记，例如但不限于³H或¹⁴C。因 此，本发明的实施方案是由氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)催化的代谢鉴定 放射性标记的测试物质的代谢稳定性的方法，该方法包括：(a)培养表达 SSAO的细胞；(b)将放射性标记的测试物质加入该细胞；(c)将该放射性 标记测试物质与细胞孵育预定的一段时间；及(d)测量在该预定时间内， 在含有表达的SSAO的细胞存在下剩余的放射性标记的测试物质的量；其 中尚未代谢的放射性标记的测试物质的百分比则表明在含有表达的SSAO 的细胞存在下该放射性标记的测试物质的代谢稳定性。本领域技术人员将 会认识到实施此方法时可使用细胞裂解物来代替细胞。此外，本发明不限 于放射性同位素的使用，而可以使用本领域内可用的标记测试物质的任何 方法。

本发明的另一实施方案是用SSAO在生物样品中催化的代谢鉴定放射 性标记的测试物质的代谢稳定性的方法，该方法包括：(a)获取含有SSAO 的生物样品；(b)将放射性标记的测试物质加入该生物样品；(c)将放射性 标记的测试物质与生物样品孵育预定的一段时间；及(d)测量在该预定时 间内放射性标记的测试物质的量，其中尚未代谢的放射性标记的测试物质 的百分比则表明在含有SSAO的生物样品存在下该测试物质的代谢稳定 性。

本领域技术人员能够理解将细胞或细胞裂解物中测试物质的代谢稳定 性与生物样品中测试物质的代谢稳定性作比较的有用性。因此，本发明的 实施方案包括测定测试物质代谢稳定性状况(profile)的方法，该方法包 括：(a)获得在含有表达的SSAO的细胞或细胞裂解物存在下孵育的测试 物质的代谢稳定性数值；以及(b)获得在含有表达的SSAO的生物样品存 在下孵育的测试物质的代谢稳定性数值，其中，将在含有表达的SSAO的 细胞或细胞裂解物存在下测试物质的代谢稳定性数值与在含有SSAO的生 物样品存在下测试物质的代谢稳定性数值作比较，即得出该测试物质的代 谢稳定性状况。

某些改进，例如与高通量筛选(HTS)方法一起使用本发明，完全属于 本领域技术人员的知识与能力范围之内，并被认为属于本发明的实施方案。 本发明的实施方案是在高通量筛选(HTS)方法中的用途。HTS是在设计用 于模拟疾病病理学的生物学机制或某些方面的测定中，对成千上万种不同 化合物进行自动化同时检测。可以同时检测一种以上化合物，例如数种化 合物。在一个实施方案中，术语HTS筛选是指这样的测定法，它们测试多 种生物样品中一种化合物的代谢稳定性，或测试一种或多种生物样品中多 种化合物的代谢稳定性。

本发明的实施方案包括一组容器，它们能容纳细胞、细胞裂解物、身 体样品或其他物质例如所研究的亚甲胺或亚甲胺类测试物质。所谓一组容 器可以是至少一个或一个以上任何数量的容器，它们适合于盛放本发明范 围内的物质。其实例包括但不限于瓶(flask)、培养皿、载玻片、管(tube)， 例如1.5mL管、12孔板、96孔板、384孔板，以及可能具有4000孔的微 型微量滴定板(美国专利申请号20050255580)。这些容器可以是能够添 加防护罩的，以防污染物的进入或内容物的蒸发。

所述容器另外的特点是其为可以进行分析的容器。非限制性实例包括 用质谱分析法或HPLC进行分析。但是，鉴于可将样品转移至适合于进一 步分析的容器，对本发明范围内可用的容器并无限制。非限制性实例是修 改方法使得该方法还包括提供第二组容器，其中一个或多个步骤就在第二 组容器中进行。

