胡杨DREB2转录因子cDNA序列、含有该序列的表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一类从沙生植物胡杨(Populus euphratica)中所分离、克隆的与抗逆性紧密相关的DREB转录因子cDNA序列(PeDREB2a基因)，本发明还公开了含有该cDNA序列的高效植物表达载体，以及它们在提高植物抗逆性中的应用。本发明将PeDREB2a基因构建到植物高效表达载体p2MDK－PeDREB2a中，利用农杆菌介导转化烟草，通过Kan抗性、基因组PCR及RT－PCR筛选鉴定阳性苗，对转基因烟草苗进行干旱、高盐及低温等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定。试验结果表明，转PeDREB2a基因植株的可溶性糖、胞质总蛋白和脯氨酸含量明显高于对照，说明过表达PeDREB2a基因可显著提高转基因烟草的抗旱性和渗透胁迫抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物AP2/EREBP家族转录因子的cDNA序列，尤其涉及沙生植物胡杨(Populuseuphratica)DREB2转录因子cDNA序列。本发明还涉及能够在植物中高效表达该cDNA序列的植物表达载体、该cDNA序列在提高植物抗逆性中的应，属于植物基因工程领域。

背景技术

干旱、盐碱和低温是影响陆生植物生长和限制作物产量的三种主要的非生物胁迫因子。据统计，世界干旱半干旱地区涉及50多个国家和地区，约占全球陆地面积的34.9％。目前全世界用于农业的57亿公顷可耕旱地中，约70％的耕地由于干旱等因素导致土质退化，亚洲受此影响的土地面积最广，近14亿公顷。而我国的干旱、半干旱地区约占国土面积的一半以上，年受旱面积达200-270万公顷。其危害相当于其它自然灾害之和。此外，世界盐碱地占全球陆地面积的7.6％，随着工业化进程加快，灌溉地和塑料大棚面积的不断扩大，我国的土壤盐渍化面积不断扩大，目前盐渍化土壤面积约有2600万公顷，其中盐碱耕地约有670万公顷，严重制约了农业对土地的利用。低温作为经常发生且危害严重的逆境因素之一，它不仅影响着植物的季节性生长，也影响着植物的地理性分布。据统计，我国每年因冷害造成的农业损失高达数十亿元，这些非生物胁迫对农业生产、生态建设、可持续发展战略有着直接或间接的危害作用。

干旱、盐碱和低温等非生物逆境都会构成对植物的渗透胁迫，致使环境渗透势低于植物细胞渗透势而导致植物细胞失水，严重的可造成细胞膨压完全丧失，甚至导致植物死亡。当然，植物为了适应环境，在长期演化过程中也形成了复杂而精细的调节机制，提高了自身对不良环境胁迫的抵抗或忍耐能力，以适应不良环境。

转录因子(transcription factor，TF)也称反式作用因子，是指能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过他们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录。自从1987年Paz-Ares首次报道玉米转录因子基因的克隆以来，相继从高等植物中分离出的调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种。拟南芥基因组测序已经完成，据推测，至少有1553个编码转录因子的基因，约占其估计基因总数的5.9％。拟南芥中转录因子数量如此之大，种类之多，表明了高等植物转录调控的复杂性，同时也表明转录因子研究的重要性。

AP2/EREBP类转录因子是植物中所特有的一个庞大的转录因子家族，它主要参与植物发育、激素、病原反应以及干旱、高盐和低温胁迫应答。这个基因家族的成员都含有由60个左右氨基酸残基组成的非常保守的DNA结合区(即AP2/EREBP结合域)，这类蛋白根据DNA结合区的同源性又可以分为5类：AP2类、DREB类、ERF类、RAV类以及其它类型。很多研究已经证明，DREB类和ERF类转录因子在逆境抗性中起重要作用。

AP2/EREBP转录因子所具有的快速、瞬时、早期的表达特点为其参与信号转导途径，发挥其早期的基因调控作用提供可能，一旦有生物或非生物胁迫出现，该转录因子家族基因便能快速表达，通过结合下游功能基因启动子中的顺式作用元件调控基因的转录和表达，并最终开启植物防卫反应体系进行防卫应答反应。EREBP亚家族转录因子(如TINY、CBF1、Ptis、AtEBP、DREB1、DREB2)主要参与对乙烯和病原的分子应答反应。其中，该亚家族的DREB转录因子在植物抗逆响应中起关键作用，其通常识别结合干旱应答元件DRE/CRT，从而调控一些与干旱、高盐和低温耐性有关的基因表达(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，MiuraS，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Two transcription factors，DREB1 andDREB2，with an EREBP/AP2 DNA-binding domain separate two cellular signaltransduction pathway in drought and low-temperature-responsive gene expressionrespectively in Arabidopsis.Plant Cell，1998，10：1391～1406)。然而，ERF转录因子在生物胁迫应答中起着重要作用，如拟南芥AtEFR1基因在拟南芥中超表达后，对灰霉病、菌核病及白粉病都具有抗性。ERF亚家族转录因子主要调控乙烯应答以及抗病相关(Pathogenesis-Related，PR)基因的表达。PR基因的启动子中常常含有与乙烯信号应答有关的顺式作用元件GCC盒，ERF亚家族转录因子通过与GCC盒的相互作用，调控PR基因的表达，从而调控植株的抗病能力。

