银屑病基础研究模型的建立方法及气液平面跨膜装置

摘要

银屑病基础研究模型的建立方法及气液平面跨膜装置，利用银屑病链球菌诱导机制及T细胞介导过度增殖的机制，创新性的采用加入银屑病外周血T淋巴细胞及溶血性链球菌抗原的无血清培养基，体外培养银屑病皮损。可维持银屑病皮损特征性组织形态长达一周之久。用于银屑病体外皮损培养的气液平面跨膜装置，包括银屑病基础研究模型的建立方法中所述的含银屑病外周血T细胞和溶血性链球菌抗原的无血清培养基、灭菌擦镜纸制造气液平面，在灭菌擦镜纸上承载组织块以及37℃，CO

说明书

技术领域

本发明属于实验模型的建立领域。

背景技术

随着对银屑病越来越深入而广泛的研究探索，作为实验基础的银屑病体外模型一直是学术界关注的热点。一方面，人们致力于银屑病鼠模型的研究：早在上世纪60年代起人们便已经开始利用紫外线、化学制剂诱发建立小鼠银屑病模型。然而，该模型仅仅模拟了银屑病的某种特定病理，并且存在着维持时间短暂的缺陷。

70年代Krueger等首次成功将人银屑病皮损移植到裸鼠上，但Baker等对移植皮肤进行评估，发现大多数银屑病特征在移植后不能长久维持，同时因鼠机体本身可提供细胞因子，影响实验效果。长久维持，同时因鼠机体本身可提供细胞因子，影响实验效果。

近年来人们致力于研究自发性动物模型，如无毛突变鼠、鳞状皮肤突变鼠，但价格昂贵，存在人工定向性；此外Bonder等利用雌激素期增生的小鼠阴道上皮和Jarrett利用鼠尾鳞片表皮进行药物疗效的研究，但只能模拟银屑病的表皮过度增殖和表皮分化不全，不能全面反应银屑病的病理改变，特别是T细胞相关的异常。

另一方面，随着分子生物学技术的进展，人们试图应用多种细胞体外联合培养的方法构建组织工程模型，但因技术复杂、费用昂贵而适用性不强。

发明内容

基于上述原因，我们致力于完全模拟人体银屑病可能的发病机制，体外培养银屑病皮损，建立一种经济简便实用的银屑病体外仿真模型，用于银屑病的基础、实验室及临床研究。

本发明的技术构思为：利用银屑病链球菌诱导机制及T细胞介导过度增殖的机制，创新性的采用①加入银屑病外周血T淋巴细胞及②溶血性链球菌抗原的无血清培养基，体外培养银屑病皮损。可维持银屑病皮损特征性组织形态长达一周之久。

本发明是通过以下技术手段得以实施的：

一、一种银屑病基础研究模型的建立方法

1.取材：

①皮肤标本：半年内未经治疗寻常性银屑病皮损；

②银屑病外周血：相应银屑病患者外周血2mL，无菌真空抗凝采血管采集，血样和所有皮肤标本的采集均征得患者知情同意并经伦理委员会批准；

③β-溶血性链球菌。

2.材料处理及运输

将大小约1.5cm×1.5cm的未经治疗寻常性银屑病皮损，除去皮脂及部分真皮，放入含10％青霉素、链霉素的William’s培养基200ul的1.5mL离心管，4℃30min内运至实验室；血样37℃30min内运至实验室。

3.T淋巴细胞分离

将相应的银屑病患者外周血2mL，与PBS体积比1∶1混匀，小心加于4mL淋巴细胞分离液上，1500转/分离心20min，取上数第二层环状乳白色淋巴细胞层，PBS洗涤两次，24孔板培养，利用粘附贴壁分离法，去除单核细胞和部分B淋巴细胞，收集悬浮细胞，密度10⁶个/mL于William’s培养基培养。

4.β-溶血性链球菌抗原制备

将β-溶血性链球菌于哥伦比亚血平板中37℃培养24小时。平板菌落计数法计数，密度10⁹个/m，培养液12000转/分离心，菌体沉淀收集后置双蒸水中，冰浴，40W×8分三次超声打散沉淀液细菌，25000转/分离心收集散菌菌体沉淀，称重，-20℃保存备用。

