法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-02-13
授权
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2009-12-30
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-11-04
公开
公开
技术领域
本发明涉及能够抑制给定的枯草杆菌(Bacillus subtilis)来源的溶解酶的溶解活性的溶解酶抑制剂、能够抑制微生物溶解的溶解抑制剂、其溶解受到抑制的微生物、聚-γ-谷氨酸降解抑制剂和聚-γ-谷氨酸的制造方法。
背景技术
枯草杆菌溶解酶在生命周期中发挥着关键作用，例如细胞分裂、芽孢形成期(sporulation phase)中母细胞的溶解、孢子的萌发等。枯草杆菌具有不同的溶解酶，这些溶解酶根据例如细胞分裂的过程或芽孢形成期而特异性地表达。这些溶解酶当中有许多都具有与细胞壁结合的结合结构域和使细胞壁溶解的活性结构域。作为在枯草杆菌的对数生长期表达的溶解酶，已知有Cw1B(参见Kuroda，A.和J.Sekiguchi，1991，“Molecular cloning and sequencing of a major Bacillus subtilisautolysin gene(主要枯草杆菌自溶素基因的分子克隆和测序)”，J.Bacteriol.173：7304-7312；和Lazarevic，V.，P.Margot，B.Sold和D.Karamata，1992，“Sequencing and analysis of the Bacillus subtilis lytRABCdivergone：a regulatory unit encompassing the structural gene of theN-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and its modifier(枯草杆菌lytRABCdivergone的测序和分析：包括N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶结构基因及其修饰物的调控单元”，J.Gen.Microbiol.138：1949-1961)和CwlG(参见Margot，P.，C.Mauel和D.Karamata，1994，“The gene of theN-acetyl-glucosaminidase，a Bacillus subtilis cell wall hydrase not involvedin vegetative cell autolysis(N-乙酰基-氨基葡糖苷酶——不参与营养细胞自溶的枯草杆菌细胞壁水化酶的基因)”，J.Bacteriol.12：535-545；和Rashid，M.H.，M.Mori和J.Sekiguchi，1995.“Glucosaminidase ofBacillus subtilis：cloning，regulation，primary structure and biochemicalcharacterization(枯草杆菌氨基葡糖苷酶：克隆、调节、一级结构和生化表征)”，Microbiology 141：2391-2404)。作为在枯草杆菌的细胞分裂末期表达的溶解酶，已知有Cw1E (参见Margot，P.，M.Pagni和D.Karamata，1999，“Bacillus subtilis 168 gene lytF encodes aγ-D-glutamate-meso-diaminopimelate muropeptidase expressed by thealternative vegetative sigma factor，σD(枯草杆菌168基因lytF编码通过新的营养σ因子σD表达的γ-D-谷氨酸-meso-二氨基庚二酸酯)”，Microbiology 145：57-65；和Ohnishi，R.，S.Ishikawa和J Sekiguchi，1999.“Peptidoglycan hydrase Lytf plays a role in cell separation with LytEduring vegetative growth of Bacillus subtilis(在枯草杆菌的营养生长过程中肽聚糖水化酶LytF与LytE一起在细胞分离中发挥作用)”，J.Bacteriol.181：3178-3184)和Cw1F(参见Ishikawa，S.，Y.Hara，R.Ohnishi和J.Sekiguchi，1998，“Regulation of a new cell wall hydrase gene，Cw1F，which affects cell separation in Bacillus subtilis(影响枯草杆菌中细胞分离的新的细胞壁水化酶基因Cw1F的调节)”，J.Bacteriol.180：2549-2555；和Margot，P.，M.Wahlen，A.Gholamhuseinian，P.Piggot和D.Karamata，1998，“The lytE gene of Bacillus subtilis 168 encodes a cellwall hydrase(枯草杆菌168的lytE基因编码细胞壁水化酶)”，J.Bacteriol.80：749-752)。
然而，溶解酶对枯草杆菌细胞壁的作用机制尚未完全明了，而且抑制溶解酶活性的方法也尚未建立。如果溶解酶的活性可以得到抑制，则微生物溶解也可以得到抑制。
聚-γ-谷氨酸(下文缩写为“PGA”)是谷氨酸γ位的羧基与α位的氨基经肽键连接的聚合化合物。PGA已知是由纳豆菌(Bacillus subtilisvar.natto)产生的粘性物质，近年来由于其各种特性作为新型聚合材料而倍受关注。从作为材料的各种应用角度来看，具体地，分子量相对较高的PGA是优选的。然而，使用能够产生PGA的微生物来产生分子量相对较高的PGA的技术尚未知晓。
发明内容
在上述情况下，本发明旨在提供可以调节用于降解细胞壁的溶解酶的活性的溶解酶抑制剂，以及可以抑制微生物溶解的溶解抑制剂。本发明还旨在提供制造分子量相对较高的PGA的方法，以及抑制PGA降解的方法。
为达到上述目的，本发明人已经进行了集中的研究。结果，他们发现，其功能未知的给定基因产物可以抑制用于降解细胞壁的溶解酶的活性，并且该基因产物可以抑制降解PGA(即降低分子量)的酶的活性。由此完成了本发明。
本发明的溶解酶抑制剂、溶解抑制剂和PGA降解抑制剂主要由枯草杆菌来源的YoeB基因或与YoeB基因同源的基因编码的YoeB蛋白质组成。
本文所用的术语“YoeB蛋白质”可以定义为以下蛋白质(a)至(c)中的任一种：
(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由从SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有与枯草杆菌来源的溶解酶结合以抑制其溶解活性的活性；以及
(c)由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有与枯草杆菌来源的溶解酶结合以抑制其溶解活性的活性。
本发明的溶解酶抑制剂具体地可以抑制由Cw1E蛋白质、Cw1F蛋白质、Cw1S蛋白质、Cw1O蛋白质或YddH蛋白质引起的溶解。
“Cw1E蛋白质”可以定义为以下蛋白质(a)至(c)中的任一种：
(a)由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由从SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性；以及
(c)由与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性。
“Cw1F蛋白质”可以定义为以下蛋白质(a)至(c)中的任一种：
(a)由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由从SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性；以及
(c)由与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性。
此外，本发明的溶解抑制剂具体地可以抑制枯草杆菌的溶解。枯草杆菌菌株不限于野生型枯草杆菌菌株，其例子有缺乏至少一种类型的分泌性蛋白酶的突变体。
“Cw1S蛋白质”可以定义为以下蛋白质(a)至(c)中的任一种：
(a)由SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由从SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性；以及
(c)由与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性。
“Cw1O蛋白质”可以定义为以下蛋白质(a)至(c)中的任一种：
(a)由SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由从SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性；以及
(c)由与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性。
“YddH蛋白质”可以定义为以下蛋白质(a)至(c)中的任一种：
(a)由SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由从SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性；以及
(c)由与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌的细胞壁的活性。
本发明的PGA降解抑制剂可以抑制由上述溶解酶当中的Cw1E蛋白质、Cw1F蛋白质、Cw1S蛋白质或Cw1O蛋白质引起的聚-γ-谷氨酸的降解。在上述溶解酶当中，与Cw1E蛋白质、Cw1F蛋白质、Cw1S蛋白质和Cw1O蛋白质不同，YddH蛋白质不显示PGA降解的活性。
此外，本发明的微生物表达诱导型启动子下游的表达枯草杆菌来源的YoeB基因或与YoeB基因同源的基因，使得微生物的溶解已被抑制。本发明的微生物特别优选地缺乏至少一种类型的分泌型蛋白酶。
另外，本发明的微生物优选地能够产生PGA。本发明的微生物可以通过YoeB蛋白质抑制溶解酶降解PGA的活性。抑制PGA降解活性的溶解酶的例子包括枯草杆菌来源的Cw1E、Cw1F、Cw1S和Cw1O蛋白质和功能上与上述蛋白质等效的蛋白质。
本发明的产生PGA的方法包括在枯草杆菌来源的YoeB基因或与YoeB基因同源的基因编码的YoeB蛋白质的存在下培养能够产生PGA的微生物，以及回收在培养基中产生的PGA。本发明的产生PGA的方法可以涉及使用表达诱导型启动子下游的枯草杆菌来源的YoeB基因或与YoeB基因同源的基因的微生物。另外可选地，该方法可以涉及将YoeB蛋白质添加至培养基中。根据本发明的产生PGA的方法，上述微生物在PGA降解酶的PGA降解活性被YoeB蛋白质抑制的同时产生PGA。
本说明书包括在日本专利申请No.2006-281768的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，该申请是本申请的优先权文件。
附图说明
图1(A)是显示从WE1 YoeB3FL菌株中提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质(第1道)和从WE1E3FL菌株中提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质(第2道)的SDS-PAGE分析结果的照片。图1(B)是显示从WE1YoeB3FL菌株(第1道)中提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质的SDS-PAGE分析结果以及涉及加入细胞壁成分作为底物的酶谱法(zymography)结果(第2道)的照片。
图2(A)是显示从WE1E3FL菌株中提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质(第1道)和从WE15xLysM3FL菌株中提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质(第2道)的SDS-PAGE分析结果的照片。图2(B)是显示从WE1F3FL菌株中提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质(第1道)和从WE13xLysM3FL菌株中提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质(第2道)的SDS-PAGE分析结果的照片。
图3是显示当使用细胞壁成分作为底物时，已加入His-Cw1ECTD的样品、已以1∶1加入His-Cw1ECTD和His-YoeB的样品以及已以1∶2加入His-Cw1ECTD和His-YoeB的样品的反应时间和浊度降低之间的关系的特征图。
图4时显示当使用细胞壁成分作为底物时，已加入h-ΔCw1S蛋白质的样品以及已以1∶2加入h-ΔCw1S蛋白质和His-YoeB的样品的反应时间和浊度降低之间的关系的特征图。
图5是显示当使用细胞壁成分作为底物时，已加入6His-C-Cw1O蛋白质的样品以及已以1∶2加入6His-C-Cw1O蛋白质和His-YoeB的样品的反应时间和浊度降低之间的关系的特征图。
图6是显示当使用细胞壁成分作为底物时，已加入6His-C-YddH蛋白质的样品以及已以1∶2加入6His-C-YddH蛋白质和His-YoeB的样品的反应时间和浊度降低之间的关系的特征图。
图7是显示当YoeB蛋白质过度表达时，在缺乏分泌性蛋白酶的Dpr8菌株中的溶解抑制作用的特征图。
图8是显示表示在存在和不存在YoeB蛋白质的情况下的Cw1E蛋白质的PGA降解活性的比较和考察结果的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果的照片。
图9是显示表示在存在和不存在YoeB蛋白质的情况下Cw1F蛋白质的PGA降解活性的比较和考察结果的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果的照片。
图10是显示表示在存在和不存在YoeB蛋白质的情况下Cw1S蛋白质的PGA降解活性的比较和考察结果的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果的照片。
图11是显示表示在存在和不存在YoeB蛋白质的情况下Cw1O蛋白质的PGA降解活性的比较和考察结果的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果的照片。
图12是显示表示在存在和不存在YoeB蛋白质的情况下YwtD蛋白质的PGA降解活性的比较和考察结果的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果的照片。
具体实施方式
下文，参考附图对本发明进行详细说明。
本发明的溶解酶抑制剂、溶解抑制剂和PGA降解抑制剂主要由枯草杆菌YoeB基因或与YoeB基因同源的基因编码的YoeB蛋白质组成。
枯草杆菌YoeB基因的核苷酸序列的实例显示于SEQ ID NO：1，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的YoeB蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。由枯草杆菌YoeB基因编码的YoeB蛋白质不限于由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的多肽。它可以是从SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的多肽，其具有抑制溶解酶的溶解活性的活性(下文中称为“突变多肽”)。被取代、缺失、添加或插入的氨基酸的数目可以是，例如，1-20个，优选1-10个，更优选1-5个。其中取代、缺失、添加、或插入一个或多个氨基酸的区域是，例如，除SEQID NO：2所示的氨基酸序列的24位和181位之间的区域之外的区域。2位和181位之间的区域被认为与溶解酶结合。因此，即使在除上述区域之外的区域中取代、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸，也可以保留抑制溶解酶溶解活性的活性。
由枯草杆菌YoeB基因编码的YoeB蛋白质不限于由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的多肽。它可以是与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、最优选95％或更高的多肽，其具有与枯草杆菌来源的溶解酶结合以抑制其溶解活性的活性(下文中也称其为“突变多肽”)。同源性的值是使用计算多条氨基酸序列之间的同源性的软件(例如，DANASYS或BLAST)缺省确定的值。