DREB转录因子(Dehydration Responsive Element Binding Protein)，即干旱应答元件结合蛋白，是一类和植物脱水条件下的抗逆性反应有关的、在信号传递和调控基因表达中起作用的转录因子，能特异结合DRE/CRT顺式作用元件，并激活下游目的基因的转录。DRE/CRT(dehydration responsive element)顺式作用元件，核心序列为TACCGACAT，1994年Yamaguchi Shinozaki在分析拟南芥rd29A基因的启动子中首次发现了含9bpTACCGACAT序列的DRE核心序列，它能对干旱、高盐和低温下逆境诱导基因表达起重要作用，且表达不依赖ABA信号转导途径。与此同时，在一些受干旱、高盐或低温的启动子中也发现DRE元件或DRE核心序列，如受低温诱导拟南芥基因cor15a的启动子中发现相似于DRE元件的序列TGGCCGAC，称为CRT(C-repeat)元件，受低温诱导的甘蓝型油菜基因BNIIS启动子中也发现具有DRE核心序列的5bp(CCGAC)中心序列，被称为低温应答元件LTRE。DREB的发现是近年来植物抗逆性研究方面最具突破性的进展。Liu等(Liu Q，Kasuga M，Saklam Y，et al.Two transcriptionfactors，DREB1andDREB2，with an EREBP/AP2DNA-binding domain separate two cellularsignal transduction pathway in drought and low temperature responsive geneexpression in Arabidopsis[J].Plant Cell，1998，10：1391-1406)利用rd29A基因启动子区域中的DRE顺式作用元件和酵母单杂交方法，从低温处理的拟南芥cDNA文库中克隆到3个与DRE元件结合，在低温胁迫下调控报告基因GUS表达的转录因子，命名为DREB1A、DREB1B、DREB1C。Gilmour等(Gihmur S J，Zarka DG，Stockinger E J，et al.low temperatureregulation of the Arsbldopsis CBF family of AP2transcriptional activator as anearly step in cold induced cor gene expression[J].Plant J，1998，16(4)：433-442)也分离到这三个基因，分别命名为CBF1(DREB1B)、CBF2(DREB1C)和CBF3(DREB1A)。它们受冷诱导表达，为冷应答基因。用4℃低温处理，15min内，DREB1A、DREB1B和DREB1C基因被快速强烈诱导，但它们不受外源ABA的诱导。Liu等研究表明，转基因拟南芥中DREB1B的组成型超表达提高了植物对干旱、高盐和低温的耐受性。Liu等还从干旱处理的拟南芥cDNA文库中克隆到2个与DRE元件结合，在干旱、高盐胁迫下调控报告基因GUS表达的基因，定名为DREB2A和DREB2B。它们受干旱和高盐诱导表达，为干旱和高盐应答基因，如用干旱或高盐进行胁迫处理，15min内，DREB2A和DREB2B基因也被快速强烈诱导，尤其在植物根部，这两个基因不受外源ABA的诱导。在与DRE元件结合的DREB1(CBF)和DREB2两类转录因子各自同源性都很高，但是除了AP2结构域高度保守外，两类基因之间基本没有序列的相似性。DREB1(CBF)的表达被低温诱导，却不被干旱和高盐胁迫所诱导，而DREB2被干旱和高盐胁迫所诱导，却不被低温所诱导。在胁迫诱导后，植物中的内源ABA水平有所提高，但两种DREB转录因子均不受外源ABA的诱导。产生的DREB转录因子可激活具有DRE顺式作用元件的一系列目的基因，如rd17、kin1、cor6.6、cor15a、erd10以及rd29A。这些基因表达的产物在植物抗逆反应中发挥着不同的功能，从而使植株的抗逆性提高。

同一家族不同亚族蛋白功能的差异，常由少数几个关键位置的氨基酸决定，这些氨基酸往往在亚族中保守，但在亚族间不同。DREB/CBF和ERF同属AP2/EREBP转录因子家族，但功能不同。ERF亚家族转录因子识别结合的顺式作用元件GCC盒，主要参与对乙烯和病原的分子应答反应；而DREB/CBF亚家族转录因子识别结合CRT/DRE顺式作用元件，主要参与对低温、干旱和高盐等的分子应答。氨基酸序列比较发现，ERF亚家族转录因子的AP₂DNA结合域中，第14和19位为保守的丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)；而DREB亚家族转录因子的AP₂DNA结合域中，第14和19位为保守的缬氨酸(V)和谷氨酸(E)。