5.简易皮肤组织气液培养模型制备

无菌六孔板，每孔滴入2mL William’s培养基，放置经灭菌处理的直径为2cm圆形擦镜纸于其上。体外银屑病皮损自制简易培养皿如图1。

6.皮块处理

在超净台内将皮损均匀切成3mm×3mm皮块，用含10％双抗的PBS洗涤3次，每次2min，轻放于准备好的培养装置的承载面上，表皮暴露于空气中，真皮处于液相中。加入银屑病外周血T淋巴细胞、β-溶血性链球菌抗原的William’s培养基，于37℃，CO₂饱和度为5％孵育箱中培养，隔日换液。

步骤2中所述的未经治疗寻常性银屑病皮损，是在无菌操作下取得的。

有益效果

使用以上方法制备的模型具备以下特点：

(1)采用无血清培养，不会受到普通动物血清制品中细胞因子及其他化学制剂的干扰，纯化了培养环境；

(2)根据目前对银屑病发病机制的推测，加入银屑病患者自身外周血T淋巴细胞及人类致病性乙型溶血性链球菌抗原，相对模拟银屑病患者身体内环境。与此同时，在该条件下银屑病皮损体外培养的成功，又进一步说明了银屑病外周血淋巴细胞异常增殖及链球菌感染与银屑病发病的直接关系；

(3)培养期长达6天，保证了对皮损模型自身观察周期的要求，同时对未来进行药物筛选及其他测试提供了相对充足的时间。

二、本发明人同时要求保护用于银屑病体外皮损培养的气液平面跨膜装置

一种气液平面跨膜装置，是用于银屑病体外皮损培养的气液平面跨膜装置，包括如一、一种银屑病基础研究模型的建立方法中所述的含银屑病外周血T细胞和溶血性链球菌抗原的无血清培养基、灭菌擦镜纸制造气液平面，在灭菌擦镜纸上承载组织块以及37℃，CO₂饱和度为5％气相。

按照上述的含银屑病外周血T细胞和溶血性链球菌抗原的无血清培养基，先将灭菌擦镜纸浮于培养基液面上，再利用其制造气液平面——在灭菌擦镜纸上承载组织块，组织块真皮处于液相中，表皮暴露于气相中，气相环境为37℃，CO₂饱和度为5％。

有益效果

该装置不仅可以完全模拟人体皮肤生长的气液交界环境，还可达到体外皮肤组织培养的要求，而且该装置制备简单易行，节省开支，具备可重复性，可控制性等优点。

附图说明

本发明共有附图10幅，

图1体外银屑病皮损自制简易培养皿示意图；

在图中：1、37℃，CO₂饱和度为5％气相；2、灭菌擦镜纸制造气液平面，承载组织块；3、含银屑病外周血T细胞和溶血性链球菌抗原的无血清培养基。

图2为体外银屑病皮损培养肉眼观；

图3光镜下体外培养银屑病组织(HE×100)；

图4电镜下体外培养银屑病皮损组织；

图5体外培养银屑病皮损组织免疫组化染色(×200)；

图6SDS-PAGE检测蛋白分子量；

图7Western blotting半定量检测K17；

图8不同组织、不同培养条件下组织匀浆IL-8含量变化曲线示意图；

图9不同组织、不同培养条件下组织匀浆INF-γ含量变化曲线示意图；

图10不同组织、不同培养条件下组织匀浆TNF-α含量变化曲线示意图。

具体实施方式

1.取材：①皮肤标本收集：取半年内未经治疗寻常性银屑病皮损；②银屑病外周血采集：取相应银屑病患者外周血2mL，无菌真空抗凝采血管采集，血样和所有皮肤标本的采集均征得患者知情同意并经伦理委员会批准；③β-溶血性链球菌

2.材料处理及运输：无菌操作下取皮损，大小约1.5cm×1.5cm，除去皮脂及部分真皮，放入含10％青霉素、链霉素的William’s培养基200ul的1.5mL离心管，4℃30min内运至实验室；血样37℃30min内运至实验室。