枯草杆菌YoeB基因不限于由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。它可以是在严格条件下与由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸，其编码的多肽具有抑制溶解酶溶解活性的活性(下文中称其为“突变多核苷酸”)。突变多核苷酸编码由不同于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的多肽，该多肽具有抑制溶解酶溶解活性的活性(下文中称其为“突变多肽”)。
严格条件是指形成所谓的特异性杂交、但不形成非特异性杂交的条件。在严格条件下，例如，高度同源的DNA相互杂交(例如，其间的同源性为50％或更高)，相互同源性较小的DNA则不杂交。更具体地，作为严格条件，杂交在60℃下发生，并且盐浓度相当于1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，其为用于普通Southern杂交的洗涤条件。突变多核苷酸可以通过将给定突变导入枯草杆菌来源的野生型YoeB基因而获得。导入突变的方法不受具体限制，可以采用所谓的定点诱变。
可以通过以下方式确定各种上述突变多核苷酸是否具有抑制溶解酶溶解活性的活性。具体地，制备含有代替野生型YoeB基因的编码突变多肽的基因的突变体。另外可选地，制备野生型YoeB基因被破坏、并导入突变多肽的突变体。培养这些突变体，并观察形态学。当突变多肽具有抑制溶解酶溶解活性的活性时，突变体的形状比野生型菌株要圆。当突变多肽不具有抑制溶解酶溶解活性的活性时，突变体的形状变成棒状，如野生型菌株那样。因此，表达编码突变多肽的基因的突变体的形态学观察能够确定突变多肽是否具有抑制溶解酶溶解活性的活性。
本发明的溶解酶抑制剂、溶解抑制剂或PGA降解抑制剂的主要成分不限于由枯草杆菌来源的YoeB基因编码的蛋白质。主要成分可以是由与枯草杆菌YoeB基因对应的、已从枯草杆菌以外的微生物中分离的同源基因编码的YoeB蛋白质。枯草杆菌以外的微生物的一个实例是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
下文中，说明用于从枯草杆菌之外的微生物中分离YoeB基因的同源基因的方法。然而，本领域技术人员可以根据常规技术而不限于下述技术来分离目标同源基因。
首先，使用SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列作为查询序列，使用储存核苷酸序列信息的数据库来识别高度同源的基因。随后，设计并化学合成用于特异性扩增识别出的基因的引物。随后，根据常规技术从目标微生物中提取基因组DNA。YoeB基因的目标同源基因可以使用提取的基因组DNA作为模板并使用上述引物经PCR进行扩增，然后加以分离。
通过制备其中已合并有分离出的YoeB基因的同源基因的表达载体，将其转化到目标微生物中，并当在上述同源基因得以表达的条件下培养转化的微生物时观察形状，可以确认分离出的YoeB基因的同源基因是否具有与YoeB蛋白质等效的功能。当分离出的YoeB基因的同源基因具有与YoeB蛋白质等效的功能时，转化的微生物的形状变得比野生型菌株的形状更圆。当分离出的YoeB基因的同源基因具有与YoeB蛋白质类似的功能时，转化的微生物的形状将类似于野生型菌株的形状。
枯草杆菌YoeB基因和与YoeB基因同源的基因可以用来制备YoeB蛋白质，该蛋白质是本发明的溶解酶抑制剂和溶解抑制剂的主要成分。通过使用重组载体，使用上述枯草杆菌YoeB基因或与YoeB基因同源的基因可以产生YoeB蛋白质，上述重组载体是通过将目标基因结合在可以在宿主细胞中复制并保持目标基因、可以稳定地表达酶并且可以稳定地保持该基因的载体中，从而转化宿主微生物而制备的。
当使用大肠杆菌(E.coli)宿主时，载体不受具体限制，可以使用pUC18、pBR322、pHY300PLK(Yakult Honsha Co.，Ltd.)和其他载体。当使用枯草杆菌宿主时，可以使用pUB110、pHSP64(Sumitomo等人，Biosci.Biotechnol，Biocem.，59，2172-2175，1995)、pHY300PLK或其他载体，而没有特别的限制。
宿主细胞可以经原生质体法、感受态细胞法、电穿孔或其他技术来转化。宿主细胞没有特别的限制，其实例包括诸如枯草杆菌的革兰氏阳性菌株，诸如大肠杆菌的革兰氏阴性菌株，诸如链霉菌(Streptomyces)的放线菌，诸如酵母菌(Saccharomyces)的酵母和诸如曲霉菌(Aspergillus)的真菌。
得到的转化体可以使用含有微生物可同化(assimilable)的碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基在适当条件下进行培养。得到的培养溶液可根据常规技术进行酶的分级分离或提纯，以经由超滤、冻干、喷雾干燥、结晶等浓缩来获得具有抑制溶解酶溶解活性的活性的YoeB蛋白质。
当本发明的溶解酶抑制剂和溶解抑制剂加入到其中培养有微生物的培养基或加入到其中悬浮有微生物的缓冲液中时，微生物表达的溶解酶的活性可以得到降低，并且该微生物的溶解可以得到抑制。本发明的溶解酶抑制剂所抑制的溶解酶不受具体的限制，其实例包括以依赖于细胞周期的方式表达的溶解酶和以不依赖于细胞周期的方式表达的溶解酶。特别地，本发明的溶解酶抑制剂可以抑制由Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O和YddH蛋白质引起的溶解，上述这些蛋白质均是枯草杆菌的溶解酶。Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O和YddH蛋白质已知是在枯草杆菌细胞分裂的末期在细胞分裂表面和细胞两极处表达的溶解酶。Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O和YddH蛋白质各自从N-端依次含有信号肽、细胞壁结合结构域和用于细胞壁溶解的活性结构域(即D，L-内肽酶结构域)。本发明的溶解酶抑制剂和溶解抑制剂与Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O和YddH蛋白质用于细胞壁溶解的活性结构域结合，并抑制Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O和YddH蛋白质的细胞壁溶解活性，以抑制溶解。
当培养能够产生PGA的微生物时加入本发明的PGA降解抑制剂时，具有PGA降解活性的溶解酶的PGA降解活性可以被降低，并且可以防止微生物所产生的PGA的分子量的降低。本发明的PGA降解抑制剂所抑制的溶解酶的实例包括Cw1E、Cw1F、Cw1S和Cw1O蛋白质。通过降低溶解酶的PGA降解活性，可以产生分子量相对较高的PGA。
编码Cw1E蛋白质的基因(Cw1E基因)的核苷酸序列显示于SEQID NO：3，Cw1E蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4。编码Cw1F蛋白质的基因(Cw1F基因)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：5，Cw1F蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6。编码Cw1S蛋白质的基因(Cw1S基因)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：54，Cw1S蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：55。编码Cw1O蛋白质的基因(Cw1O基因)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：56，Cw1O蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：57。编码YddH蛋白质的基因(YddH基因)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：58，YddH蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：59。
术语“功能上与枯草杆菌来源的Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O或YddH蛋白质等效的蛋白质”是指，例如，由从SEQ ID NO：4、6、55、57、或59所示的氨基酸序列通过取代、缺失、添加或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌细胞壁的活性，或者是，由与SEQ ID NO：4、6、55、57、或59所示的氨基酸序列的同源性为70％或更高、80％或更高、90％或更高、更优选95％或更高、进一步优选96％或更高、特别优选97％或更高、并且最优选99％或更高的氨基酸序列组成的蛋白质，并且该蛋白质具有溶解枯草杆菌细胞壁的活性。本发明的溶解酶抑制剂可以作用于这些蛋白质。
被取代、缺失、添加或插入的氨基酸的数目可以是，例如，1-40个、优选1-20个、并且更优选1-10个。其中取代、缺失、添加、或插入一个或多个氨基酸的区域是，例如，除SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的371位和488位之间的区域、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的218位和334位之间的区域、SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的1位和290位之间的区域、SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的1位和343位之间的区域、SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的1位和206位之间的区域之外的区域。SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的371位和488位之间的区域、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的218位和334位之间的区域、SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的1位和290位之间的区域、SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的1位和343位之间的区域、SEQID NO：59所示的氨基酸序列的1位和206位之间的区域被认为是与本发明的溶解酶抑制剂结合的区域。因此，即使在除上述区域之外的区域中取代、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸，本发明的溶解酶抑制剂的活性也可以得到保留。
如上所述，本发明的溶解酶抑制剂和溶解抑制剂能够通过YoeB蛋白质与诸如Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O或YddH蛋白质用于细胞壁溶解的溶解酶活性结构域结合而抑制溶解酶的细胞壁溶解活性。这抑制了表达上述溶解酶的微生物的溶解，并能够使其培养相对长的时间。例如，当使用诸如枯草杆菌的微生物来产生物质时，如果每个细胞可以培养更长的时间，则可以增加物质的产生量。在培养产生目的物质的微生物时添加本发明的溶解酶抑制剂，该物质的生产效率可以得到提高。
本发明的溶解抑制剂可以应用于很宽范围的微生物。特别优选应用于杆菌(Bacillus)，例如枯草杆菌。本发明的溶解抑制剂的靶标微生物不限于野生型微生物。例如，具有各种突变的突变体也可以作为靶标。本发明的溶解抑制剂的靶标微生物的一个实例是缺乏至少一种类型的分泌性蛋白酶的突变体。由于这些突变体缺乏分泌性蛋白酶，优选以其作为将物质例如有用的蛋白质产生在细胞外部的宿主。通过加入本发明的溶解抑制剂，使用该突变体产生目的物质的系统可以抑制突变体的溶解。这使得突变体能够培养相对长的时间。因此，可以提高该物质的生产效率，并可以降低物质生产的成本。
本发明的溶解酶抑制剂或溶解抑制剂的加入量不受具体限制。可以适当地确定该用量，只要该抑制剂可以与诸如Cw1E、Cw1F、Cw1S、Cw1O或YddH蛋白质的用于细胞壁溶解的溶解酶的活性结构域结合。
如上所述，本发明的PGA降解抑制剂能够通过使YoeB蛋白质与诸如Cw1E、Cw1F、Cw1S或Cw1O蛋白质的具有用于细胞壁溶解的PGA降解活性的溶解酶的活性结构域结合，从而抑制溶解酶的PGA降解活性。当在PGA降解抑制剂的存在下培养能够产生PGA并表达溶解酶的微生物时，相应地，可以产生分子量相对高的PGA。术语“分子量相对高的PGA”是指分子量显著高于在不存在本发明的PGA降解抑制剂的情况下由该微生物所产生的PGA的平均分子量的PGA。如上所述由于本发明的PGA降解抑制剂可以抑制微生物溶解，因此可以长时间地产生分子量相对高的PGA。
本发明的PGA降解抑制剂可以应用于很宽范围的能够产生PGA的微生物。能够产生PGA的微生物的实例包括纳豆菌、癣样芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)和水螅嗜热古细菌(Natrialba aegyptiaca，Hydra)。
本发明可以提供修饰成表达溶解酶抑制剂或者在表达诱导型启动子的控制下编码溶解抑制剂的基因的微生物。通过在可诱导表达的条件下培养本发明的微生物，溶解抑制剂被分泌至培养基中，该抑制剂又能够相对长时间地抑制溶解。
因此，具有该结构的本发明的微生物可以被利用来产生诸如有用蛋白质的物质，以提高该物质的生产效率。特别优选地，使用缺乏至少一种类型的分泌性蛋白酶的突变体作为宿主来修饰本发明的微生物，以表达溶解酶抑制剂或在表达诱导型启动子下游的编码溶解抑制剂的基因。这类结构能够防止诸如有用蛋白质的靶标物质的降解，这又使得能够实现更高的生产效率。
本文所用的术语“表达诱导型启动子”是指具有以下功能的启动子：在给定物质的存在下增强位于下游的基因的表达。用于本发明的微生物的表达诱导型启动子不受特别的限制。一个实例是受lac操纵子阻遏物即lac1调节的启动子(Pspac)，其在IPTG的存在下诱导下游基因的表达。
作为本发明的微生物，特别优选地，能够产生PGA的微生物修饰成在表达诱导型启动子的控制下表达编码PGA降解抑制剂的基因。将该微生物在培养基中培养能够产生分子量相对高的PGA。当在培养基中培养该微生物以产生分子量高的PGA时，可以向培养基中加入单独制备的PGA降解抑制剂。
下文中，参照实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于此。
[实施例1]考察YoeB蛋白质-溶解酶相互作用
在该实施例中，考察由YoeB(SEQ ID NO：1)基因编码的YoeB蛋白质(SEQ ID NO：2)和由Cw1E基因(SEQ ID NO：3)编码的Cw1E蛋白质之间的相互作用。
具体地，首先构建用IPTG诱导表达YoeB-3×FLAG蛋白质的WE1YoeB3FL菌株和用IPTG诱导表达Cw1E-3×FLAG蛋白质的WE1E3FL菌株。使用WE1菌株制备WE1YoeB3FL菌株和WE1E3FL菌株(Yamamoto，H.等人，2003“Localization of the vegetative cell wallhydrases LytC，LytE，LytF on the Bacillus subtilis cell surface and stabilityof these enzymes to cell wall-bound or extracellular proteases(营养细胞壁水解酶LytC、LytE、LytF在枯草杆菌细胞表面上的定位以及这些酶对细胞壁结合的或细胞外的蛋白酶的稳定性)”J.Becteriol.，185：6666-6677)。WE1菌株具有其中微小细胞外丝氨酸蛋白酶通过插入四环素-抗性基因(即epr基因)而破坏并且细胞壁相关蛋白酶通过插入卡那霉素(kanamycin)-抗性基因(即wprA基因)而破坏的基因型。
通过将含有IPTG-诱导型启动子下游的编码YoeB-3×FLAG蛋白质的基因的pCA3FLYoeB载体转化到WE1菌株中，制备WE1YoeB3FL菌株。通过将含有IPTG-诱导型启动子下游的编码Cw1E-3×FLAG蛋白质的基因的pCA3FLCE载体转化到WE1菌株中，制备WE1E3FL菌株。3×FLAG-融合蛋白质可以使用抗-FLAG M2单克隆抗体(Sigma)来检测。
