同时测定蜂王浆中多种四环素类药物残留量的检测方法

摘要

本发明涉及蜂王浆中四环素类药物残留检测的方法，尤其涉及土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4－差向土霉素、4－差向四环素、4－差向金霉素、二甲胺四环素和甲烯土霉素等10种兽药的检测。同时测定蜂王浆中多种四环素类药物残留量的检测方法，采用甲醇沉淀蛋白，然后调节pH值，再经过多级净化，采用液相色谱－质谱/质谱仪测定，可以同时简便的蜂王浆中多种四环素类药物残留。本发明只需要进行一次前处理就可以检测四环素类药物达到10种，土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素和强力霉素五种四环素族抗生素的测定低限均为2.0μg/kg；4－差向土霉素、4－差向四环素、4－差向金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素五种的测定低限均为10.0μg/kg。

说明书

技术领域

本发明涉及蜂王浆中四环素类药物残留检测的方法，尤其涉及土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、二甲胺四环素和甲烯土霉素等10种兽药的检测。

背景技术

四环素类(Tetracyclines，TCs)是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，在化学结构上都属于多环并四苯羧基酰胺母核的衍生物。在畜禽生产中，四环素类药物被广泛作为药物添加剂，用于防治肠道感染、促生长和提高奶牛产奶量。同时也被广泛应用于水产养殖和养蜂中预防和治疗多种感染性疾病。

但是由于四环素类药物主要以原型经肾小球过滤排出，残留药物能沉积于骨及牙组织内，与新形成的骨、牙中所沉积的钙相结合，导致牙齿持久成黄色，俗称“四环素牙”，使出生的幼儿乳牙釉质发育不全并出现黄色沉积，引起畸形或生长抑制。四环素类药物还在肝组织中富集，造成肝损害，还可造成过敏反应、二重感染、致畸胎影响。同时四环素药物残留易诱导耐药菌株。因此四环素类药物造成的食品残留给人们身体健康带来极大的隐患。

目前，四环素类药物残留的测定方法主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、毛细管电泳色谱法、液相色谱法以及液质联用。但国内外对四环素类液质联用检测方法的报道不多，中国发明专利申请(申请号：200810110955.7)公开了一种乳及乳制品中四环素类抗生素残留量的检测方法。农业部1025号公告-12-2008《鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测液相色谱一串联质谱法》公开了鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测方法。GB/T 18932.4-2002《蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法液相色谱法》公开了蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定方法。GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱质谱法与高效液相色谱法》公开了动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法。

涉及到王浆中四环素类药物残留的检测方法就更少，徐锦忠等采用了偏磷酸甲醇溶液(6∶4，v/v)提取，经HLB柱净化的检测方法。中国发明专利申请(申请号：200810195887.9)公开了蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，样品加入提取液三氯乙酸或高氯酸和提取液醋酸盐、磷酸盐或硼酸盐溶液，控制PH值4.5-9.0；离心，滤液入固相萃取柱中萃取，洗脱并吹干萃取柱，用草酸-甲醇溶液洗柱，洗脱液用甲醇水溶液定容，入液相色谱-串联质谱分析测试，所得的色谱峰与各已知药物的标准色谱峰对照，根据保留时间和质谱离子的丰度确定所检出药物的具体名称。该方法只需对品样进行一次前处理，即可同时提取磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、B-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒，三唑醇等11大类60多种兽药的药物残留，分析效率高，检测成本大降低。

发明内容

为了解决现有蜂王浆中多种四环素类药物残留检测的难题，本发明的H的是提供一种利用液相色谱-质谱/质谱法同时、简便的蜂王浆中多种四环素类药物残留的检测方法。

为了实现上述的目的，本发明的同时测定蜂王浆中多种四环素类药物残留量的检测方法，该方法包括以下的步骤：

①提取：称取蜂王浆置于离心管中，加入EDTA-McIlvaine缓冲溶液混匀，再加入甲醇混匀，离心，上层清液转移到容量瓶中；下层沉淀再加入EDTA-McIlvaine缓冲溶液，混匀，离心，再把上层清液转移到另一容量瓶中；用EDTA-McIlvaine缓冲溶液把提取液定容，用氢氧化钠溶液调节pH为5.5～6.5，待净化用；

②HLB固相萃取柱净化：将上述提取液过预先淋洗好的HLB固相萃取柱，再用甲醇溶液淋洗，减压抽干，弃去全部淋出液；用甲醇和乙酸乙酯混合液洗脱，摇匀；

③离子交换柱净化：将上述溶液过预洗好的羧酸型离子交换柱，再用甲醇淋洗，减压抽干，弃去全部淋出液；用草酸-乙腈混合液以洗脱，摇匀，供液相色谱-质谱/质谱仪测定；

④液相色谱-质谱/质谱仪测定：液相色谱流动相体系采用乙腈和草酸体系，流动相梯度洗脱，质谱分别采用四环素类兽药标准溶液以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描。