3.T淋巴细胞分离：取新鲜抗凝血2mL，与PBS1：1混匀，小心加于4mL淋巴细胞分离液上，1500转/分离心20min，取上数第二层环状乳白色淋巴细胞层，PBS洗涤两次，24孔板培养，利用粘附贴壁分离法，去除单核细胞和部分B淋巴细胞，收集悬浮细胞，密度10⁶个/mL于William’s培养基培养。

4.β-溶血性链球菌抗原制备：于Todd-Hewitt培养基中37℃培养过夜。平板菌落计数法计数，密度10⁹个/m，培养液12000转/分离心，菌体沉淀收集后置双蒸水中，冰浴，40W×8分三次超声打散沉淀液细菌，25 000转/分离心收集散菌菌体沉淀，称重，-20℃保存备用。

5.简易皮肤组织气液培养模型制备：无菌六孔板，每孔滴入2mL不同条件培养基，放置经灭菌处理的直径为2cm圆形擦镜纸于其上。

6.皮块处理：在超净台内将皮损均匀切成3mm×3mm皮块，用含10％双抗的PBS洗涤3次，每次2min，轻放于准备好的培养装置的承载面上，表皮暴露于空气中，真皮处于液相中。加入银屑病外周血T淋巴细胞、β-溶血性链球菌抗原的William’s培养基，于37℃，CO₂饱和度为5％孵育箱中培养，隔日换液。分别于第0天、3天、6天取组织进行石蜡切片、HE染色、光镜观察及3％戊二醛、1％锇酸双固定、透射电镜观察。

7.免疫组化检测角蛋白17：随机选取培养前和培养6天后的石蜡包埋组织和正常表皮石蜡包埋组织，再切片并进行(Max Vision^TM快捷免疫组化染色法)免疫组化染色。具体操作如下：石蜡切片脱蜡水化，柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复，加一抗(鼠抗人角蛋白17单克隆抗体)室温孵育60分钟，PBS洗3次，每次3分钟，去除PBS，加Max Vision^TM，室温下孵育15分钟，PBS洗3次，去除PBS，加新制DAB溶液5分钟，自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定参照Garcia等方法^[4]，每张切片随机取10个同样放大倍数的视野计数，半定量分级：①细胞棕黄色着色为1，细胞深褐色着色为2；②阳性着色细胞比例小于20％为1，20％~50％为2，大于50％为3.以上两项相加等于2~3为弱阳性(+)，3~4为阳性(++)，＞4为强阳性(+++)。

8.Western蛋白印迹法检测角蛋白17：II组随机选取培养前和培养6天的皮损，RIPA裂解液均浆提取蛋白，Bradford法蛋白定量，等量加样，1泳道加正常对照，2、3泳道加培养前后样本，另重复一份用于内参定量，同时加蓝色预染低分子量蛋白Marker对K17进行半定量，Tricine-SDS-PAGE电泳分离，半干转膜，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，依次加入鼠抗人K17单克隆抗体4℃过夜，另一组加小鼠抗人β-Actin抗体作为内参，二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体室温培养1~2小时，ECL显色，X线片压片、显影、定影。

9.ELISA检测细胞因子IL-8，TNF α，INFγ含量：将培养前，培养3天，培养6天的银屑病皮损取出，滤纸展干后-20℃保存备用，待标本集齐后，分别在4℃条件下，利用均浆器将组织充分研磨制成匀浆，冷冻离心机10000转/分离心10分钟，取上清，利用进口ELISA试剂盒检测各细胞因子吸光光度值并换算成浓度，制表分析。

检测报告

本检测内容是依据发明内容中所述银屑病基础研究模型的建立方法而制得的模型进行的。

在下述内容中，W代表单纯无血清培养基；W+C代表加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞成分的无血清培养基；W+C+A代表加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基；W、W+C、W+C+A之后的数字代表培养天数。