随后，分别从已构建的WE1YoeB3FL和WE1E3FL菌株提取外表面蛋白质。具体地，将这些菌株各自接种在LB琼脂培养基中，并在37℃下预培养12小时。将得到的单个集落接种在5ml LB液体培养基中，然后在30℃下预培养10小时。预培养后，将预培养的菌株接种在50ml LB液体培养基中，以使OD600值达到0.01，并进行主培养，直至OD600值达到2.0。培养完成后，将培养溶液在10,000rpm下离心10分钟。去除上清液，并用25mM Tris-HCl(pH 7.2)洗涤沉淀物。将洗涤过的沉淀物悬浮在3M LiCl(25mM Tris-HCl，pH 7.2)中至密度为10μl/OD，并使悬浮液置于冰上20分钟。此后，在4℃下以10,000rpm离心10分钟。回收上清液，加入TCA(三氯乙酸)至终浓度为5％，将混合物充分混合，得到的悬浮液置于冰上60分钟。此后，在4℃下以15,000rpm离心5分钟。去除上清液，沉淀物用70％乙醇漂洗，以充分回收TCA。由此，分别从WE1YoeB3FL菌株和WE1E3FL菌株中提取外表面蛋白质。
随后，加入代替有TBS缓冲液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl(pH7.4))的200μl亲和胶(Anti-FLAG M2 Affinity Gel Freezer-Safe(Sigma))并混合。混合物在4℃下轻轻搅动(8rpm)1小时。此后，以5,000rpm离心1分钟。去除上清液，同时小心地避免吸入沉淀的凝胶。此后，加入500μl TBS缓冲液以制备悬浮液。此后，将凝胶转移至Spin Column(Micro Bio Spin Chromatography Columns(BIO RAD))，并且通过在1,000g下离心30秒收集(trap)凝胶。此后，用500μl TBS缓冲液将所得物洗涤三次。随后，依序向其中加入100μl甘氨酸HCl洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl)并充分地搅动。1分钟后在1,000g下进行30秒的洗脱，该步骤重复两次。将产物合并，以制备洗脱溶液。
随后，经SDS-PAGE考察所得的洗脱溶液的带型。通过以与从细胞提取的量(OD600＝200)相对应的量将蛋白质装入各泳道中来进行电泳。结果显示于图1A。在图1A中，第1道代表从WE1YoeB3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质，第2道代表从WE1E3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质。
从图1A的第1道明显看出，在从WE1YoeB3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质中，在与Cw1E蛋白质、Cw1F蛋白质和YojL蛋白质对应的位置处检测到条带。积分值及其比例显示于表1。
表1
结果表明，当细胞的OD600为2.0时，YoeB蛋白质与Cw1E、Cw1F和YojL蛋白质结合。YojL蛋白质已知是肽聚糖水解酶(DL-内肽酶II家族)的成分。从图1A的第2道明显看出，在从WE1E3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质中，在与YoeB蛋白质对应的位置处检测到条带。
为了验证与YoeB蛋白质相互作用的蛋白质是Cw1E蛋白质，使用细胞壁成分作为底物进行酶谱法。通过以下方式制备细胞壁成分。具体地，首先将枯草杆菌168菌株在4升系统中培养、收获、悬浮在4MLiCl溶液中，然后煮沸15分钟。溶液冷却至室温，向其中加入玻璃珠并使用匀浆机将菌株破碎1小时，然后使用超声波破碎30分钟。将得到的破碎菌株的溶液静置，并回收上清液。在3,000rpm下离心5分钟后回收上清液，以完全地去除玻璃珠。随后，在13,000rpm下离心10分钟，以回收沉淀部分中的细胞壁成分。然后将沉淀部分悬浮在4％(w/v)SDS溶液中，并将所得物煮沸15分钟。然后，将所得物冷却至室温，然后用离子交换水洗涤，直至完全去除SDS。所得的溶液被称为细胞壁成分溶液。溶液中细胞壁成分的密度基于测定的1.0的OD540值计算为1.1mg/ml。
通过以下方式进行酶谱法。首先，在进行SDS-PAGE时，将细胞壁成分加入到分离胶中，至终密度为0.05％。完成电泳后，将凝胶在复性缓冲液(25mM Tris-HCl(pH 7.2)，1％Triton-X100)中在37℃下轻轻摇晃1-16小时。此后，将所得物浸泡在染色溶液(0.01％亚甲蓝，0.01％KOH)中，在室温下轻轻摇晃，然后用离子交换水脱色，直至可在视觉上观察到活性条带。
结果显示于图1B。在图1B中，第1道代表从WE1YoeB3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质，第2道代表使用细胞壁成分作为底物进行酶谱法的结果。如图1B中第2道所示，在与在Cw1E蛋白质作为与YoeB蛋白质相互作用的蛋白质的情况下相同的位置处检测到强度基本上相同的条带。
图1A和1B所示的结果证明YoeB蛋白质与Cw1E蛋白质结合。
随后，考察已结合有YoeB蛋白质的Cw1E蛋白质的结构域。Cw1E蛋白质从N-端依次包括信号肽、细胞壁结合结构域和活性结构域。由此，构建表达用IPTG诱导的突变Cw1E-3×FLAG蛋白质的WE15xLysM3FL菌株，该突变Cw1E-3×FLAG蛋白质没有活性结构域，并且从N-端依次含有信号肽、细胞壁结合结构域和FLAG标记。
使用上述WE1E3FL菌株和WE15xLysM3FL菌株，使用抗-FLAG抗体纯化外表面蛋白质，并且以与上述实验相同的方式经SDS-PAGE考察带型。以与从细胞提取的量(OD600＝200)对应的量将蛋白质加入相关泳道，进行WE1E3FL菌株的电泳。以与从细胞提取的量(OD600＝2,000)对应的量将蛋白质加入相关泳道，进行WE15xLysM3FL菌株的电泳。
结果显示于图2A。在图2A中，第1道代表从WE1E3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质，第2道代表从WE15xLysM3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质。从图2A中明显看出，在第1道中检测到YoeB蛋白质的条带，但在第2道中没有检测到该条带。该结果证明YoeB蛋白质与Cw1E蛋白质的活性结构域结合。
如图1A所示，发现YoeB蛋白质也与Cw1F蛋白质结合。由此，另外考察Cw1F蛋白质与YoeB蛋白质相互作用的位点。Cw1F蛋白质是主要的枯草杆菌细胞壁降解酶，并已知其表现与出Cw1E蛋白质类似的定位模式(即，细胞分裂表面和两极)。
在该实验中，构建表达使用IPTG诱导的Cw1F-3×FLAG蛋白质的WE1F3FL菌株和表达使用IPTG诱导的突变Cw1F-3×FLAG蛋白质的WE13xLysM3FL菌株，该突变Cw1F-3×FLAG蛋白质没有活性结构域，并且从N-端依次含有信号肽、细胞壁结合结构域和FLAG标记。使用上述WE1F3FL菌株和WE13xLysM3FL菌株，使用抗-FLAG抗体纯化外表面蛋白质，并以与上述实验相同的方式经SDS-PAGE考察带型。
结果显示于图2B。在图2B中，第1道代表从WE1F3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质，第2道代表从WE13xLysM3FL菌株提取的用抗-FLAG抗体纯化的外表面蛋白质。从图2B中明显看出，在第1道检测到YoeB蛋白质的条带，但在第2道没有检测到该条带。该结果证明，如Cw1E蛋白质的情况那样，YoeB蛋白质也与Cw1F蛋白质的活性结构域结合。
[实施例2]YoeB蛋白质抑制溶解酶活性的作用1
在该实施例中，通过液相活性测定(activity assay in liquid)来考察YoeB蛋白质对溶解酶的细胞壁溶解活性的作用方式。在该实施例中，使用与实施例1相同的方式制备的细胞壁成分作为底物在存在或不存在YoeB蛋白质的情况下测定Cw1E的C-端活性结构域(Cw1ECTD)的细胞壁溶解活性。
在该实施例中，使用20mM MES缓冲液(pH 6.5)测定细胞壁溶解活性。用测定缓冲液洗涤与OD540＝0.6对应的量的细胞壁成分，并通过离心沉淀细胞壁。去除上清液，向沉淀物中加入2ml测定缓冲液以制备悬浮液，制备细胞壁成分，将最终OD540值调节至0.3，所得物被指定为底物溶液。
通过使Cw1E的His-标记-融合的C-端活性结构域(His-Cw1ECTD)作用于底物溶液并测定底物溶液的浊度来进行活性测定。具体地，根据浊度的降低评价His-Cw1ECTD的细胞壁溶解活性。使用紫外-可见分光光度计(V-560，JASCO Corporation)测定底物溶液的浊度。通过将测定开始后0分钟的OD540值指定为100％并基于之后5、10、20和30分钟的OD540值来计算降低值，从而确定浊度的降低。
在该实施例中，对通过向底物溶液加入2nmol(29μg)His-Cw1ECTD制备的样品、通过向底物溶液加入2nmol(29μg)His-Cw1ECTD和2nmol(38.1μg)His-YoeB制备的样品、以及通过向底物溶液加入2nmol(29μg)His-Cw1ECTD和4nmol(76.1μg)His-YoeB制备的样品进行测定。
反应时间和浊度降低之间的关系显示于图3。从图3中明显看出，通过向底物溶液加入His-Cw1ECTD制备的样品的OD540值在开始测定后立即显著降低。因此，发现His-Cw1ECTD对细胞壁具有很强的溶解活性。相反，通过向底物溶液加入等摩尔量His-Cw1ECTD和His-YoeB制备的样品在开始测定后立即表现出OD540值的降低；然而，获得的曲线比仅加入His-Cw1ECTD制备的样品更加缓和。这表明加入等摩尔量的His-YoeB可以抑制His-Cw1ECTD的活性。在通过以1∶2的摩尔比加入His-Cw1ECTD和His-YoeB制备的样品的情况下，在开始测定后OD540值基本上不会立即降低，并且该值保持在基本上恒定的水平。这表明以两倍于His-Cw1ECTD量的量加入His-YoeB将会抑制基本上100％的His-Cw1ECTD的摩尔活性。
[实施例3]YoeB蛋白质抑制溶解酶活性的作用2
在该实施例中，使用与实施例1相同的方式制备的细胞壁成分作为底物在存在或不存在YoeB蛋白质的情况下测定Cw1S、Cw1O和YddH的C-端活性结构域的细胞壁溶解活性。
<制备Cw1S的C-端活性结构域>
使用BF-YOJL引物(gcgcggatcctcaaacattcaaataggttcg：SEQ ID NO：60)和KR-YOJL引物(gcgcggtaccggtcaatcattgtctggta：SEQ ID NO：61)，并使用从枯草杆菌168菌株提取的基因组DNA作为模板，经PCR扩增与D，L-内肽酶结构域(包括从核苷酸290至终止密码子的区域和类似61-bp转录终止子的序列)对应的Cw1S基因的3′-端DNA序列。上述BF-YOJL和KR-YOJL引物加下划线的核苷酸序列分别表示BamHI和KpnI限制性内切酶识别序列。经PCR扩增后，所得的PCR产物用BamHI和KpnI限制性内切酶消化，获得插入片段。
随后，将pQE30质粒用BamHI和KpnI消化，并将所得物与上述插入片段连接，以构建pQEΔojL质粒。开发pQE30质粒的目的是在大肠杆菌中表达His-标记融合蛋白质。
通过测序，验证插入片段的DNA序列是否已经正确地插入。将经验证已正确插入的pQEΔojL质粒通过感受态法导入大肠杆菌JM109菌株。已插入了pQEΔojL质粒的大肠杆菌M13(pREP4)菌株在下文中称为“M13(pQEΔojL)”。
在37℃下在200ml含有100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml卡那霉素和2％葡萄糖的LB培养基中培养M13(pQEΔojL)。当培养溶液的OD600为1.0时，向培养基中加入IPTG(异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1mM，并额外再培养5小时。培养后，将培养产物离心(8,000rpm，10分钟，4℃)，以收获细胞，并将细胞悬浮在起始(initiation)缓冲液(5ml；含有10mM咪唑的1×磷酸盐缓冲液(pH7.0))中。
随后，对所得物进行超声破碎(开：0.5秒；关：1秒/开：30秒；关：30秒；总计10分钟)，然后离心(12,000rpm，10分钟，4℃)。得到的上清液通过0.45μm的滤器过滤。经过滤提取的h-ΔCw1S蛋白质根据GE Healthcare and Biosciences的常规His-Trap柱纯化技术而纯化。纯化的h-ΔCw1S蛋白质溶液进一步用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)透析，制备h-ΔCw1S蛋白质溶液。
<制备Cw1O的C-端活性结构域>
使用BF-YVCE引物(gcgcggatccgaaggcgcgatcagcgtt：SEQ ID NO：62)和KR-YVCE引物(gcgcggtaccgctcaacacgattaaatgtat：SEQ ID NO：63)，并使用从枯草杆菌168菌株提取的基因组DNA作为模板，经PCR扩增与D，L-内肽酶结构域(包括从核苷酸343到终止密码子的区域和类似84-bp转录终止子的序列)对应的Cw1O基因的3′-端DNA序列。上述BF-YVCE和KR-YVCE引物加下划线的核苷酸序列分别表示BamHI和KpnI限制性内切酶识别序列。
得到的PCR产物用于以与上述<制备Cw1S的C-端活性结构域>中相同的方式制备pQEVCE质粒，并获得其中已经导入pQEVCE的大肠杆菌M13(pQEVCE)。获得的M13(pQEVCE)用于以与上述<制备Cw1S的C-端活性结构域>中相同的方式制备6His-C-Cw1O蛋白质溶液。
<制备YddH的C-端活性结构域>
使用BF-YDDH引物(gcgcggatccgatttctatgaaacggtcatg：SEQ ID NO：64)和KR-YDDH引物(gcgcggtacccactcctagttatttaatgcg：SEQ ID NO：65)，并使用从枯草杆菌168菌株提取的基因组DNA作为模板，经PCR扩增与D，L-内肽酶结构域(包括从核苷酸206到终止密码子的区域和9-bp非翻译区)对应的YddH基因的3′-端DNA序列。上述BF-YDDH和KR-YDDH引物加下划线的核苷酸序列分别表示BamHI和KpnI限制性内切酶识别序列。
得到的PCR产物用于以与上述<制备Cw1S的C-端活性结构域>中相同的方式制备pQEDDH质粒，并获得其中已经导入pQEDDH的大肠杆菌M13(pQEDDH)。获得的M13(pQEDDH)用于以与上述<制备Cw1S的C-端活性结构域>中相同的方式制备6His-C-YddH蛋白质溶液。
<细胞壁溶解活性测定及其结果>
根据实施例2中所述的方法测定细胞壁降解活性。在该实施例中，以h-ΔCw1S、6His-C-Cw1O或6His-C-YddH蛋白质摩尔量的两倍加入His-YoeB蛋白质。Cw1S蛋白质的细胞壁溶解活性的测定结果显示于图4，Cw1O蛋白质的细胞壁溶解活性的测定结果显示于图5，YddH蛋白质的细胞壁溶解活性的测定结果显示于图6。
如图4-6中所示，发现YoeB蛋白质能够抑制诸如Cw1S、Cw1O和YddH蛋白质的溶解酶的细胞壁溶解活性。通过使YoeB蛋白质以两倍于这些酶的摩尔量进行作用，发现溶解酶的细胞壁溶解活性基本上100％得到抑制。
[实施例4]YoeB蛋白质抑制溶解酶活性的作用3
在该实施例中，考察了在缺乏8种类型的分泌性蛋白酶(Δepr/ΔwprA/Δmpr/ΔnprB/Δbpr/ΔnprE/Δvpr/ΔaprE)的枯草杆菌突变体Dpr8中过度表达YoeB蛋白质时的溶解抑制作用。Dpr8菌株缺少8种类型的已知分泌性蛋白酶，因此比野生型菌株更可能发生溶解。
通过以下方式构建Dpr8菌株。用于构建Dpr8菌株的引物列表显示于表2。
表2
用于缺失基因的引物总结于表3。
首先说明用于从野生型枯草杆菌168菌株中缺失epr基因的方法。使用从枯草杆菌168菌株中提取的基因组DNA作为模板，并使用表2所示的eprfw1和eprUpr引物组以及eprDNf和eprrv-rep引物组，制备与epr基因上游区邻近的0.6-kb片段(A)和与基因组epr基因下游区邻近的0.5-kb片段(B)。单独地，将来源于pUB110质粒(Plasmid 15，93，1986)的repU基因(Nucleic Acids Res.，17，4410，1989)的启动子区与来源于pC194质粒的氯霉素抗性基因(J.Bacteriol.150(2)，815，1982)的上游区连接，制备1.2-kb片段(C)。随后，将3种获得的片段(A)、(B)和(C)混合以制备模板，并使用表2所示的eprfw2和Cmrv2引物进行SOE-PCR，以按照(A)、(B)和(C)的顺序将3个片段连接，获得2.2-kb的DNA片段。DNA片段的末端是钝端(blunt-ended)且5′-磷酸化的，并将所得物插入pUC118质粒(MethodsEnzymol.153，3，1987)的SmaI限制性内切酶位点，以构建用于缺失epr基因的pUC118-CmrΔepr质粒。使用0.4-kb片段(D)和0.8-kb片段(E)的混合物作为模板，并使用表2所示的repUfw和Cmrv1引物，经SOE-PCR制备上述1.2-kb片段(C)。具体地，0.4-kb片段(D)含有使用repUfw和repUr-Cm引物组(表2)、并使用pUB110质粒作为模板制备的repU基因启动子区，0.8-kb片段(E)含有使用CmUf-rep和Cmrv1引物组、并使用pC194质粒作为模板制备的氯霉素抗性基因。