液体处理系统、分析设备，例如荧光读取器或闪烁计数器以及用于细 胞培养与样品操作的机器人技术，是本领域内众所周知的。机械系统例如 机器臂或“随机取样”(cherry-picking)装置为本领域技术人员可得。有 市售的平板读取器可用于分析常规的96孔或384孔板。可以用单样品、多 样品或平板样品读取器来分析预定的孔，并产生原始数据报告。原始数据 可以转换并以多种方式呈现。

本发明的另一实施方案为试剂盒，其包括实现本文所公开方法的测定 系统的至少一个要素及使用说明书。因此，该测定系统的组成部分可在这 样的试剂盒中单独提供或同时提供。该测定系统的组成部分可按照能最大 化单一组分稳定性的方法制备并包括在试剂盒中。这样的方法是本领域内 技术人员熟悉的。例如，测定系统的细胞可以悬浮液的形式提供，或者细 胞可以被冷冻或冻干。也可以包括该测定系统的其他组成部分，例如缓冲 液、用于混合测定组分的容器(例如微孔滴定板或试管)。该测定系统可 以以试剂盒的形式提供，该试剂盒包括对进行测定的说明书以及对数据处 理与解读的说明书。

以下实施例进一步说明了本发明。这些实施例不限制权利要求书中所 述的发明范围。尽管就生产及使用，本发明对于本领域技术人员已经做了 足够详细的描述及举例说明，但不背离本发明的精神及范围的不同的可选 方案、修改及改进是显而易见的。本领域专业人员很容易理解，本发明很 适合于达到目的并取得所述及的结果及优点，以及本发明固有的结果及优 点。以下实施例是对于实施方案的描述，并非意图限制本发明的范围。本 领域技术人员会想到其中的修改和其他用途。这些修改均涵盖在本发明的 精神之内，并由权利要求书的范围限定。

本文举例说明的本发明可在缺少任一个或多个要素及无任一个或多个 限制的情况下实施，本文并未特别公开这些要素及限制。所采用的术语及 表述是用作说明而非限制，且使用这些术语及表述并不意在排除任何与所 显示和所描述的特征或其部分等同的术语及表述；但应认识到，在本发明 要求保护的范围内，不同的修改是可能的。因此，应该理解，尽管通过实 施方案和任选的特征已经明确地公开了本发明，但是本领域技术人员可对 本文公开的概念做出修改或变动，而这些修改或变动均被认为属于随附的 权利要求书所限定的发明范围之内。

实施例1

A.人的SSAO的克隆和表达

1)为了促进表达构建体的产生，按如下步骤产生起始的pDONR221 全长SSAO质粒：

使用如下所示的基因特异性引物进行了第一次PCR。正向引物具有一 半att位点(Invitrogen)及Kozak序列，以黑体显示。反向引物具有以黑体 显示的其余一半att位点。以人的脐带作为DNA模板(从购自Biochain的 RNA和Invitrogen的RT-PCR superscriptII试剂盒制备)进行PCR。

起始克隆引物：

正向(SEQ ID NO：3)：

5’-ATGAACCAGAAGACAATCCTC-3’

反向(SEQ ID NO：4)：

5’-CTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3’

然后使用如下所示的通用引物进行第二次PCR。正向引物和反向引物 包括att位点序列(以黑体显示)和载体序列。

通用引物序列：

正向(SEQ ID NO：5)：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAA-3’

反向(SEQ ID NO：6)：

5’-GGGGACCACTTTGTA-3’

利用Invitrogen的BP反应，将这第二次PCR产物克隆进pDONR221。 利用此进入载体(entry vector)作为模板，制备了人的SSAO表达载体的 6种变体；3种无标记形式(一种全长和两种截短的)以及3种带羧基端 6xHIS标记的形式，以促进酶的纯化。

2)全长SSAO

正向引物和反向引物中以黑体显示的序列表示att位点序列。

用于克隆无标记、全长SSAO的引物序列：

正向(SEQ ID NO：7)：

5’-ATGAACCAGAAGACAATCCTC-3’

反向(SEQ ID NO：8)：

5’-CTAGTTGTGAGAGAAGCCCCCGTGG-3’