一.组织形态学观察

1.肉眼观察

根据我们大量前期培养皮肤组织的预经验，体外成活的皮肤组织大致表现为表面湿润有光泽，颜色呈肉色，培养液澄清；而状态不好的皮肤组织外观多皱缩，颜色灰暗或呈现基底层松散，颜色苍白。单纯无血清培养(W)与加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基(W+C+A)培养的银屑病皮损培养相比，外观上，表皮略显灰暗，边缘有皱缩，而后者表皮更红润；培养三天与培养六天的皮损相比，外观上，表皮略显水嫩，有光泽(见图2a、b、c、d、e；图2为体外银屑病皮损培养肉眼观2a：体外组织培养模型；2b：W3天，可见皮损周边皱缩，颜色变暗；2c：W+C+A3天，外观红润；2d：W6天，外观可见表皮皱缩，灰白；2e：W+C+A6天，表皮粗糙，皮纹深，仍保持肉色，水润)。

2.HE染色

单纯无血清培养(W)的组织，随着体外培养时间的延长，病理表形异于银屑病表现，可出现双层角质层，棘层松解，表皮真皮分离，炎性细胞减少。而加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基(W+C+A)培养的银屑病皮损培养3天、6天后，组织形态仍保持寻常型银屑病的组织病理学特征，角质层增厚，角化过度伴角化不全，在疏松的角化不全细胞间，夹杂着空气间隙；在角层内或角层下，有大量中性粒细胞浸润；颗粒层变薄或消失，棘层增厚，表皮嵴延长(见图3a、b、c、d；图3为光镜下体外培养银屑病组织(HE×100)；3a：W3天，角质层角化过度，炎性细胞减少；3b：W+C+A3天角化过度，颗粒层消失，棘层增厚，表皮向下延伸呈顶突状；3c：W6天棘层松解，表皮内有裂隙；3d：W+C+A6天角化过度伴角化不全，角层下可见大量中性粒细胞浸润)。

3.电镜观察

培养前和加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基培养的银屑病皮损培养6天后组织透射电镜下观察两者均呈现银屑病的超微结构特点[12]，表现为表皮基底层变化不大，主要为角质层细胞凋亡，周围大量脂滴；颗粒层细胞线粒体增多；棘细胞层细胞间隙增宽，核糖体尤其多核糖体增多，桥粒减少，张力丝稀薄。培养前后无明显差异(见图4a、b、c、d、e、f；图4为电镜下体外培养银屑病皮损组织4a和4d：培养前皮损和W+C+A6天，均呈现角质细胞层，角质细胞凋亡，周围大量脂滴(×12000)；4b和4e：培养前皮损和W+C+A6天，均呈现颗粒层，线粒体增多(×7500)；4c和4f：培养前皮损和W+C+A6天，均呈现细胞间隙增宽，核糖体尤其多核糖体增多，桥粒减少，张力丝稀薄(×6000))。

二.鉴定银屑病皮损角蛋白17的特异性表达

1.免疫组化检测K17

培养前和加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基(W+A+C)培养的银屑病皮损培养6天组织中K17在表皮，尤其棘层细胞胞浆内均呈强阳性表达，细胞颜色呈棕褐或深褐色(见图5a，b前者为5a，后者为5b)。

正常人表皮培养前未见K17表达而经过加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基(W+A+C)培养六天后可见，表皮组织呈棕色黄染(见图5c，d，前者为5c，后者为5d)。图5为体外培养银屑病皮损组织免疫组化染色(×200)；5a：培养前K17在棘细胞胞浆强阳性表达；5b：W+C+A6天K17在棘细胞胞浆高表达；5c：正常人表皮棘细胞未见K17表达；5d：正常组织W+C+A6天培养后组织黄染；5e：基底细胞癌空白对照；5f：基底细胞癌阳性对照。

参照Garcia等人的判定方法，倒置显微镜镜观察染色后组织阳性细胞比例及颜色，按等级评分，统计不同等级病例数量(见表1)。将培养前和加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基培养的银屑病皮损培养6天的组化染色结果分别与正常对照比较进行统计学分析，具显著性差异，P＜0.01；将培养前后银屑病组的免疫组化结果进行比较，未见显著性差异，P＞0.05；将培养前后正常皮肤的免疫组化结果进行比较，存在显著性差异，P＜0.01(见表1)。

表1.体外培养的银屑病皮损表皮内k17的表达情况(例数)