随后，通过感受态细胞转化技术将如上所述制备的用于缺失epr基因的pUC118-CmrΔepr质粒导入枯草杆菌168菌株(J.Bacteriol.93，1925，1967)，并使用氯霉素抗性作为指示物(indicator)，经epr基因的相应上游或下游区之间的单交换(single-cross-over)同源重组获得与基因组DNA融合的转化菌株。将得到的转化菌株接种在LB培养基中，在37℃下培养2小时，然后再次进行感受态诱导。由此，在epr基因的基因组的重叠上游或下游区之间诱导同源基因间重组。当在与质粒导入时的区域不用的区域中发生同源基因间重组时，epr基因将会缺失，同时伴随有质粒来源的氯霉素抗性基因和pUC118载体区的脱扣(dropout)。随后，以下列方式进行氨苄青霉素浓集，以增加氯霉素敏感菌株的丰度。将感受态细胞被诱导后的培养溶液接种在1ml含有氯霉素(终浓度：5ppm)和氨苄青霉素钠(终浓度：100ppm)的LB培养基中，至600nm下的浊度(OD600)为0.003。在37℃下培养5小时后，加入10μl 10,000ppm氨苄青霉素钠水溶液，并再进行额外3小时的培养。培养完成后，使用2％的氯化钠水溶液经离心洗涤菌株，将所得物悬浮在1ml 2％的氯化钠水溶液中，并用100μl悬浮液涂布LB琼脂培养基。菌株在37℃下孵育大约15小时，从生长的菌株当中选择由于质粒区脱扣变得对氯霉素敏感的菌株。使用所选择菌株的基因组DNA作为模板，使用表2所示的eprfw2和eprrv-rep引物进行PCR，从而证实了epr基因的缺失。由此，获得epr基因-缺陷菌株。
随后，通过与缺失epr基因相同的方式对得到的epr基因-缺陷菌株进行下一步缺失，即，缺失wprA基因。具体地，以相同的方式构建用于缺失wprA基因的pUC 118-CmrΔwprA质粒，将得到的质粒导入基因组DNA，并通过随后的同源基因组间重组来缺失wprA基因，以获得缺少epr和wprA基因两者的菌株。随后，重复相同的步骤，以相继缺失mpr、nprB、bpr、nprE、vpr和aprE基因，最终构建缺少8种类型蛋白酶基因的8-蛋白酶-缺陷菌株，该菌株被指定为Dpr8菌株。
通过以下方式制备要导入Dpr8菌株的用于过度表达yoeB的pDG148YB质粒。首先，使用用于扩增yoeB基因的yoeBSal-F-2(5’-GCGCAGATCTGTCGACTAAGAGAAAGAGATTTTGAAGG(SEQ ID NO：52))和yoeBSph-R(5’-GCGCGCATGCTTATATAACTGCGTCAAATTG(SEQ ID NO：53))引物，使用野生型枯草杆菌菌株的染色体DNA作为模板，进行PCR扩增。扩增片段(595bp)用SalI和SphI限制性内切酶进行消化。将该片段与同样已用SalI和SphI限制性内切酶消化的pUC118质粒连接，以获得pU8YB。确认了插入片段的核苷酸序列之后，将pU8YB用SalI和SphI限制性内切酶消化。将切割的yoeB基因片段(575bp)与同样已用SalI和SphI限制性内切酶消化的pDG148连接，以获得目的pDG148YB。pDG148是具有被IPTG诱导成进行表达的启动子的多拷贝质粒，其可获自Bacillus Genetic Stock Center。
将如上制备的pDG148YB导入Dpr8菌株，并进行以下实验。在30℃下在LB培养基中进行15小时预培养。向30ml含有7.5％麦芽糖、7.5μg/ml MnSO4和10μg/ml卡那霉素的2×L培养基中加入预培养溶液(600μl)，然后开始主培养。为了诱导yoeB的过度表达，在开始培养后的0、8和20小时，在每种情况下向主培养溶液中加入IPTG，至终浓度为1mM。指定未加入IPTG的样品为对照样品。随着时间的经过测定OD600处培养溶液的浊度，并考察抑制溶解的作用。
结果显示于图7。从图7中明显看出，在开始培养后大约30小时，未加入IPTG的样品开始表现出浊度的降低。即，观察到Dpr8菌株的溶解。然而，在其中加入有IPTG的YoeB蛋白质已过度表达的样品中，开始培养后30小时没有观察到浊度的降低。这证明在其中YoeB蛋白质已过度表达的Dpr8菌株中，溶解受到抑制。
[实施例5]YoeB蛋白质抑制PGA降解的活性
在该实施例中，考察由YoeB基因(SEQ ID NO：1)编码的YoeB蛋白质(SEQ ID NO：2)抑制PGA降解的作用。具体地，使各种类型的溶解酶作用于具有给定范围分子量的PGA，并比较在存在或不存在YoeB蛋白质的情况下PGA的降解(即分子量的降低)。该实施例中使用的各种类型的溶解酶和YoeB蛋白质是实施例2和3中使用的那些。
在该实施例中，使用平均分子量为4,000kDa～6,000kDa的PGA产品(No.168-21413：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。使用1nmol溶解酶和2mg PGA在10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中进行PGA降解反应。当加入YoeB蛋白质时，其加入量为2nmol。反应温度为37℃。经过给定的反应时间后，通过在100℃下煮沸5分钟终止反应。反应终止后，样品在14％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，通过亚甲蓝染色确认PGA的降解。
具体地，对于Cw1E蛋白质，制备组成如表4所示的反应溶液。Cw1E蛋白质的PGA降解活性的考察结果显示于图8。
表4
对于Cw1F蛋白质，制备组成如表5所示的反应溶液。Cw1F蛋白质的PGA降解活性的考察结果显示于图9。
表5
对于Cw1S蛋白质，制备组成如表6所示的反应溶液。Cw1S蛋白质的PGA降解活性的考察结果显示于图10。
表6
对于Cw1O蛋白质，制备组成如表7所示的反应溶液。Cw1O蛋白质的PGA降解活性的考察结果显示于图11。
表7
在图9中，第1道代表1号样品的反应溶液，第2-5道分别代表已经进行了0.5小时、1.0小时、2.0小时和4.0小时反应的样品2的反应溶液，第6-10道分别代表已经进行了0小时、0.5小时、1.0小时、2.0小时和4.0小时反应的3号样品的反应溶液。在图10和11中，第1道代表1号样品的反应溶液，第2-6道分别代表已经进行了0.5小时、1.0小时、2.0小时、4.0小时和6.0小时反应的2号样品的反应溶液，第7-12道分别代表已经进行了0小时、0.5小时、1.0小时、2.0小时、4.0小时和6.0小时反应的3号样品的反应溶液。
从图9-11中明显看出，在不存在YoeB蛋白质的情况下，Cw1E、Cw1F、Cw1S和Cw1O蛋白质具有完全降解PGA并减小其分子量的活性。另外，发现在YoeB蛋白质的存在下，Cw1E、Cw1F、Cw1S和Cw1O蛋白质的PGA降解活性受到抑制，并发现PGA保持着未被降解的给定分子量范围。该实施例证明，YoeB蛋白质具有抑制溶解酶的PGA降解活性的新作用。
为进行比较，考察已知不具有细胞壁溶解活性但具有PGA降解活性的YwtD蛋白质是否会表现出被YoeB蛋白质抑制PGA降解的作用。YwtD基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：66，YwtD蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：67。
以与实施例3的<制备Cw1S的C-端活性结构域>相同的方式获得YwtD蛋白质。具体地，使用YwtD-FL-Fw引物(gcgcggtaccgatacatcatcagaattgatt：SEQ ID NO：68)和YwtD-FL-Rv引物(gcgcctgcagttattgcacccgtatacttc：SEQ ID NO：69)，并使用从枯草杆菌168菌株提取的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增含有D，L-内肽酶结构域的YwtD基因的DNA序列。上述YwtD-FL-Fw和YwtD-FL-Rv引物加下划线的核苷酸序列分别表示KpnI和PstI限制性内切酶识别序列。
使用得到的PCR产物以与上述<制备Cw1S的C-端活性结构域>相同的方式制备pQEYwtD质粒，并获得已经导入pQEYwtD的大肠杆菌M13(pREP4，pQEYwtD)。使用获得的M13(pREP4，pQEYwtD)以与上述<制备Cw1S的C-端活性结构域>相同的方式制备h-YwtD蛋白质溶液。通过与上文所述相同的方式制备组成如表8所示的反应溶液，使用得到的YwtD蛋白质进行PGA降解反应。
表8
结果显示于图12。在图12中，第1道代表1号样品的反应溶液，第2-5道分别代表已经进行了0.5小时、1.0小时、2.0小时和4.0小时反应的2号样品的反应溶液，第6-10道分别代表已经进行了0小时、0.5小时、1.0小时、2.0小时和4.0小时反应的3号样品的反应溶液。从图12中明显看出，在存在YoeB蛋白质和不存在YoeB蛋白质的情况下，YwtD蛋白质的PGA降解活性没有差异。具体地，发现YoeB蛋白质不抑制YwtD蛋白质的PGA降解活性。
由此证明，YoeB蛋白质抑制具有细胞壁溶解活性的溶解酶的PGA降解活性，但不抑制不具有细胞壁溶解活性的PGA降解酶的PGA降解活性。
工业应用性
本发明可以提供能够有效抑制诸如枯草杆菌来源的溶解酶的活性的新型溶解酶抑制剂，以及能够抑制诸如枯草杆菌溶解的溶解抑制剂。具体地，本发明的溶解酶抑制剂可以抑制各种类型溶解酶的溶解活性，上述溶解酶包括枯草杆菌来源的溶解酶。另外，本发明的溶解抑制剂可以抑制各种类型的微生物包括枯草杆菌的溶解。
另外，本发明可以提供表现出抑制由溶解酶引起的溶解的微生物。使用本发明的微生物作为诸如用于物质生产的宿主，由于其溶解受到抑制，因此这些物质的生产率可以得到提高。
此外，本发明可以提供抑制由溶解酶引起的PGA降解的PGA降解抑制剂。另外，本发明可以提供产生分子量高于野生型菌株的PGA的方法。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请全部并入本文作为参考。
序列表
<110>花王株式会社
国立大学法人信州大学
<120>溶解酶抑制剂和溶菌作用被抑制的微生物
<130>PH-3252-PCT
<150>JP 2006-281768
<151>2006-10-16
<160>69
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>546
<212>DNA
<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(546)
<400>1
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Met Lys Lys Cys Leu Leu Phe Leu Thr Thr Ile Ala Leu Ile Leu Ser
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tta agc aca aat gca ttt gcg aaa aat aca tca ggc gat tta tca caa 96
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aaa caa gca tta cag ttg gca tta tcc gct aga gaa cat ttt tgg aac 144
Lys Gln Ala Leu Gln Leu Ala Leu Ser Ala Arg Glu His Phe Trp Asn
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acc atg agc ggc cac aat ccg aag gtg aaa aaa gca gtt tgc cca tca 192
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50 55 60
ggc aca ttc gag tat caa aat ctt caa tat gta tac atg tgc agt gat 240
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cta ggc act aaa gca aaa gcg gtg aat tat tta act cct att ttt aca 288
Leu Gly Thr Lys Ala Lys Ala Val Asn Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Thr
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aaa aca gca atc gaa aaa ggc ttt aaa gat tat cat ttc act gtt tca 336
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aca tac gaa ttt act gtc cct aca tta gac gga tcc cct tct gca aaa 480
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aca act tta gta gtg aca cca gct gaa gca gca acg att aag gtc aaa 96
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aaa agc gga gat tca ctt tgg ctg atc gca aat gag ttt aaa atg acg 336
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gtg cag gaa ctg aaa aaa tta aac gga cta agc agc gat tta att cgt 384
Val Gln Glu Leu Lys Lys Leu Asn Gly Leu Ser Ser Asp Leu Ile Arg
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gct ggg cag aaa tta aag gtg tcc ggt act gtt tct tca agc tct agt 432
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tcc agt aaa aaa agc aac tct aat aag agt tca agc tcc agt tca aaa 480
Ser Ser Lys Lys Ser Asn Ser Asn Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys
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agc agt tct aat aag agt tca agt tct tca tct tct acg gga aca tat 528
Ser Ser Ser Asn Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Gly Thr Tyr
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aag gtg cag ctt gga gat tca ctt tgg aaa att gca aac aaa gtc aat 576
Lys Val Gln Leu Gly Asp Ser Leu Trp Lys Ile Ala Asn Lys Val Asn
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atg tcc atc gct gaa ttg aag gtc ttg aac aac tta aaa tca gac acc 624
Met Ser Ile Ala Glu Leu Lys Val Leu Asn Asn Leu Lys Ser Asp Thr
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att tac gtg aat cag gtg ttg aaa aca aaa tca agc ggc tct gat acg 672
Ile Tyr Val Asn Gln Val Leu Lys Thr Lys Ser Ser Gly Ser Asp Thr
210 215 220
tct tct aaa gac aat tca tcc aaa tcg aac caa act tca gca aca act 720
Ser Ser Lys Asp Asn Ser Ser Lys Ser Asn Gln Thr Ser Ala Thr Thr