为了在终止密码子前添加3’6xHIS，使用了下列引物：

正向引物和反向引中上以黑体显示的序列表示att位点序列，反向引物 上带下划线的序列表示6xHIS标记。

用于克隆带C端6xHIS标记的全长SSAO的引物序列：

正向(SEQ ID NO：9)：

5’-ATGAACCAGAAGACAATCCTC-3’

反向(SEQ ID NO：10)：

5’-

CTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAAGCCCCC

GTGG-3’

3)代表缺乏膜锚定区域的酶的T₁(Gly27-Asn763)：

正向引物和反向引中上以黑体显示的序列表示att位点序列，正向引物 上带下划线的序列表示另外的N端Met。

用于克隆N端截短、无标记SSAO的引物序列：

正向(SEQ ID NO：11)：

5’-ATGGGCAGGGGTGGAGATGGGGGTG-3’

反向(SEQ ID NO：12)：

5’-CTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3’

为了在终止密码子前添加3’6xHIS，使用了下列引物：

正向引物和反向引中上以黑体显示的序列表示att位点序列，正向引物 上带下划线的序列表示另外的N端Met，反向引物上带下划线的序列表示 6xHIS标记。

用于克隆N端截短、C端6xHIS标记SSAO的引物序列：

正向(SEQ ID NO：13)：

5’-ATGGGCAGGGGTGGAGATGGGGGTG-3’

反向(SEQ ID NO：14)：

5’-

CTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAAGCCCCC

GTGG-3’

4)代表假定催化结构域的T₂(Met211-Asn763)。

正向引物和反向引中上以黑体显示的序列表示att位点序列，正向引物 上带下划线的序列表示另外的N端Met。

用于克隆无标记SSAO催化结构域的引物序列

正向(SEQ ID NO：15)：

5’-ATGACCACGGCTCCCCGTGGTC-3’

反向(SEQ ID NO：16)：

5’-CTAGTTGTGAGAGAAGCCCC-3’

为了在终止密码子前添加3’6xHIS，使用了下列引物：

正向引物和反向引中上以黑体显示的序列表示att位点序列，正向引物 上带下划线的序列表示另外的N端Met，反向引物上带下划线的序列表示 6xHIS标记。

用于克隆带C端6xHIS标记的SSAO催化结构域的引物序列：

正向(SEQ ID NO：17)：

5’-ATGACCACGGCTCCCCGTGGTC-3’

反向(SEQ ID NO：18)：

5’-

CTAATGGTGATGGTGATGGTGGTTGTGAGAGAAGCCCCC

GTGG-3’

通过将这些PCR产物克隆进pCDNA5-FRT-To-DEST载体(Invitrogen， Gateway System^TM)制备了表达载体。各构建体的正向和反向DNA序列均 被确认，其包括表达序列和表达序列每侧至少100对碱基对。按照制造商 的说明使用这6个构建体，生成了Flp-In CHO、Flp-In CHO T-Rex以及 Flp-In HEK 293(Invitrogen，Flp-In system^TM)的稳定细胞系。按照制造商的 说明使用Lipfectamine(Invitrogen)，用调控载体pOG44以及各 pCDNA5-FRT-To-DEST构建体共转染细胞。这样，就产生了18种细胞系： CHO Flp-In全长SSAO；带C端6xHIS标记的CHO Flp-In全长SSAO； CHO Flp-In T₁SSAO；带C端6xHIS标记的CHO Flp-In T₁SSAO；CHO Flp-In T₂SSAO；带C端6xHIS标记的CHO Flp-In T₂SSAO；CHO T-Rex Flp-In全长SSAO；带C端6xHIS标记的CHO T-Rex Flp-In全长SSAO； CHO T-Rex Flp-In T₁SSAO；带C端6xHIS标记的CHO T-Rex Flp-In T₁SSAO；CHO T-Rex Flp-In T₂SSAO；带C端6xHIS标记的CHO Flp-In T₂SSAO；HEK 293Flp-In全长SSAO；带C端6xHIS标记的HEK 293 Flp-In全长SSAO；HEK 293Flp-In T₁SSAO；带C端6xHIS标记的HEK 293Flp-In T₁SSAO；HEK 293Flp-In T₂SSAO；带C端6xHIS标记的HEK 293Flp-In T₂SSAO。