迄今报道的DREB转录因子，其基因内均无内含子。从蛋白质结构分析，DREB蛋白具有转录因子的普遍结构特征：在C-末端富含酸性氨基酸，功能是作为转录激活区；N-末端富含碱性氨基酸，是核定位信号区；中间由58个氨基酸残基组成的AP2/EREBP结构域，此结构域序列以及空间构象均有一定的特点，包括YRG区和RAYD区，前者为N-端富含有20个氨基酸残基组成的碱性和亲水性的区域，蛋白质的三维分析表明，该区有3个反向平行β-折叠，对识别各类顺式作用元件并与元件相互结合作用起关键作用，该区的第14位和第19位的氨基酸分别为保守的缬氨酸(V14)的谷氨酸(E19)，特别是第14位的缬氨酸(V)，对决定DREB转录因子与DRE顺式作用元件的特异性结合起关键作用。Sakuma等和Qin等分别对拟南芥和玉米的DREB转录因子的这两个位点的氨基酸进行点突变，当14位的缬氨酸(V)变成丙氨酸(A)后，DREB不与DRE序列结合，DREB转录因子几乎丧失其转录激活能力；而19位的谷氨酸(E)变成天冬氨酸(D)后，DREB转录因子可以结合DRE序列，但转录激活能力受到较大影响。另外，在拟南芥数据库中检索到的56个DREB/CBF类的蛋白，在V14处都为缬氨酸，而有19个基因在E19处并不是谷氨酸，这些均表明在DREB与顺式作用元件的结合中，V14起着更为重要的作用。RAYD区位于AP2/EREBP结构域的C-末端，其中约18个氨基酸残基组成的核心区可形成双亲性的α-螺旋。DNA结合依赖于YRG元件，但RAYD元件并不直接参与同一顺式作用元件的特异识别，而通过影响YRG区构象或通过与其它蛋白发生相互作用调节AP2/EREBP结构域与DRE顺式作用元件的结合。

CBF/DREB转录因子在植物中广泛存在。比较双子叶和单子叶植物CBF/DREB1转录因子AP2结合域的第14位和19位氨基酸发现，双子叶植物中第14位和19位氨基酸为V14和E19；单子叶植物中相应位置的氨基酸除了V14和E19外，大多数为V14和V19。综上所述，从最初拟南芥CRT/DRE元件的鉴定和CBF/DREB转录因子的克隆距今，只短短10年，但却从各种植物鉴定出了CBF/DREB转录因子。DREB/DRE是植物中广泛存在而不依赖于ABA的逆境胁迫信号转导途径。CBF/DREB转录因子特异识别结合CRT/DRE元件，调控一系列干旱低温应答基因表达，这些基因所编码的产物使植物适应或抵御逆境。另外，超表达CBF3/DREB1A的拟南芥耐旱耐寒，而耐性的提高，不仅与CRT/DRE基因的表达增强有关，还与脯氨酸和糖含量的升高有关。因此，CBF/DREB转录因子的功能，可能不简单局限于对CRT/DRE基因的调控，可能还以某种方式、通过某种途径调控其它与耐逆相关的基因表达。目前对CBF/DREB转录因子的认识还十分肤浅，对其功能和所参与调控的信号传导途径的准确理解和把握，还需要不懈的努力。

到目前为止，已经从多种植物中克隆分离到上百种DREB转录因子，包括单子叶植物和双子叶植物，并且DRE/DREB顺式作用元件与反式作用因子相互作用的调控模式已经在草本植物种发现并被证明，如拟南芥、小麦、黑麦草、番茄、玉米、大麦、水稻等。但是仅在为数不多的几种木本植物中分离得到了少数DREB转录因子。

目前，植物抗逆基因工程的研究取得了一定进展，但是其重点均在导入个别功能基因来提高某种抗性，从而达不到使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。植物的抗逆性并不是由单个或少数几个基因的表达来体现的，而是由多基因控制的数量性状。虽然目前已陆续从各种植物中克隆出大量的抗逆相关基因，但这些基因大多数只能增加植物的某种单一抗性，并不能从整体上综合提高植物的抗逆性。转录因子作为功能基因表达的调节开关，可以对不同的基因进行精确的调节，在植物逆境信号传递过程中发挥着关键的作用，所以通过增强某个转录因子的作用，可促使多个与抗逆有关的功能基因表达，这是使植物抗逆性状获得综合改良的一条非常有效的途径。DREB正是这一类的转录因子，在胁迫信号传递过程中起重要作用，它可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达，从整体上增强植物的抗逆性，提高其稳定性，对于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潜在应用价值，并将有巨大的应用前景。因此，克隆新的具有自主知识产权的DREB类转录因子基因，研究其基本的生物学特性和功能，将为整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，为改良作物抗逆性、创造新的抗逆材料提供物质基础。