作为优选，上述的步骤①中甲醇的使用量为定容后体积的8％～10％。

作为优选，上述的步骤①中EDTA-McIlvaine缓冲溶液的制备方法如下：称取60.5g乙二胺四乙酸二钠，加入1625mL McIlvaine缓冲溶液中，使其溶解摇匀；其中，McIlvaine缓冲溶液采用625mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液与1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液混合，用磷酸调节pH＝4.0制得。

作为优选，上述的步骤①中提取液用氢氧化钠溶液调节pH为6.0。

作为优选，上述的步骤②HLB固相萃取柱选用HLB500mg 6mL。

作为优选，上述的步骤②甲醇和乙酸乙酯混合液中甲醇和乙酸乙酯的混合体积比为1∶9。

作为优选，上述的步骤③羧酸型离子交换柱预洗采用J.T.Baker，500mg，3mL，5mL乙酸乙酯预洗。

作为优选，上述的步骤③草酸-乙腈混合液中草酸和乙腈的混合体积比8∶2。

作为优选，上述的步骤④中1)色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C₈  4.6mm×150mm，5μm；2)流动相梯度洗脱条件如下：

  时间Time  乙腈％  0.01mol/L草酸溶液％  0.0  5.0  95.0  5.0  30.0  70.0  10.0  43.0  57.0  12.0  65.0  35.0  17.0  65.0  35.0  18.0  5.0  95.0

3)流速：400μL/min；4)进样量：20μL。

作为优选，上述的四环素类药物分别为土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素中多种。作为最优选，上述的四环素类药物为土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素10种药物。

本发明由于采用了上述的技术方案，采用甲醇沉淀蛋白，然后调节PH值，再经过多级净化，可以同时简便的蜂王浆中多种四环素类药物残留。本发明只需要进行一次前处理就可以检测四环素类药物达到10种，土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素和强力霉素五种四环素族抗生素的测定低限均为2.0μg/kg；4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素五种四环素族抗生素的测定低限均为10.0μg/kg。

附图说明

图1～图10分别为空白蜂王浆添加土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素10种四环素混合标准溶液(10.0μg/kg)的提取离子流图。

图11～图20分别为A-土霉素、B-四环素、C-去甲金霉素、D-金霉素、E-强力霉素、F-差向土霉素、G-差向四环素、H-差向金霉素、I-二甲胺四环素、J-甲烯土霉素的子离子全扫描质谱图。

图21为上柱溶液pH对于回收率影响图。

具体实施方式

一、样品处理方法

1、提取

称取蜂王浆2g(精确至0.01g)置于50mL离心管中，加入5mLEDTA-McIlvaine缓冲溶液(EDTA-McIlvaine缓冲溶液：称取60.5g乙二胺四乙酸二钠，加入1625mL McIlvaine缓冲溶液(将625mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液与1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液混合，用磷酸调节pH＝4.0)中，使其溶解摇匀)，混匀，再加入5ml甲醇混匀，4000r/min离心10mi n，上层清液转移到50mL容量瓶中。下层沉淀加10mL EDTA-McIlvaine缓冲溶液，混匀，4000r/min离心10min，再把上层清液转移到50mL容量瓶中。重复操作一次。用EDTA-McIlvaine缓冲溶液把提取液定容至50mL。用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为6.0，待净化用。

2、净化

2.1HLB固相萃取柱净化

将上述提取液过预先淋洗好的HLB固相萃取柱(500mg，用5mL甲醇和10mL水预洗)，再用5％甲醇溶液5mL淋洗，在真空负压下，减压抽干20min，弃去全部淋出液。用10mL甲醇和乙酸乙酯混合液(1+9，V/V)以1mL/min的流速洗脱，摇匀。

2.2离子交换柱净化

将上述溶液过预洗好的羧酸型离子交换柱(J.T.Baker，500mg，3mL，5mL乙酸乙酯预洗)，再用甲醇5mL淋洗，在真空负压下，减压抽干5min，弃去全部淋出液。用4mL草酸-乙腈混合液(8+2，V/V)以1mL/min的流速洗脱，摇匀，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

二、液相色谱-质谱/质谱仪仪器条件

1)色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C₈  4.6mm×150mm，5μm

2)流动相梯度洗脱条件见表1

表1流动相梯度洗脱条件

  时间Time  乙腈％  0.01mol/L草酸溶液  0.0  5.0  95.0  5.0  30.0  70.0  10.0  43.0  57.0  12.0  65.0  35.0  17.0  65.0  35.0  18.0  5.0  95.0