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aaa tat acc gtt aaa agc ggt gat tca ctt tgg aaa atc gca aac aac 768
Lys Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Ser Leu Trp Lys Ile Ala Asn Asn
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tat aac ctg act gta cag caa atc cga aat atc aac aat ctg aaa tca 816
Tyr Asn Leu Thr Val Gln Gln Ile Arg Asn Ile Asn Asn Leu Lys Ser
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gat gtg ctt tac gtt gga caa gta ttg aag ctg aca ggt aaa gca tct 864
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acg acg act aca tac acg gtg aaa agc ggt gat tcc tta tgg gtg att 960
Thr Thr Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Ser Leu Trp Val Ile
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<223>作为PCR引物wprAUPr的寡核苷酸
<400>18
cttttgcttc ccacaaccga gctgaatttt ctg 33
<210>19
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物wprADNf的寡核苷酸
<400>19
ctcggttgtg ggaagcaaaa gttgttgttg aaaa 34
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物wprArv-repU的寡核苷酸
<400>20
ctgatctcga cttcgttcat cctcattgaa gacggcatc 39
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物wprAfw2的寡核苷酸
<400>21
ggaacatata tgacacacct 20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物mprfw1的寡核苷酸
<400>22
tgtttggtgt tgagctgtt 19
<210>23
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物mprUPr的寡核苷酸
<400>23
ttcgtgtgaa tccattgttt tctgaatctt ggaa 34
<210>24
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物mprDNf的寡核苷酸
<400>24
gaaaacaatg gattcacacg aacggaggat cgt 33
<210>25
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物mprrv-repU的寡核苷酸
<400>25
ctgatctcga cttcgttcct cgtaagaaaa aatacctatt tc 42
<210>26
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物mprfw2的寡核苷酸
<400>26
ccttgcgaaa gatagggta 19
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprBfw1的寡核苷酸
<400>27
tttttagcag tggtgctc 18
<210>28
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprBUPr的寡核苷酸
<400>28
catacgcctt cagtaataga gatgtcttgg tc 32
<210>29
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprBDNf的寡核苷酸
<400>29
ctctattact gaaggcgtat gaggctgtcg gc 32
<210>30
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprBrv-repU的寡核苷酸
<400>30
ctgatctcga cttcgttctt ccaaatgcgc ttcattagga 40
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprBfw2的寡核苷酸
<400>31
cttttgagcc cgttcctc 18
<210>32
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物bprfw1的寡核苷酸
<400>32
tgagattgtg gtgacagtg 19
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物bprUPr的寡核苷酸
<400>33
ttaagttttc cgctgatgag tctgtttttc gtt 33
<210>34
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物bprDNf的寡核苷酸
<400>34
gactcatcag cggaaaactt aatatgaaca cagaa 35
<210>35
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物bprrv-repU的寡核苷酸
<400>35
ctgatctcga cttcgttcgt aatcatgaca ccgttttgaa c 41
<210>36
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物bprfw2的寡核苷酸
<400>36
attgcaaccg gctttatcg 19
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprEfw1的寡核苷酸
<400>37
ttttgaagac gttcggcga 19
<210>38
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprEUPr的寡核苷酸
<400>38
attgtctgtt gctgaagcag cctggaatgc tgtt 34
<210>39
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprEDNf的寡核苷酸
<400>39
caggctgctt cagcaacaga caatttctta ccta 34
<210>40
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprErv-repU的寡核苷酸
<400>40
ctgatctcga cttcgttccc tctcttaagt aagcgctg 38
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物nprEfw2的寡核苷酸
<400>41
tctctttgtt gaaaaacgat a 21
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物vprfw1的寡核苷酸
<400>42
aaaaacatcc ctccgcttc 19
<210>43
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物vprUPr的寡核苷酸
<400>43
tcttcggtca atacaagcag aaagcgaatg at 32
<210>44
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物vprDNf的寡核苷酸
<400>44
tctgcttgta ttgaccgaag aacctttcac tg 32
<210>45
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物vprrv-repU的寡核苷酸
<400>45
ctgatctcga cttcgttctg ctcggctcat ctggagaaa 39
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物vprfw2的寡核苷酸
<400>46
tttttggcag gcagcctt 18
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物aprEfw1的寡核苷酸
<400>47
ctgtttatta tgggccacga a 21
<210>48
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物aprEUPr的寡核苷酸
<400>48
gatcagcttg gggttaatca acgtacaagc ag 32
<210>49
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物aprEDNf的寡核苷酸
<400>49
tgattaaccc caagctgatc cacaattttt tgc 33
<210>50
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物aprErv-repu的寡核苷酸
<400>50
ctgatctcga cttcgttctg attttccaaa cgagctttc 39
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物aprEfw2的寡核苷酸
<400>51
atgggccatt atgtcatgaa g 21
<210>52
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物yoeBSal-F-2的寡核苷酸
<400>52
gcgcagatct gtcgactaag agaaagagat tttgaagg 38
<210>53
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物yoeBSph-R的寡核苷酸
<400>53
gcgcgcatgc ttatataact gcgtcaaatt g 31
<210>54
<211>1245
<212>DNA
<213>枯草杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1245)
<400>54
atg aaa aag aag att gta gcc ggc ttg gct gtt tct gca gtt gtt ggg 48
Met Lys Lys Lys Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Ser Ala Val Val Gly
1 5 10 15
tcg tcg atg gcc gca gca ccc gcg gaa gca aaa acg ata aaa gta aaa 96
Ser Ser Met Ala Ala Ala Pro Ala Glu Ala Lys Thr Ile Lys Val Lys
20 25 30
agc ggt gac tct ctt tgg aaa ctt tcc cgc cag tat gat acg aca ata 144
Ser Gly Asp Ser Leu Trp Lys Leu Ser Arg Gln Tyr Asp Thr Thr Ile
35 40 45
tca gct ctg aaa tcc gaa aac aaa ttg aaa tca acg gtg ctt tat gtc 192
Ser Ala Leu Lys Ser Glu Asn Lys Leu Lys Ser Thr Val Leu Tyr Val
50 55 60
gga caa agt ctt aag gtt cct gaa agc agc aaa aaa agc acg aca tcc 240
Gly Gln Ser Leu Lys Val Pro Glu Ser Ser Lys Lys Ser Thr Thr Ser
65 70 75 80
cca tct aat tca agc aaa aca tca aca tac aca gtt gca tat ggt gat 288
Pro Ser Asn Ser Ser Lys Thr Ser Thr Tyr Thr Val Ala Tyr Gly Asp
85 90 95
tcc cta tgg atg att gct aaa aat cat aaa atg agt gtt tct gag ctt 336
Ser Leu Trp Met Ile Ala Lys Asn His Lys Met Ser Val Ser Glu Leu
100 105 110
aaa agc tta aac agc ctg agc agt gac ctg att cgt ccg ggg caa aag 384
Lys Ser Leu Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Ile Arg Pro Gly Gln Lys
115 120 125
ctt aag atc aaa ggg aca agc agt tca agc gga tca aat gga tca aag 432
Leu Lys Ile Lys Gly Thr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asn Gly Ser Lys
130 135 140
aaa aac agc ggt tcc aat tct tca ggt tct tca aaa agt aca tat acg 480
Lys Asn Ser Gly Ser Asn Ser Ser Gly Ser Ser Lys Ser Thr Tyr Thr
145 150 155 160
gtc aag ctt ggt gac tca ctg tgg aaa atc gca aac agc tta aat atg 528
Val Lys Leu Gly Asp Ser Leu Trp Lys Ile Ala Asn Ser Leu Asn Met
165 170 175
act gta gcc gaa tta aaa acc tta aat ggc tta aca tca gat aca ctt 576
Thr Val Ala Glu Leu Lys Thr Leu Asn Gly Leu Thr Ser Asp Thr Leu
180 185 190
tat cct aaa cag gtg ctc aaa ata aaa gga agc agt tca cct aag aac 624
Tyr Pro Lys Gln Val Leu Lys Ile Lys Gly Ser Ser Ser Pro Lys Asn
195 200 205
gga aac agc ggt tcc aaa aag ccg tca aac tcc aat ccc tca aaa aca 672
Gly Asn Ser Gly Ser Lys Lys Pro Ser Asn Ser Asn Pro Ser Lys Thr
210 215 220
acg acg tac aag gta aaa gca ggc gat tcg ctg tgg aaa att gca aat 720
Thr Thr Tyr Lys Val Lys Ala Gly Asp Ser Leu Trp Lys Ile Ala Asn
225 230 235 240
cgg ctc gga gtc act gtc caa agc atc cgt gat aaa aac aat tta tca 768
Arg Leu Gly Val Thr Val Gln Ser Ile Arg Asp Lys Asn Asn Leu Ser
245 250 255
tcg gat gtg ttg caa atc ggg cag gtt ctg act att tcg gga gca tca 8l6
Ser Asp Val Leu Gln Ile Gly Gln Val Leu Thr Ile Ser Gly Ala Ser