胡杨(Populus euphratica)系杨柳科杨属中最古老、最原始的一个树种，它是第三纪上遗留下来的孑遗植物，落叶乔木，为国家三级保护渐危种。在我国主要分布于新疆、青海、内蒙古、甘肃、宁夏等海拔较低的干旱荒漠地区，在亚洲的中西部、北非和欧洲南端也有分布。胡杨可耐极端最高气温45℃和极端最低气温-40℃，具有极强的抗旱、耐盐碱、防风、固沙、改良土壤等能力，能够在极度干旱缺水的环境中生长，除了其形态学上的部分特点外，更主要的是由于胡杨在长期生长进化过程中形成了其特有的基因构成及精密的表达调控方式。因此，从沙生植物胡杨中克隆与抗逆性紧密相关的DREB转录因子基因，不仅能为基因工程育种提供优良基因源，而且对于作物抗逆育种显得尤为重要和迫切。

综上所述，对于一个水资源紧缺、盐渍化土壤面积不断扩大、耕地面积有限、人口众多的农业大国来说，克隆在植物抗逆过程中起重要作用的调控基因，对于农业的可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一类从沙生植物胡杨(Populus euphratica)中所分离、克隆的与抗逆性紧密相关的DREB转录因子cDNA序列。

本发明目的之一是通过以下技术方案来实现的：

一种从沙生植物胡杨中所分离、克隆的与抗逆性紧密相关的DREB转录因子cDNA序列，该cDNA序列为以下(a)或(b)的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

(b)将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列所编码的蛋白仍具有DREB转录因子的功能。

本发明根据植物中DREB基因DNA结合域保守区设计简并引物，利用RT-PCR方法从沙生植物胡杨中分离到DREB2基因的同源片段，然后通过RACE-PCR技术克隆得到新的DREB2转录因子基因PeDREB2a(SEQ ID NO：1)，并对其进行了序列分析和蛋白的三维结构预测，结果显示该基因具有DREB转录因子所特有的三个功能结构域，即核定位信号、DNA结合域和转录激活域。序列比对表明该基因和其它已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性外，在其它区域的序列同源性不高。通过构建植物DREB转录因子的系统进化树分析发现该PeDREB2a蛋白主要与DREB2类转录因子聚在一起，并且与双子叶植物的DREB2类转录因子的亲缘关系更近；分别以基因组DNA和cDNA为模板对PeDREB2a进行PCR扩增，扩增产物经序列分析表明，该基因不含内含子；通过半定量RT-PCR对其在不同的胁迫条件下进行胁迫反应检测，结果显示：该基因的表达均受干旱、高盐和低温环境逆境的诱导，并且其表达不依赖于ABA的调控。

本发明目的之二是提供一类由上述cDNA序列所编码的胡杨DREB转录因子。

本发明目的之二是通过以下技术方案来实现的：

一类由上述cDNA序列所编码的胡杨DREB转录因子，为以下(a)或(b)所示的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有DREB转录因子功能的氨基酸序列。

优选的，本发明所述的胡杨DREB转录因子为SEQID NO：2所示的氨基酸序列。

本文中，所述的“多个”通常意味着2～8个，优选为2～4个，这些取决于DREB转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

本发明还涉及可以在植物中高效表达所述DREB转录因子cDNA序列(SEQ ID NO：1)的植物表达载体。

将所述DREB转录因子cDNA序列插入到植物表达载体合适的限制性酶切位点之间，可操作的与表达调控序列相连接，即可得到可以在植物中表达该cDNA序列的表达载体。该表达载体可以5’非编码区、SEQ ID NO：1所示的cDNA序列以及3’非编码区，其中，所述的5’非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子序列可以是组成型、诱导型、组织或器官特异性诱导子。作为一个优选的实施方案，所述的植物表达载体是p2MDK。

所述的3’非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等，SEQ ID NO：1所示的cDNA序列可由将其一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的核苷酸序列所替换，该核苷酸序列所编码的蛋白仍具有DREB转录因子的功能。作为优选的，所述的植物表达载体还可含有报告基因，更优选的，所述的报告基因为GFP。作为本发明的一个最优选的实施方案，所述的高效植物表达载体是p2MDK-PeDREB2a。

本发明还涉及包含上述植物表达载体的植物细胞。

另外，本发明还涉及所分离、克隆的DREB转录因子cDNA序列、含有该cDNA序列的植物表达载体在提高植物抗逆性中的应用。例如，可以将含有该cDNA序列的植物表达载体导入到植物细胞中，培育筛选得到对环境胁迫的抗性提高了的转基因植株，其中，所述的环境胁迫可以是干旱、高盐或低温等逆境。