注：P表示银屑病皮损；N表示正常皮；*培养前和W+C+A6天与正常对照比较，P＜0.01；#银屑病皮损培养前与W+C+A6天比较，P＞0.05；&表示正常皮肤培养前后比较P＜0.01

2.Western blotting半定量检测K17

培养前和W+C+A6天培养后皮损及正常对照皮肤组织提取蛋白后Westernblotting检测K17结果，蓝色预染低分子量蛋白Marker对照估计K17分子量大约为46kDa(见图6；图6SDS-PAGE检测蛋白分子量：正常对照不显示而样品显影的黑色条带对应的照标准蛋白Marker大致推测K17含量)，X线片成像后只见到培养前和加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基培养的银屑病皮损培养6天样品泳道上处出现两条一致的明显条带，两个条带的亮度无差别，而正常皮肤对照处印迹模糊(见图7，图7Western blotting半定量检测K17泳道1：正常皮肤对照；泳道2，3：培养前和培养W+C+A6天皮损。上方为K17，下方为β-Actin内参对照)。三.细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-8含量检测

P表示银屑病患者，N代表正常对照，P、N后面的数字代表序号。例如：P1为随机抽取的第1例银屑病患者。

1.ELISA结果

随机抽取三例银屑病患者及两例正常对照。银屑病组别，不同培养条件下细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-8均含量显著增高，而正常对照组培养前皮肤组织匀浆中不表达；将同一培养条件不同组别细胞因子含量求均值后，同正常对照未培养的皮肤中细胞因子含量平均值进行单因素比较，P＜0.01，有显著性差异；同一例银屑病皮损，培养前和加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基培养后，细胞因子含量比较，无显著性差异，P＞0.05，证明含量变化不大，而单纯无血清培养或仅加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞培养基培养后的银屑病皮损中，细胞因子含量显著下降，P＜0.05；正常皮损，加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞及β-溶血性链球菌抗原成分的无血清培养基培养后，出现INF-γ、TNF-α表达。

表2.组织匀浆IL-8(pg/mL)检测结果(x±s)

注：a表示同类皮损未培养与培养后比较；b表示银屑病皮损与正常对照皮损比较；*表示P＜0.01；#表示P＞0.05

表3组织匀浆INF-γ(pg/mL)检测结果(x±s)

注：a表示同类皮损未培养与培养后比较；b表示银屑病皮损与正常对照皮损比较；*表示P＜0.01；#表示P＞0.05

表4组织匀浆TNF-α(pg/mL)检测结果(x±s)

注：a表示同类皮损未培养与培养后比较；b表示银屑病皮损与正常对照皮损比较；*表示P＜0.01；#表示P＞0.05

2.利用EXCEL软件做出了不同条件、不同病例的细胞因子含量变化趋势图

从图8、9、10中，我们可以很直观的看出，银屑病皮损的细胞因子含量的曲线要要明显高于正常皮肤的曲线；而同一病例不同条件三天、六天时的细胞因子含量曲线图呈“W”型趋势，说明在加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞和链球菌抗原培养基培养条件下的银屑病皮损始终保持了细胞因子高表达的状态，而单纯无血清培养和仅加入T淋巴细胞培养条件下，细胞因子含量显著降低。另外从图8、9的蓝线我们可以看出正常皮肤在加入银屑病患者外周血分离出来的T淋巴细胞和链球菌抗原培养基培养条件下细胞因子INF-γ、TNF-α含量有了向上的波动，但图10中正常皮肤无论什么条件下培养，IL-8始终阴性表达。

结论：本发明采用现代器官培养研究所用的先进技术和方法，完全模拟人体内银屑病的发病机制，经反复实验筛选确立培养条件并利用组织病理、免疫组化等技术对实验结果进行鉴定，最后得出体外培养银屑病皮损的方法，验证了所用实验模型和检测指标的可行性。研究获得的体外培养银屑病皮损的方法，操作简单易行，成本低廉，避免了以往银屑病动物模型的局限性及不稳定性。进一步检测角蛋白及细胞因子的相关指标，用于银屑病的发病机理研究及临床检测。进一步开发可成为体外银屑病模型的一种全新模式，用于银屑病基础实验和临床研究。