贴壁CHO细胞是于37℃下在5％CO₂条件中在含有Ham’s F12、10％ 胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、300μM潮霉素B的培 养基中培养的。贴壁HEK 293细胞是于37℃下在5％CO₂条件中在DMEM (高葡萄糖)、10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺以及200μM潮霉素B 中培养。稳定的转化体是通过失去zeocin抗性来鉴定的。一旦细胞达80％ 融合，即通过添加四环素至1μg/mL诱导SSAO表达。18小时后，室温下 通过用胰蛋白酶处理3分钟收获细胞。将细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤3次， 再在液氮中快速冻结。

为了制备用于活性测试的细胞裂解物，将冷冻的细胞团块重悬于含10 mM Tris-HCl(pH 7.2)、150mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1％v/v NP-40的 裂解缓冲液中，在冰上孵育15分钟。裂解物通过在4℃下以800×g离心 10分钟进行澄清，分成小份于-80℃储存直至使用。按照制造厂说明，用 Pierce考马斯蛋白质试剂测定蛋白质。

B.测试重组蛋白的酶活性

(i)样品制备

每次测定，将1mL细胞裂解物(1.5mg/mL蛋白质)与苄胺混合至 最终浓度2000ng/mL。在每个对应的时间点，将20μL孵育混合物转移至 微量离心管(1.7mL)内并与50μL乙腈混合。短暂旋涡微量离心管，以确 保完全混合，然后以10,000×g离心5分钟。取出上清并转移50μL至自 动进样瓶内，与50μL水混合再进行LC/MS/MS分析。用LC/MS/MS法 分析裂解物中剩余的苄胺。

(ii)分析

在如下以及表1和表2所列的条件下，用PE Sciex API 3000质谱仪进 行LC/MS/MS分析。

分析柱：Jupiter C-4，5μM，50×2.1mm

柱温度：室温

流速：0.2mL/分钟

注入体积：15μL

表1：流动相梯度

  时间(分钟)   溶液A(％)   溶液B(％)   0   40   60   0.1   95   5   2.9   95   5   3.0   40   60   6.0   40   60

溶液A是处于含90％甲醇的水，溶液B是10mM乙酸铵缓冲液，pH 7.0。

转向阀：0-1.5分钟至废物，1.5-5分钟至MS检测器

表2：LC/MS/MS

(iii)细胞裂解物LC/MS/MS分析结果如表3所示。

表3：表达全长或截短SSAO的细胞系中的SSAO酶活性

随后测定来自表达全长SSAO(无标记)的CHO Flp-In、CHO Flp-In T-Rex或HEK293Flp-In的活性裂解物，活性得到证实(表4)。由于大 多数活性SSAO细胞系是表达全长(无标记)SSAO的CHO Flp-In，故此 制剂被用于随后的活性测试。

表4：表达全长SSAO的细胞系中的SSAO酶活性

实施例2

优化LC/MS/MS测定条件

Amplex Red测定法(可商购的测定法)最初被用来测量重组的人 SSAO的比活性。Amplex Red是二氢试卤灵(dihydroresorufin)的无色非荧 光衍生物。在胺氧化酶和SSAO存在下，Amplex Red与H₂O₂反应产生强 荧光产物试卤灵。试卤灵在563nm具有最高激发，在587nm具有最高发 射；可在587nm读取微量滴定板量化测定。重组SSAO的比活性测定为 280pmol/分钟/mg蛋白质，确定为等同于人肺组织中发现的SSAO比活性。 在随后以LC/MS/MS测定法研究化合物的测定法中，以此定义的比活性使 用重组的人SSAO(rhSSAO)。