转录因子通过与下游基因启动子区域的顺式元件结合可以调控一系列相关功能基因的表达，因此，在植物抗性分子育种中，导入转录因子基因能有效地提高转基因植物的抗逆性。为了进一步分析克隆到的PeDREB2转录因子基因的功能，本发明首先构建得到含有PeDREB2a基因的植物高效表达载体p2MDK-PeDREB2a，利用农杆菌介导将其转化到烟草中；通过Kan抗性、基因组PGR及RT-PCR筛选鉴定阳性苗，对转基因烟草苗进行干旱、高盐及低温等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定，通过测定生理生化指标得出，转基因植株的可溶性糖、胞质总蛋白和脯氨酸含量高于对照，这些渗透调节物质的大量积累有助于减少渗透胁迫和干旱胁迫对植物的伤害，成为转基因植物抗渗透能力和抗旱能力提高的重要生化证据，也进一步说明过表达PeDREB2a基因可能通过调节渗透调节物质的含量提高转基因烟草的抗旱性和渗透胁迫抗性，以维持植株正常的生理生化功能。DREB转录因子对一系列抗逆功能基因的转录以及对脯氨酸和糖含量的促进作用说明DREB因子在植物抗逆反应中起着重要作用。

附图说明

图1为简并PCR扩增结果；

图2为3’RACE-PCR扩增。

图3为5’RACE-PCR扩增。

图4为PeDREB2a cDNA全长序列的扩增结果。

图5为PeDREB2a蛋白的三维空间结构预测。

图6为胡杨DREB2a基因的基因组DNA结构分析。

图7为不同胁迫处理下PeDREB2a基因的表达模式分析。

图8为表达载体p2MGK-PeDREB2a的构建流程图

图9植物表达载体p2MDK的图谱。

图10重组质粒p2MGK-PeDREB2a菌落PCR扩增结果

图11重组质粒p2MGK-PeDREB2a的酶切结果；1，SalI单酶切，2，XbaII和SalI 双酶切。

图12含有表达载体p2MGK-PeDREB2a的农杆菌LBA4404的菌落PGR；pCK：连接有目的基因的pMD19-T(阳性对照)，nCK：农杆菌LBA4404(阴性对照)。

图13转基因烟草DNA水平的PCR检测。

图14转基因烟草的RT-PCR检测。

图15转基因烟草的抗旱性分析；A：转p2MGK-PeDREB2a基因阳性烟草株系；B：p2MGK对照。

图16转基因烟草的耐盐性分析；A：转p2MGK-PeDREB2a基因阳性烟草株系；B：p2MGK对照。

图17剪叶7h后转基因和对照植株叶片；A.p2MGK-PeDREB2a B.p2MGK对照。

图18单位叶面积累计失水量。

图19高盐对胞质总蛋白含量的影响。

图20干旱对胞质总蛋白含量的影响。

图21高盐对脯氨酸含量的影响。

图22干旱对脯氨酸含量的影响。

图23高盐对叶片可溶性糖含量的影响。

图24干旱对叶片可溶性糖含量的影响。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1胡杨DREB转录因子(PeDREB2a)基因的分离、克隆

1材料和方法

1.1材料

1.1.1植物材料培养及胁迫处理

胡杨(Populus euphratica)幼苗采集于新疆罗布泊地区，现定植于河北廊坊实验基地，采样时剪取胡杨短枝将其插入20％PEG6000溶液中进行模拟干旱胁迫处理10小时后，采集叶片经液氮处理后保存于超低温冰箱中备用。

不同胁迫材料的处理：剪取胡杨短枝，分别将其插入250mM的氯化钠、20％PEG6000、100μM的ABA溶液、100μM的GA3溶液、100μM的BA溶液、100μM的NAA溶液以及置于4℃冰箱中分别处理0.5、3、6、12和24小时。将处理后的材料用液氮迅速冷冻，放置于超低温冰箱中备用。

1.1.2菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)：DH5α

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：LBA4404

1.1.3载体

pMD19-T克隆载体购自TaKaRa生物公司

1.1.4酶与试剂

DNA回收试剂盒购自北京天根科技有限公司；SuperScript^TMIII Reverse Transcriptase及Gene RacerTM kit购自Invitrogen公司；pMD19-T载体及限制性内切酶、Taq酶等常用酶类购自宝生物公司；Easy Pure Mini Plasmid Purification Kit购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.5其它试剂

蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异丙醇、乙醇、异戊醇、NaCl、MgCl₂、磷酸二氢钠、水饱和酚、Tris饱和酚等均为国产分析纯试剂；5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷(X-gal)、已丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素等购自北京鼎国生物公司；琼脂糖为Spain产品，焦碳酸二乙酯(DEPC)为美国Genview公司产品；溴代十六烷基三甲胺(CTAB)购自北京拜尔迪生物公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-25)购自北京欣经科生物技术有限公司；乙二胺四乙二钠盐(EDTA Na₂)购自北京普博欣生物科技有限责任公司。

1.1.6培养基

LB液体及固体培养基按照文献所公开的方法配制(分子克隆实验指南(第三版)J.萨姆布鲁克)。B5培养基及贮存液的配制按照有关教材所公开的方法进行配制(《植物组织培养》，王蒂主编，中国农业出版社出版)。