260 265 270
aaa tct aat cct tca aat ccg aca aag cca aca aag cca aaa gat aac 864
Lys Ser Asn Pro Ser Asn Pro Thr Lys Pro Thr Lys Pro Lys Asp Asn
275 280 285
tca ggg tca aac att caa ata ggt tcg aag att gac aga atg ata acg 912
Ser Gly Ser Asn Ile Gln Ile Gly Ser Lys Ile Asp Arg Met Ile Thr
290 295 300
gaa gcg aaa aaa tat gtc gga gtg cct tac cga tgg ggc gga aac acg 960
Glu Ala Lys Lys Tyr Val Gly Val Pro Tyr Arg Trp Gly Gly Asn Thr
305 310 315 320
cct gcc ggt ttt gat tgc agc ggc ttc att tat tac ctc att aat aat 1008
Pro Ala Gly Phe Asp Cys Ser Gly Phe Ile Tyr Tyr Leu Ile Asn Asn
325 330 335
gta tca tct ata tca aga ttg agt acg gca ggg tat tgg aat gtc atg 1056
Val Ser Ser Ile Ser Arg Leu Ser Thr Ala Gly Tyr Trp Asn Val Met
340 345 350
cag aaa gtc agc cag ccg tca gta gga gac ttt gtc ttc ttt acc aca 1104
Gln Lys Val Ser Gln Pro Ser Val Gly Asp Phe Val Phe Phe Thr Thr
355 360 365
tat aaa tcc ggc ccg tct cac atg ggg att tat cta ggc ggc ggt gat 1152
Tyr Lys Ser Gly Pro Ser His Met Gly Ile Tyr Leu Gly Gly Gly Asp
370 375 380
ttt att cat gca agc tca tcg ggc gtc gac att tcc aat ctc agc aat 1200
Phe Ile His Ala Ser Ser Ser Gly Val Asp Ile Ser Asn Leu Ser Asn
385 390 395 400
tcg tat tgg aaa cag cgg tac ttg ggc gca aga agt tat ttt taa 1245
Ser Tyr Trp Lys Gln Arg Tyr Leu Gly Ala Arg Ser Tyr Phe
405 410
<210>55
<211>414
<212>PRT
<213>枯草杆菌
<400>55
Met Lys Lys Lys Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Ser Ala Val Val Gly
1 5 10 15
Ser Ser Met Ala Ala Ala Pro Ala Glu Ala Lys Thr Ile Lys Val Lys
20 25 30
Ser Gly Asp Ser Leu Trp Lys Leu Ser Arg Gln Tyr Asp Thr Thr Ile
35 40 45
Ser Ala Leu Lys Ser Glu Asn Lys Leu Lys Ser Thr Val Leu Tyr Val
50 55 60
Gly Gln Ser Leu Lys Val Pro Glu Ser Ser Lys Lys Ser Thr Thr Ser
65 70 75 80
Pro Ser Asn Ser Ser Lys Thr Ser Thr Tyr Thr Val Ala Tyr Gly Asp
85 90 95
Ser Leu Trp Met Ile Ala Lys Asn His Lys Met Ser Val Ser Glu Leu
100 105 110
Lys Ser Leu Asn Ser Leu Ser Ser Asp Leu Ile Arg Pro Gly Gln Lys
115 120 125
Leu Lys Ile Lys Gly Thr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asn Gly Ser Lys
130 135 140
Lys Asn Ser Gly Ser Asn Ser Ser Gly Ser Ser Lys Ser Thr Tyr Thr
145 150 155 160
Val Lys Leu Gly Asp Ser Leu Trp Lys Ile Ala Asn Ser Leu Asn Met
165 170 175
Thr Val Ala Glu Leu Lys Thr Leu Asn Gly Leu Thr Ser Asp Thr Leu
180 185 190
Tyr Pro Lys Gln Val Leu Lys Ile Lys Gly Ser Ser Ser Pro Lys Asn
195 200 205
Gly Asn Ser Gly Ser Lys Lys Pro Ser Asn Ser Asn Pro Ser Lys Thr
210 215 220
Thr Thr Tyr Lys Val Lys Ala Gly Asp Ser Leu Trp Lys Ile Ala Asn
225 230 235 240
Arg Leu Gly Val Thr Val Gln Ser Ile Arg Asp Lys Asn Asn Leu Ser
245 250 255
Ser Asp Val Leu Gln Ile Gly Gln Val Leu Thr Ile Ser Gly Ala Ser
260 265 270
Lys Ser Asn Pro Ser Asn Pro Thr Lys Pro Thr Lys Pro Lys Asp Asn
275 280 285
Ser Gly Ser Asn Ile Gln Ile Gly Ser Lys Ile Asp Arg Met Ile Thr
290 295 300
Glu Ala Lys Lys Tyr Val Gly Val Pro Tyr Arg Trp Gly Gly Asn Thr
305 310 315 320
Pro Ala Gly Phe Asp Cys Ser Gly Phe Ile Tyr Tyr Leu Ile Asn Asn
325 330 335
Val Ser Ser Ile Ser Arg Leu Ser Thr Ala Gly Tyr Trp Asn Val Met
340 345 350
Gln Lys Val Ser Gln Pro Ser Val Gly Asp Phe Val Phe Phe Thr Thr
355 360 365
Tyr Lys Ser Gly Pro Ser His Met Gly Ile Tyr Leu Gly Gly Gly Asp
370 375 380
Phe Ile His Ala Ser Ser Ser Gly Val Asp Ile Ser Asn Leu Ser Asn
385 390 395 400
Ser Tyr Trp Lys Gln Arg Tyr Leu Gly Ala Arg Ser Tyr Phe
405 410
<210>56
<211>1422
<212>DNA
<213>枯草杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1422)
<400>56
gtg aga aag agt tta att aca ctt ggt ttg gct tcc gtc atc ggg aca 48
Val Arg Lys Ser Leu Ile Thr Leu Gly Leu Ala Ser Val Ile Gly Thr
1 5 10 15
agc agt ttt ttg atc cca ttt aca agt aaa act gca tcg gcg gaa aca 96
Ser Ser Phe Leu Ile Pro Phe Thr Ser Lys Thr Ala Ser Ala Glu Thr
20 25 30
tta gat gaa aag aaa caa aaa atc gaa agc aag caa tct gag gtt gct 144
Leu Asp Glu Lys Lys Gln Lys Ile Glu Ser Lys Gln Ser Glu Val Ala
35 40 45
tcc agc att gaa gcg aag gaa aaa gaa tta acc gag ctt cag gaa aat 192
Ser Ser Ile Glu Ala Lys Glu Lys Glu Leu Thr Glu Leu Gln Glu Asn
50 55 60
caa tca aag att gaa aaa gaa ctg aaa gac att aac gat aag gcg ctt 240
Gln Ser Lys Ile Glu Lys Glu Leu Lys Asp Ile Asn Asp Lys Ala Leu
65 70 75 80
gat aca agc aac aag att gaa gat aaa aaa gaa gaa aac gat aaa aca 288
Asp Thr Ser Asn Lys Ile Glu Asp Lys Lys Glu Glu Asn Asp Lys Thr
85 90 95
aaa gaa gaa atc aaa aaa ctg aaa aaa gag att aaa gaa act gaa gca 336
Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Lys Lys Glu Ile Lys Glu Thr Glu Ala
100 105 110
cgc atc gaa aaa cgc aat gaa atc ctg aaa aaa cgc gtt cgt tct tta 384
Arg Ile Glu Lys Arg Asn Glu Ile Leu Lys Lys Arg Val Arg Ser Leu
115 120 125
cag gaa agc ggc gga tct caa gga tac ata gat gtt ctt tta gga tca 432
Gln Glu Ser Gly Gly Ser Gln Gly Tyr Ile Asp Val Leu Leu Gly Ser
130 135 140
aca agc ttt ggt gac ttt atc tct cgt gcg act gcg gtt tca tct att 480
Thr Ser Phe Gly Asp Phe Ile Ser Arg Ala Thr Ala Val Ser Ser Ile
145 150 155 160
gtg gac gca gac aaa gat tta atc aaa cag caa gag cag gat aaa gcg 528
Val Asp Ala Asp Lys Asp Leu Ile Lys Gln Gln Glu Gln Asp Lys Ala
165 170 175
aag ctc gaa gat tct gaa gcg gat ttg aat gac aag ctg aaa gaa gtt 576
Lys Leu Glu Asp Ser Glu Ala Asp Leu Asn Asp Lys Leu Lys Glu Val
180 185 190
caa gct gcc ttg gct aaa tta gaa aca atg caa aaa gac ctt gat aaa 624
Gln Ala Ala Leu Ala Lys Leu Glu Thr Met Gln Lys Asp Leu Asp Lys
195 200 205
cag ctt aat gaa aaa gac aag ctt ttc gac gaa gca aaa gca agc caa 672
Gln Leu Asn Glu Lys Asp Lys Leu Phe Asp Glu Ala Lys Ala Ser Gln
210 215 220
aag aaa acg gct aaa gcg att tct gaa tta aaa tca gag gcg tct gaa 720
Lys Lys Thr Ala Lys Ala Ile Ser Glu Leu Lys Ser Glu Ala Ser Glu
225 230 235 240
ctt gca aat caa aaa gca aat act gaa gct gaa caa gca cgc atc aaa 768
Leu Ala Asn Gln Lys Ala Asn Thr Glu Ala Glu Gln Ala Arg Ile Lys
245 250 255
aaa gaa caa gaa gca gcg gct gct ttg atc aaa aag cag gaa gaa gca 816
Lys Glu Gln Glu Ala Ala Ala Ala Leu Ile Lys Lys Gln Glu Glu Ala
260 265 270
caa aaa gca tct gat gaa aca caa aca gat gac agt caa acg gcg aca 864
Gln Lys Ala Ser Asp Glu Thr Gln Thr Asp Asp Ser Gln Thr Ala Thr
275 280 285
act gaa tca tca aaa gca agc tca tct gat gat tct tca gac aat tct 912
Thr Glu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Ser Asp Asp Ser Ser Asp Asn Ser
290 295 300
tca gac aat tct tct aac ggt tca tca aac agt tcg tca aac ggc tca 960
Ser Asp Asn Ser Ser Asn Gly Ser Ser Asn Ser Ser Ser Asn Gly Ser
305 310 315 320
tct tct aag aag agc agc ggc tca aac agc aat tca ggc ggc act gtt 1008
Ser Ser Lys Lys Ser Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ser Gly Gly Thr Val
325 330 335
atc agc aac tct ggc gga att gaa ggc gcg atc agc gtt ggt tca agc 1056
Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ile Glu Gly Ala Ile Ser Val Gly Ser Ser
340 345 350
att gta gga caa tct ccg tac aag ttt ggc ggc gga cgc act cag tct 1104
Ile Val Gly Gln Ser Pro Tyr Lys Phe Gly Gly Gly Arg Thr Gln Ser
355 360 365
gat atc aac aac cgt att ttt gac tgc tca tca ttc gta cgc tgg gca 1152
Asp Ile Asn Asn Arg Ile Phe Asp Cys Ser Ser Phe Val Arg Trp Ala
370 375 380
tac gct tct gca ggt gtt aac ctt gga cct gta ggc gga aca aca act 1200
Tyr Ala Ser Ala Gly Val Asn Leu Gly Pro Val Gly Gly Thr Thr Thr
385 390 395 400
gat acg tta gtt ggc aga gga caa gct gtc agc gcg tct gaa atg aaa 1248
Asp Thr Leu Val Gly Arg Gly Gln Ala Val Ser Ala Ser Glu Met Lys
405 410 415
cgc gga gac ctt gtg ttc ttt gac act tac aaa aca aat gga cac gta 1296
Arg Gly Asp Leu Val Phe Phe Asp Thr Tyr Lys Thr Asn Gly His Val