如上所述的LC/MS/MS测定法被用来评估化合物A被rhSSAO代谢 的容易程度。化合物A的化学结构如图3所示(美国第6,977,263B2号专 利一般地涵盖了该分子及其制备方法)。表5中所示的化合物A于37℃与 rhSSAO(如上所述具有定义的比活性，与在人体组织中所发现的一致) 最初一起孵育4小时或24小时。在零时间点和第4小时(或第24小时)， 取出样品的等分试样并用乙腈骤冷。然后用LC/MS/MS分析样品以测出与 零时间点相比，在第24小时剩余的母体化合物的量。

表5中显示的数值是母体化合物与rhSSAO孵育如下所示的不同时间 后剩余的百分比。

表5：与rhSSAO一起孵育后的剩余母体化合物百分比

实施例3

测试人和动物组织匀浆的上清制剂中化合物A的代谢稳定性

(i)所用的组织

使用了下列组织：豚鼠、食蟹猴(Cynomolgus monkey)和人的肺脏、肝 脏、回肠；豚鼠和猴的动脉；以及人的脐带。

(ii)组织制备

处理组织以获得上清。简言之，切取组织后立即用大量生理盐水(预 冷至4℃)冲洗以除去血液。用Polytron将合并后的组织在冷的0.01M磷 酸钠缓冲液中于pH 7.4制成匀浆(10mL/g组织)。加入Triton X-100至 约1％浓度处理匀浆，同时于4℃连续轻摇2小时，然后离心(4℃，15分 钟，3000×g)。小心地将上清分离并等分为每份2mL，于约-80℃冷冻保 存直至使用。

(iii)用试验化合物优化孵育条件

所有孵育过程均在预热水浴中在37℃下进行。分别于1μM或10μM 孵育¹⁴C-放射性标记的试验化合物。对每钟组织/化合物组合均进行初步孵 育，以选择适当的孵育时间。然后，采用的孵育时间为1.5至6小时。采 用了足够的孵育容积以便在孵育期间孵育至少5个系列的样品。从孵育混 合物中取出等份样品(1mL)，立即用双倍体积的乙腈淬灭，并将淬灭的混 合物冻干。将冻干的样品立即重构以进行样品分析，或者于约-80℃储存直 至进行分析。用500μL混合物(90％20mM乙酸铵，pH 4.0和10％甲醇 (v/v))进行重构。离心之后，注入100μL重构样品进行高效液相层析(HPLC) 分离，再进行放射性检测。

(iv)数据分析和计算

孵育后的重构样品先以HPLC分析，再进行放射性检测。通过将保留 时间与母体化合物及它们相应代谢产物的参照标准品进行比较，对试验化 合物及相应的苯甲醛(benzylaldehyde)及苯甲酸代谢产物的鉴定进行证实。 剩余试验化合物的量以母体化合物放射性峰值占重构样品放射性色谱图总 放射性的百分比计算。剩余试验化合物的百分比与孵育时间之间的关系在 对数线性图尺(log-linear scale)上呈一级动力学关系。各孵育的一级速率常 数以剩余试验化合物量的对数相对于以最小二乘线性回归分析为基础的时 间(time based on least square linear regression analysi)的斜率计算。

(v)试验化合物在组织制剂中代谢稳定性的结果

试验化合物的代谢降解的一级速率常数(1/h)列入表6。假设代谢遵循 米曼氏动力学(Michaelis-Menten kinetics)，与一级动力学M的近似意味 着酶反应的K_M＞＞10μm。

表6：组织制剂中化合物A的代谢稳定性

如表6所示，本发明显示了化合物A的组织数据与所观察临床代谢状况 之间优良的相关性。与只使用人的血浆稳定性测量相比，本发明能更好地 反映药剂在生理条件下对于人SSAO的稳定性，且是一种更合适的指导临 床候选药物的选择和医药开发的预测工具。