1.2方法

1.2.1胡杨总RNA的提取(热CTAB法)

按照《植物分子生物技术应用手册》(彭学贤主编，化学工业出版社)一书所公开的热CTAB法提取胡杨总RNA；

1.2.2第一链cDNA的合成(按Invitrogen公司反转录试剂盒说明书进行)

1.预变性：以胡杨总RNA为模板，以Oligo-dT为引物(工作浓度为10pmol/μl)。反应体系如表1，混匀后，65℃变性5min，立即置于冰上1-2min。

表1RNA预变性体系

2.反转录：向上述离心管中加入表2中所列成分后混匀，42℃1h；70℃下15min灭活反转录酶；

表2反转录体系

3.RNaseH消化：向反应液中加入1μl(2U/μl)的RNaseH，37℃20min，消化与cDNA结合的单链RNA，-20℃冰箱保存反转录产物。

1.2.3DREB基因同源片段的克隆

1.2.3.1引物的设计与合成

利用DNAMAN软件对GENBANK中已公布的相关科属植物DREB2类基因的氨基酸和核苷酸序列进行同源分析，然后，根据DREB基因DNA结合域保守区设计合成一对简并引物(表3)。

表3简并PCR中使用的引物

1.2.3.2RT-PCR

根据植物中DREB2基因DNA结合域保守区设计一对简并引物S和AS，以叶片为材料提取总RNA进行RT-PCR，PCR条件为：94℃5min；94℃45sec，50℃45sec，72℃30sec，30个循环；72℃10min。反应结束后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

1.2.3.3PCR产物的回收

采用北京天根科技有限公司的PCR产物回收试剂盒，按照试剂盒说明书的方法进行操作：

1.2.3.4目的片段与克隆载体的连接

将回收的PCR产物连接至pMD19-T载体上，连接反应体系如表4，16℃连接过夜。

表4连接反应体系

1.2.3.5大肠杆菌感受态的制备

参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。

1.2.3.6重组质粒的转化

参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。

1.2.3.7菌落PCR鉴定

以含有Amp的LB平板上挑取的白色单菌落，转入1mlLB(Amp+)液体培养基中，37℃，200r/min摇菌2h，分别吸取1μl菌液作为模板，进行菌落PCR鉴定，引物为S和AS，扩增条件为：94℃5min；94℃45sec，50℃45sec，72℃30sec，30个循环；72℃10min。反应结束后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

1.2.3.8重组质粒的核苷酸序列测定

将菌落PCR阳性的菌落转入含Amp的LB液体培养基，37℃下200r/min过夜培养，制备成甘油菌，送中国农业科学院测序部测序。

1.2.4胡杨DREB基因的3’cDNA的克隆

1.2.4.1引物的设计与合成

根据已获得的DREB基因的同源片段，设计1对3`RACE的巢式基因特异引物，见表5。

表53’RACE反应中使用的引物

1.2.4.2胡杨总RNA的提取

以胡杨叶片为材料提取总RNA，提取方法同1.2.1。

1.2.4.3第一链cDNA的合成

方法同1.2.2。

1.2.4.4巢式PCR扩增3’-端cDNA

1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，用基因特异引物3HY1-GSP1与通用引物Q1进行第一轮PCR，反应参数：94℃5min；94℃45sec，60℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，用基因特异引物3HY1-GSP2与通用引物Q2进行第二轮巢式PCR，反应参数：94℃5min；94℃45sec，63℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃10min； 4℃保存。

3.0.8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序，方法同1.2.3。

1.2.5巢式PCR扩增5’端cDNA

1.2.5.1引物的设计与合成

根据已获得的3’-端cDNA序列设计1对巢式基因特异引物，见表6。

表6 5’RACE反应中使用的引物

1.2.5.2第一链cDNA的合成(按照Invitrogen公司GeneRACER试剂盒说明进行)

1.去磷酸：在PCR管中加入表7所列成分混匀，离心，50℃条件下处理1hr后，离心，置于冰上1-2min。

表7去磷酸化反应体系

2.RNA纯化

参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行。

3.去帽：在PCR管中加入下表所列成分混匀，离心，37℃条件下处理1hr后，离心，置于冰上1-2min。

表8去帽反应体系

4.RNA纯化

方法同步骤2。

5.RNA接头序列的连接

1)将经去磷酸化和去帽处理的RNA转入另一PCR管中，加入RNA接头片段，轻轻混匀，离心；

2)65℃，5min，冰浴2min，离心；

3)在PCR管中加入下表所列成分混匀，离心，37℃条件下处理1hr后，离心，置于冰上1-2min。

6.RNA纯化

方法同步骤2

7.反转录

方法同1.2.2。

表9RNA片段连接反应体系

1.2.5.3巢式PCR扩增5’-端cDNA

1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，用基因特异引物5HY1-GSP1与GeneRacer5’primer进行第一轮PCR，反应参数：94℃5min；94℃45sec，60℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，用基因特异引物5HY1-GSP2与GeneRacer5’Nested primer进行第二轮巢式PCR，反应参数：94℃5min；94℃45sec，62℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