420 425 430
gga atc tac tta gga aac ggt act ttc cta aac gac aat aca tct cat 1344
Gly Ile Tyr Leu Gly Asn Gly Thr Phe Leu Asn Asp Asn Thr Ser His
435 440 445
ggc gta tct gtt gac tct atg agc aat cct tac tgg aaa gca gca ttt 1392
Gly Val Ser Val Asp Ser Met Ser Asn Pro Tyr Trp Lys Ala Ala Phe
450 455 460
aaa ggt gtt gta aga cgt gtt gtt caa taa 1422
Lys Gly Val Val Arg Arg Val Val Gln
465 470
<210>57
<211>473
<212>PRT
<213>枯草杆菌
<400>57
Val Arg Lys Ser Leu Ile Thr Leu Gly Leu Ala Ser Val Ile Gly Thr
1 5 10 15
Ser Ser Phe Leu Ile Pro Phe Thr Ser Lys Thr Ala Ser Ala Glu Thr
20 25 30
Leu Asp Glu Lys Lys Gln Lys Ile Glu Ser Lys Gln Ser Glu Val Ala
35 40 45
Ser Ser Ile Glu Ala Lys Glu Lys Glu Leu Thr Glu Leu Gln Glu Asn
50 55 60
Gln Ser Lys Ile Glu Lys Glu Leu Lys Asp Ile Asn Asp Lys Ala Leu
65 70 75 80
Asp Thr Ser Asn Lys Ile Glu Asp Lys Lys Glu Glu Asn Asp Lys Thr
85 90 95
Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Lys Lys Glu Ile Lys Glu Thr Glu Ala
100 105 110
Arg Ile Glu Lys Arg Asn Glu Ile Leu Lys Lys Arg Val Arg Ser Leu
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Gly Ser Gln Gly Tyr Ile Asp Val Leu Leu Gly Ser
130 135 140
Thr Ser Phe Gly Asp Phe Ile Ser Arg Ala Thr Ala Val Ser Ser Ile
145 150 155 160
Val Asp Ala Asp Lys Asp Leu Ile Lys Gln Gln Glu Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Lys Leu Glu Asp Ser Glu Ala Asp Leu Asn Asp Lys Leu Lys Glu Val
180 185 190
Gln Ala Ala Leu Ala Lys Leu Glu Thr Met Gln Lys Asp Leu Asp Lys
195 200 205
Gln Leu Asn Glu Lys Asp Lys Leu Phe Asp Glu Ala Lys Ala Ser Gln
210 215 220
Lys Lys Thr Ala Lys Ala Ile Ser Glu Leu Lys Ser Glu Ala Ser Glu
225 230 235 240
Leu Ala Asn Gln Lys Ala Asn Thr Glu Ala Glu Gln Ala Arg Ile Lys
245 250 255
Lys Glu Gln Glu Ala Ala Ala Ala Leu Ile Lys Lys Gln Glu Glu Ala
260 265 270
Gln Lys Ala Ser Asp Glu Thr Gln Thr Asp Asp Ser Gln Thr Ala Thr
275 280 285
Thr Glu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Ser Asp Asp Ser Ser Asp Asn Ser
290 295 300
Ser Asp Asn Ser Ser Asn Gly Ser Ser Asn Ser Ser Ser Asn Gly Ser
305 310 315 320
Ser Ser Lys Lys Ser Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ser Gly Gly Thr Val
325 330 335
Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ile Glu Gly Ala Ile Ser Val Gly Ser Ser
340 345 350
Ile Val Gly Gln Ser Pro Tyr Lys Phe Gly Gly Gly Arg Thr Gln Ser
355 360 365
Asp Ile Asn Asn Arg Ile Phe Asp Cys Ser Ser Phe Val Arg Trp Ala
370 375 380
Tyr Ala Ser Ala Gly Val Asn Leu Gly Pro Val Gly Gly Thr Thr Thr
385 390 395 400
Asp Thr Leu Val Gly Arg Gly Gln Ala Val Ser Ala Ser Glu Met Lys
405 410 415
Arg Gly Asp Leu Val Phe Phe Asp Thr Tyr Lys Thr Asn Gly His Val
420 425 430
Gly Ile Tyr Leu Gly Asn Gly Thr Phe Leu Asn Asp Asn Thr Ser His
435 440 445
Gly Val Ser Val Asp Ser Met Ser Asn Pro Tyr Trp Lys Ala Ala Phe
450 455 460
Lys Gly Val Val Arg Arg Val Val Gln
465 470
<210>58
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<212>DNA
<213>枯草杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(990)
<400>58
atg ata agt aaa aag gta gtt ctt cct ttg gta ttc tcg gct cct ttt 48
Met Ile Ser Lys Lys Val Val Leu Pro Leu Val Phe Ser Ala Pro Phe
1 5 10 15
atc ttc ttt ttt gtt tta tgt atc gta gtg gtt atg acg att tca aga 96
Ile Phe Phe Phe Val Leu Cys Ile Val Val Val Met Thr Ile Ser Arg
20 25 30
gaa aat caa gtc ggg gac gat ttt ata ggc ggc ggg gat ggc gaa tat 144
Glu Asn Gln Val Gly Asp Asp Phe Ile Gly Gly Gly Asp Gly Glu Tyr
35 40 45
gaa aca gtt gga att gcg ccg gaa gtg gaa cga ttt aga gca gta ttt 192
Glu Thr Val Gly Ile Ala Pro Glu Val Glu Arg Phe Arg Ala Val Phe
50 55 60
gag aaa tat gcc cgt caa gaa ggc gtt ttt gac caa gtg aat att att 240
Glu Lys Tyr Ala Arg Gln Glu Gly Val Phe Asp Gln Val Asn Ile Ile
65 70 75 80
atg gcg ctc acc atg caa gaa agt ggt ggg cgt tct tta gat atc atg 288
Met Ala Leu Thr Met Gln Glu Ser Gly Gly Arg Ser Leu Asp Ile Met
85 90 95
caa agt tcc gaa agt atc ggc tta cct ccc aac tcc ata act gac cca 336
Gln Ser Ser Glu Ser Ile Gly Leu Pro Pro Asn Ser Ile Thr Asp Pro
100 105 110
gaa cgt tca att gaa gtc ggc att aaa cat ttt aag aag gtt ttt aaa 384
Glu Arg Ser Ile Glu Val Gly Ile Lys His Phe Lys Lys Val Phe Lys
115 120 125
cag gct ggc ggt gat gtt cgt tta acc tta cag gca tac aac ttt ggt 432
Gln Ala Gly Gly Asp Val Arg Leu Thr Leu Gln Ala Tyr Asn Phe Gly
130 135 140
tct gga ttt ata gac tat gtc aaa aag aat ggc ggg aaa tac aca aag 480
Ser Gly Phe Ile Asp Tyr Val Lys Lys Asn Gly Gly Lys Tyr Thr Lys
145 150 155 160
aaa tta gca ctt gat ttc agc cga ttg caa gct ttt aaa atg ggc tgg 528
Lys Leu Ala Leu Asp Phe Ser Arg Leu Gln Ala Phe Lys Met Gly Trp
165 170 175
aaa agc tac ggt gac cca agt tat gtt gac cat gtc atg agg tat gtg 576
Lys Ser Tyr Gly Asp Pro Ser Tyr Val Asp His Val Met Arg Tyr Val
180 185 190
aaa ggc tct gat aaa aat gtg aag cct gtg aaa ggc tct atg gat ttc 624
Lys Gly Ser Asp Lys Asn Val Lys Pro Val Lys Gly Ser Met Asp Phe
195 200 205
tat gaa acg gtc atg aaa gaa gct ttg aaa tat gaa ggg caa ccg tat 672
Tyr Glu Thr Val Met Lys Glu Ala Leu Lys Tyr Glu Gly Gln Pro Tyr
210 215 220
gcc tgg gga ggt tca aac ccg gaa act gga ttt gat tgt tct ggc ctt 720
Ala Trp Gly Gly Ser Asn Pro Glu Thr Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu
225 230 235 240
gtt cag tgg tct ttt gcg aaa gct gga atc act ctt cct aga aca gca 768
Val Gln Trp Ser Phe Ala Lys Ala Gly Ile Thr Leu Pro Arg Thr Ala
245 250 255
caa gaa caa cat ggg gca acc aag aaa ata agt gaa aaa gaa gcg act 816
Gln Glu Gln His Gly Ala Thr Lys Lys Ile Ser Glu Lys Glu Ala Thr
260 265 270
gcg ggt gac tta gtg ttc ttt ggc ggc aca tac gaa gga aaa gcc att 864
Ala Gly Asp Leu Val Phe Phe Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Lys Ala Ile
275 280 285
act cac gtc ggc atc tat gta ggc aat ggc aga atg ttt aat tca aat 912
Thr His Val Gly Ile Tyr Val Gly Asn Gly Arg Met Phe Asn Ser Asn
290 295 300
gac agt gga atc caa tat tct gat ctg aaa tca ggt tac tgg aga gat 960
Asp Ser Gly Ile Gln Tyr Ser Asp Leu Lys Ser Gly Tyr Trp Arg Asp
305 310 315 320
cac ctt gta tct ttt gga cgc att aaa taa 990
His Leu Val Ser Phe Gly Arg Ile Lys
325
<210>59
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<212>PRT
<213>枯草杆菌
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Met Ile Ser Lys Lys Val Val Leu Pro Leu Val Phe Ser Ala Pro Phe
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Ile Phe Phe Phe Val Leu Cys Ile Val Val Val Met Thr Ile Ser Arg
20 25 30
Glu Asn Gln Val Gly Asp Asp Phe Ile Gly Gly Gly Asp Gly Glu Tyr
35 40 45
Glu Thr Val Gly Ile Ala Pro Glu Val Glu Arg Phe Arg Ala Val Phe
50 55 60
Glu Lys Tyr Ala Arg Gln Glu Gly Val Phe Asp Gln Val Asn Ile Ile
65 70 75 80
Met Ala Leu Thr Met Gln Glu Ser Gly Gly Arg Ser Leu Asp Ile Met
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Gln Ala Gly Gly Asp Val Arg Leu Thr Leu Gln Ala Tyr Asn Phe Gly
130 135 140
Ser Gly Phe Ile Asp Tyr Val Lys Lys Asn Gly Gly Lys Tyr Thr Lys
145 150 155 160
Lys Leu Ala Leu Asp Phe Ser Arg Leu Gln Ala Phe Lys Met Gly Trp
165 170 175
Lys Ser Tyr Gly Asp Pro Ser Tyr Val Asp His Val Met Arg Tyr Val
180 185 190
Lys Gly Ser Asp Lys Asn Val Lys Pro Val Lys Gly Ser Met Asp Phe
195 200 205
Tyr Glu Thr Val Met Lys Glu Ala Leu Lys Tyr Glu Gly Gln Pro Tyr
210 215 220
Ala Trp Gly Gly Ser Asn Pro Glu Thr Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu
225 230 235 240
Val Gln Trp Ser Phe Ala Lys Ala Gly Ile Thr Leu Pro Arg Thr Ala
245 250 255
Gln Glu Gln His Gly Ala Thr Lys Lys Ile Ser Glu Lys Glu Ala Thr
260 265 270
Ala Gly Asp Leu Val Phe Phe Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Lys Ala Ile