3)流速：400μL/min；

4)进样量：20μL；

5)离子源：电喷雾离子源；

6)扫描方式：正离子扫描；

7)检测方式：多反应监测；

8)电喷雾电压(IS)：5500V；

9)雾化气压力(GS1)：35psi；

10)气帘气压力(CUR)：25psi；

11)辅助气流速(GS2)：45psi；

12)离子源温度(TEM)：500℃；

13)碰撞气(CAD)：6psi；

14)离子对、去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)及碰撞室出口电压(CXP)见表2。

表2离子对、去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)及碰撞室出口电压(CXP)

三、线性关系和测定低限

本方法对于蜂王浆中土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素和强力霉素五种四环素族抗生素(A组)的测定低限均为2.0μg/kg；4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素五种四环素族抗生素(B组)的测定低限均为10.0μg/kg。实验中四环素类混合标准工作曲线溶液是用空白基质溶液加混合标准溶液制备，A组浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL(相当于样品中添加2.0、4.0、8.0、20.0、40.0μg/kg 5种四环素混合标准溶液)；B组浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ng/mL(相当于样品中添加8.0、20.0、40.0、80.0、200.0μg/kg混合标准溶液)。在本法所确定的实验条件下进样，测定其峰面积，以质量浓度X(μg/kg)为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制10种四环素类混合标准溶液工作曲线。

表3  10种四环素族抗生素的标准曲线方程及相关系数

  化合物名称  曲线方程  相关系数  土霉素  Y＝1.13*10⁵X+1.07*10⁴  0.9999  四环素  Y＝1.02*10⁵X+1.24*10⁴  0.9996  去甲金霉素  Y＝4.86*10⁴X+3.5*10³  0.9996  金霉素  Y＝5.19*10⁴X+1.22*10³  0.9950  强力霉素  Y＝1.05*10⁵X-4.25*10³  1.0000  4-差向土霉素  Y＝3.42*10⁴X-7.44*10⁴  0.9996  4-差向四环素  Y＝4.84*10⁴X-1.69*10⁵  0.9986  4-差向金霉素  Y＝4.09*10⁴X-1.12*10⁵  0.9997  二甲胺四环素  Y＝5.72*10³X-2.25*10⁴  0.9940  甲烯土霉素  Y＝3.09*10⁵X-3.2*10⁵  0.9998

四、回收率及精密度试验

空白样品中分别添加三个不同浓度水平的四环素族混合标准溶液，A组添加浓度为2.0μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg，B组添加浓度为10.0μg/kg、20.0μg/kg和100.0μg/kg，按照操作方法制备样品溶液。回收率范围及精密度见表4、5；10种四环素提取离子流图见图1～图10。

表4蜂王浆样品中添加四环素族抗生素(A组)时的回收率范围和精密度数据

表5蜂王浆样品中添加四环素族抗生素(B组)时的回收率范围和精密度数据

五、实验优化过程

1、提取剂

本发明采用了EDTA-McIlvaine缓冲溶液作为提取剂，最终的回收率高。

2、蛋白质沉淀剂

为了使最终的样液尽可能的含有较少的杂质干扰检测，同时使固相萃取能顺利进行，必须对王浆溶液中的蛋白质进行去除。在实验中我们发现，采用各种不同的沉淀蛋白质的方法所取得的回收率大有不同，可以说如何去除王浆样品中的蛋白质对于王浆中四环素族残留量检测是十分重要的，直接影响到最终的回收率。不同沉淀剂的沉淀效果及使用后的回收率如下表所示(表6)。

表6.各种沉淀剂沉淀效果及回收率比较

沉淀效果不佳，使得固相萃取无法进行。但同时沉淀效果非常好、迅速，则可能使得部分抗生素被沉淀的蛋白质包埋。而使用甲醇所得到回收率较其他方法有很大地提高，因此本发明选用甲醇是一种最理想的沉淀剂。

2、HLB柱的选择

加热的沉淀条件下，本发明试验了过HLB500mg 6mL溶液的pH值对于最终回收率的影响。在过HLB之前，调节过柱溶液pH分别为2、3、4、5、6、7、8和9，其回收率与pH关系如图21所示。

当pH＜6时，随着pH变大，回收率有变大的趋势；而当pH＞6时，随着pH变大，回收率变小。因此在实验中，选择将上柱溶液的pH值用NaOH溶液调节至6.0左右。

4、液相色谱条件的选择

流动相体系采用乙腈和草酸体系，质谱分析尽管对流动相条件的选择要求不高，但因王浆样品含有较多的干扰物质，特别是空白样品中有已明显的干扰峰，因此我们选用梯度洗脱，将待测物尽可能与干扰物分开，提高了检测准确度。

5、质谱测定条件研究

分别采用5种四环素类兽药标准溶液以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离于进行全扫描，在本研究的质谱条件下，各四环素类兽药的子离子全扫描质谱图，见图11～图20。