3.0.8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序，方法同1.2.3。

1.2.6DREB基因cDNA全长扩增

1.2.6.1引物的设计与合成

拼接已知的3’-端和5’-端cDNA序列，获得cDNA全长序列，据此，设计基因特异引物，扩增DREB基因的cDNA全长序列，所用引物见表10。

表10 cDNA全长序列扩增所使用的引物

1.2.6.2第一链cDNA的合成

方法同1.2.2。

1.2.6.3DREB基因cDNA全长序列的克隆及生物信息学分析

1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，利用基因特异引物HY1-F1与通用引物Q1，进行第一轮PCR，反应参数：94℃5min；94℃45sec，64℃45sec，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保存

2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，利用基因特异引物HY1-F2与通用引物Q2，进行第二轮巢式PCR，反应参数：94℃5min；94℃45sec，60℃45sec，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

3.0.8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序，方法同1.2.3。

4.利用DNAMAN软件进行序列比对和分析；利用SMART服务器(http://coot.embl-heidelberg.de/SMART/)分析PeDREB2a基因的结构域；利用CPHmodels-2.0服务器分析预测PeDREB2a  蛋白的三维空间结构(http://genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0Server-3D.htm)；利用ScanProsite服务器(http://www.expasy.org/cgi-bin/prosite)分析PeDREB2a基因的结构功能位点。

1.2.7DNA序列的扩增及分析

1.2.7.1引物的设计与合成

根据已获得的PeDREB2a基因的cDNA序列，分别在基因5’-端和3’-端设计基因特异引物，所用引物见表11。

表11 PeDREB2a基因的基因组扩增所使用的引物

1.2.7.2胡杨基因组DNA的提取

参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的DNA提取方法提取胡杨基因组DNA。

1.2.7.3PCR扩增

以胡杨的基因组DNA为模板，以基因特异引物Gn-HY1(F)和Gn-HY1(R)进行PCR扩增；0.8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并测序，方法同1.2.3。

1.2.9DREB基因在不同胁迫条件下的表达模式分析

1.2.9.1引物的设计与合成

以胡杨肌动蛋白基因Actin(EF148840)为内标基因，设计胡杨肌动蛋白基因特异引物HY Actin-F和HYActin-R；根据已得到的PeDREB2a基因cDNA序列，在基因的非保守区设计基因特异引物，所用引物见表13。

表13 PeDREB2a基因在非生物胁迫下的表达分析所使用的引物

1.2.9.2DREB转录因子基因对干旱、高盐及低温胁迫条件的应答

将剪取的胡杨新鲜短枝分别插入含有250mM的NaCl溶液、20％PEG6000溶液以及置于4℃冰箱中进行高盐胁迫、干旱胁迫以及低温胁迫处理。分别提取处理0、0.5、3、6、12和24小时的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以胡杨肌动蛋白基因为内标基因，利用基因特异引物HY1-RT(F)和HY1-RT(R)进行RT-PCR扩增，检测PeDREB2a基因的表达变化。

1.2.9.3DREB转录因子基因对不同激素条件胁迫的应答

将剪取的胡杨新鲜短枝分别插入含有100μM的生长素萘乙酸NAA溶液、100μM的细胞分裂素6-苄基氨基嘌呤(BA)溶液、100μM的赤霉素GA3溶液以及100μM的脱落酸(ABA)溶液中进行不同激素胁迫处理；分别提取处理0、0.5、3、6、12和24小时的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以胡杨肌动蛋白基因为内标基因，利用基因的特异引物HY1-RT(F)和HY1-RT(R)进行RT-PCR扩增，检测PeDREB2a基因的表达变化。

2试验结果与分析

2.1DREB基因同源片段的获得

对胡杨与拟南芥、构树、石刁柏以及银白杨已报道的DREB2蛋白序列进行了同源比对分析，发现DREB2蛋白的DNA结合域的氨基酸序列在不同植物、不同DREB2家族中都呈现出高度保守的特性，因此利用该保守区域进行了简并引物的设计，以叶片总RNA反转录获得的cDNA为模板，通过简并PCR扩增出约200bp的目标带(图1)，与预期大小一致。将回收的PCR产物连接至pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH-5α，利用α互补及菌落PCR筛选出4个阳性克隆，测序后得到1条183bp的序列。序列检索结果显示，与大豆、棉花、及拟南芥的DREB基因核苷酸序列具有较高的一致性，初步判断该片段为胡杨DREB基因保守区。