275 280 285
Thr His Val Gly Ile Tyr Val Gly Asn Gly Arg Met Phe Asn Ser Asn
290 295 300
Asp Ser Gly Ile Gln Tyr Ser Asp Leu Lys Ser Gly Tyr Trp Arg Asp
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His Leu Val Ser Phe Gly Arg Ile Lys
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物BF-YOJL的寡核苷酸
<400>60
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<210>61
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物KR-YOJL的寡核苷酸
<400>61
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<210>62
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>62
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<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物KR-YVCE的寡核苷酸
<400>63
gcgcggtacc gctcaacacg attaaatgta t 31
<210>64
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>64
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物KR-YDDH的寡核苷酸
<400>65
gcgcggtacc cactcctagt tatttaatgc g 31
<210>66
<211>1242
<212>DNA
<213>枯草杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1242)
<400>66
gtg aac aca ctg gca aac tgg aag aag ttt ttg ctt gtg gcg gtt atc 48
Val Asn Thr Leu Ala Asn Trp Lys Lys Phe Leu Leu Val Ala Val Ile
1 5 10 15
att tgt ttt ttg gtt cca att atg aca aaa gcg gag att gcg gaa gct 96
Ile Cys Phe Leu Val Pro Ile Met Thr Lys Ala Glu Ile Ala Glu Ala
20 25 30
gat aca tca tca gaa ttg att gtc agc gaa gca aaa aac ctg ctt gga 144
Asp Thr Ser Ser Glu Leu Ile Val Ser Glu Ala Lys Asn Leu Leu Gly
35 40 45
tat cag tat aaa tat ggc ggg gaa acg ccg aaa gag ggt ttc gat cca 192
Tyr Gln Tyr Lys Tyr Gly Gly Glu Thr Pro Lys Glu Gly Phe Asp Pro
50 55 60
tca gga ttg ata caa tat gtg ttc agt aag gct gat att cat ctg ccg 240
Ser Gly Leu Ile Gln Tyr Val Phe Ser Lys Ala Asp Ile His Leu Pro
65 70 75 80
aga tct gta aac gac cag tat aaa atc gga aca gct gta aaa ccg gaa 288
Arg Ser Val Asn Asp Gln Tyr Lys Ile Gly Thr Ala Val Lys Pro Glu
85 90 95
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Asn Leu Lys Pro Gly Asp Ile Leu Phe Phe Lys Lys Glu Gly Ser Thr
100 105 110
ggc act gtt ccg aca cat gac gcc ctt tat atc gga gac ggc caa atg 384
Gly Thr Val Pro Thr His Asp Ala Leu Tyr Ile Gly Asp Gly Gln Met
115 120 125
gtt cac agt aca cag tca aaa ggg gtt atc atc acc aat tac aaa aaa 432
Val His Ser Thr Gln Ser Lys Gly Val Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Lys
130 135 140
agc agc tat tgg agc gga act tat atc ggg gcg aga cga atc gct gcc 480
Ser Ser Tyr Trp Ser Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Arg Ile Ala Ala
145 150 155 160
gat ccg gca acg gct gat gtt cct gtc gtt cag gag gcc gaa aaa tat 528
Asp Pro Ala Thr Ala Asp Val Pro Val Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr
165 170 175
atc ggt gtc cca tat gtg ttt ggc gga agc acg ccg tca gag ggc ttt 576
Ile Gly Val Pro Tyr Val Phe Gly Gly Ser Thr Pro Ser Glu Gly Phe
180 185 190
gat tgc tcg ggg ctt gtg caa tat gtg ttt caa cag gca ctc ggc att 624
Asp Cys Ser Gly Leu Val Gln Tyr Val Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ile
195 200 205
tat cta ccg cga tca gcc gaa cag cag tgg gca gtg ggc gag aag gta 672
Tyr Leu Pro Arg Ser Ala Glu Gln Gln Trp Ala Val Gly Glu Lys Val
210 215 220
gcc cct cag aac ata aag cct ggt gat gtc gtc tat ttc agc aat acg 720
Ala Pro Gln Asn Ile Lys Pro Gly Asp Val Val Tyr Phe Ser Asn Thr
225 230 235 240
tat aaa acg gga att tca cat gca ggc att tat gcg ggc gca ggc agg 768
Tyr Lys Thr Gly Ile Ser His Ala Gly Ile Tyr Ala Gly Ala Gly Arg
245 250 255
ttc att cag gca agc cgg tca gaa aaa gta acc att tcc tat ttg tca 816
Phe Ile Gln Ala Ser Arg Ser Glu Lys Val Thr Ile Ser Tyr Leu Ser
260 265 270
gag gat tac tgg aaa tcg aag atg acg ggt att cgc cga ttt gac aac 864
Glu Asp Tyr Trp Lys Ser Lys Met Thr Gly Ile Arg Arg Phe Asp Asn
275 280 285
ctg aca atc ccg aaa gaa aat ccg att gtt tcc gaa gcg acg ctt tat 912
Leu Thr Ile Pro Lys Glu Asn Pro Ile Val Ser Glu Ala Thr Leu Tyr
290 295 300
gtc gga gaa gtg cct tac aaa cag ggc gga gta aca cct gag acg gga 960
Val Gly Glu Val Pro Tyr Lys Gln Gly Gly Val Thr Pro Glu Thr Gly
305 310 315 320
ttt gat aca gct gga ttt gtc caa tat gta tac cag aaa gca gcc ggt 1008
Phe Asp Thr Ala Gly Phe Val Gln Tyr Val Tyr Gln Lys Ala Ala Gly
325 330 335
att tcc ctg cct cga tac gca aca agc cag tac aat gcc gga act aag 1056
Ile Ser Leu Pro Arg Tyr Ala Thr Ser Gln Tyr Asn Ala Gly Thr Lys
340 345 350
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Ile Glu Lys Ala Asp Leu Lys Pro Gly Asp Ile Val Phe Phe Gln Ser
355 360 365
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Thr Ser Leu Asn Pro Ser Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Gln Val Val His
370 375 380
gtc aca tta tca aac ggc gtg acc att acc aat atg aac acg agc aca 1200
Val Thr Leu Ser Asn Gly Val Thr Ile Thr Asn Met Asn Thr Ser Thr
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tat tgg aag gat aaa tac gca gga agt ata cgg gtg caa taa 1242
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<211>413
<212>PRT
<213>枯草杆菌
<400>67
Val Asn Thr Leu Ala Asn Trp Lys Lys Phe Leu Leu Val Ala Val Ile
1 5 10 15
Ile Cys Phe Leu Val Pro Ile Met Thr Lys Ala Glu Ile Ala Glu Ala
20 25 30
Asp Thr Ser Ser Glu Leu Ile Val Ser Glu Ala Lys Asn Leu Leu Gly
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Tyr Gln Tyr Lys Tyr Gly Gly Glu Thr Pro Lys Glu Gly Phe Asp Pro
50 55 60
Ser Gly Leu Ile Gln Tyr Val Phe Ser Lys Ala Asp Ile His Leu Pro
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Asp Gln Tyr Lys Ile Gly Thr Ala Val Lys Pro Glu
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Val Pro Thr His Asp Ala Leu Tyr Ile Gly Asp Gly Gln Met
115 120 125
Val His Ser Thr Gln Ser Lys Gly Val Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Lys
130 135 140
Ser Ser Tyr Trp Ser Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Arg Ile Ala Ala
145 150 155 160
Asp Pro Ala Thr Ala Asp Val Pro Val Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr
165 170 175
Ile Gly Val Pro Tyr Val Phe Gly Gly Ser Thr Pro Ser Glu Gly Phe
180 185 190
Asp Cys Ser Gly Leu Val Gln Tyr Val Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ile
195 200 205
Tyr Leu Pro Arg Ser Ala Glu Gln Gln Trp Ala Val Gly Glu Lys Val
210 215 220
Ala Pro Gln Asn Ile Lys Pro Gly Asp Val Val Tyr Phe Ser Asn Thr
225 230 235 240
Tyr Lys Thr Gly Ile Ser His Ala Gly Ile Tyr Ala Gly Ala Gly Arg
245 250 255
Phe Ile Gln Ala Ser Arg Ser Glu Lys Val Thr Ile Ser Tyr Leu Ser
260 265 270
Glu Asp Tyr Trp Lys Ser Lys Met Thr Gly Ile Arg Arg Phe Asp Asn
275 280 285
Leu Thr Ile Pro Lys Glu Asn Pro Ile Val Ser Glu Ala Thr Leu Tyr
290 295 300
Val Gly Glu Val Pro Tyr Lys Gln Gly Gly Val Thr Pro Glu Thr Gly
305 310 315 320
Phe Asp Thr Ala Gly Phe Val Gln Tyr Val Tyr Gln Lys Ala Ala Gly
325 330 335
Ile Ser Leu Pro Arg Tyr Ala Thr Ser Gln Tyr Asn Ala Gly Thr Lys
340 345 350
Ile Glu Lys Ala Asp Leu Lys Pro Gly Asp Ile Val Phe Phe Gln Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Asn Pro Ser Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Gln Val Val His
370 375 380
Val Thr Leu Ser Asn Gly Val Thr Ile Thr Asn Met Asn Thr Ser Thr
385 390 395 400
Tyr Trp Lys Asp Lys Tyr Ala Gly Ser Ile Arg Val Gln
405 410
<210>68
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物YwtD-FL-Fw的寡核苷酸
<400>68
gcgcggtacc gatacatcat cagaattgat t 31
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<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>作为PCR引物YwtD-FL-Rv的寡核苷酸
<400>69
gcgcctgcag ttattgcacc cgtatacttc 30
机译： 细菌酶抑制剂，裂解抑制剂，聚γ-谷氨酸降解抑制剂以及生产聚γ-谷氨酸的方法
机译： 溶菌酶抑制剂，溶菌抑制剂，聚γ-谷氨酸降解抑制剂，以及聚γ-谷氨酸的生产方法
机译： 裂解酶抑制剂，裂解抑制剂，聚γ-谷氨酸降解抑制剂和生产聚γ-谷氨酸的方法