2.2DREB基因cDNA3’序列和5’序列的获得

经序列比对，利用已获得的DREB基因同源片段，设计基因特异引物；利用基因特异引物3HY1-GSP1和3HY1-GSP2分别与3’通用引物Q1、Q2进行3’RACE扩增，电泳检测，得到1条约1000bp的扩增产物(图2)，测序结果表明，该片段为969bp，且5’端序列与原同源片段部分重叠，判断为目标DREB基因的3’端序列。

利用基因特异引物5HY1-GSP1和5HY1-GSP2分别与GeneRacer 5’Primer和5’NestedPrimer进行5’RACE扩增，电泳检测得到1条约900bp的扩增产物(图3)，测序结果表明，该片段为893bp，且3’端序列与原同源片段部分重叠，判断为目标DREB基因的5’端序列。

2.3DREB基因cDNA全长序列的获得

利用基因全长特异引物HY1-F1和HY1-F2分别与3’通用引物Q1、Q2，巢式PCR获得1条约1.7KB的扩增产物(图4)。测序结果表明，其全长序列为1601bp，序列比对结果显示，与多种植物DREB家族的基因有较高相似性，推断为新的DREB基因，命名为PeDREB2a。

2.4胡杨DREB基因的生物信息学分析

2.4.1DREB基因的序列特征分析及编码蛋白的结构功能预测

利用DNAMAN软件对PeDREB2a基因的全长cDNA序列进行分析，结果表明：该基因序列全长为1601bp，完整开放阅读框1125bp，编码375个氨基酸，5`-UTR和3`-UTR分别包括151bp和322bp。通过利用Compute pI/Mw tool软件预测其分子量为41.7kDa，等电点为6.16。SMART软件对PeDREB2a编码的蛋白功能分析表明，该蛋白含有一个典型的AP2/EREBP结构域，该结构域由58个氨基酸组成，在AP2/EREBP结构域的前端存在一个核定位信号(NLS)，它引导该蛋白定位于细胞核；并且发现在其序列中存在两个丝氨酸富集区和一个谷氨酰胺富集区，该区域可能起到增强转录激活的功能；在C末端有酸性活化域的末端序列(PSXEIDW)保守区。

2.4.2DREB蛋白的三维空间结构预测

利用CHPmodels-2.0(http://genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0server)服务器来预测DREB2a蛋白的三维空间结构，结果显示：DREB2a蛋白的空间结构中具有1个α-螺旋，3个β-折叠组成，这是一个典型的DREB转录因子所具有的空间结构，这从蛋白所具有的空间结构的角度证明了该基因所编码的蛋白可能是DREB类转录因子(图5)。

2.4.3PeDREB2a蛋白与其它DREB2类蛋白的同源性比对及系统进化树分析

植物中的DREB类基因可以分为两大类，一类是由低温诱导的DREB1类转录因子；另一类是由干旱、高盐环境胁迫诱导的DREB2类转录因子。通过DNAMAN软件对胡杨PeDREB2a基因与其它已经克隆的DREB基因进行系统进化树分析，结果表明：PeDREB2a基因主要与DREB2类转录因子聚在一起，并且与双子叶植物的DREB2类转录因子的亲缘关系更近。

因此，将克隆到的DREB转录因子基因PeDREB2a主要与植物中的DREB2类转录因子进行同源性比对分析。序列比对结果显示：该转录因子基因全序列在蛋白水平上与其它植物DREB2类蛋白的同源性不高，一致性约为33.42％，仅在AP2/EREBP结合域中有高度保守性。并且发现DREB类转录因子第14位的缬氨酸(V14)非常保守，而第19位的氨基酸并不保守，有的为谷氨酸(E19)，有的为亮氨酸(L19)。进一步证明在DREB相关蛋白中决定DNA结合特异性方面，V14的作用明显要比E19和L19重要。

2.5胡杨DREB2a基因的基因组DNA结构分析

以胡杨基因组DNA和cDNA为模板，以Gn-HY1(F)、Gn-HY1(R)为引物对PeDREB2a进行PCR扩增，得到1条约1.5Kb的扩增产物；经回收测序表明，这条带为1303bp。测序结果分析显示，PeDREB2a基因无内含子(图6)。

2.6DREB基因在不同胁迫条件下的表达模式分析

对胡杨短枝分别进行低温、高盐和干旱(PEG)等胁迫处理，在不同处理时间，分别提取其叶片总RNA，反转录获得cDNA。半定量RT-PCR检测结果显示，当用250mM NaCl高盐溶液处理后，PeDREB2a基因在转录水平明显受高盐胁迫诱导，盐处理0.5h后表达量就开始提高，随着处理时间的延长，表达量迅速增加，到3h达到最大值。而短枝处于模拟干旱条件的时候(20％PEG溶液)，PeDREB2a基因可以被其诱导表达，而且较高盐处理先达到峰值，在处理6h后基因表达量达到最大，然后又迅速下降。在用4℃低温处理后，结果显示该基因也受到低温的诱导表达，而且变化也比较明显，在0.5h就已经诱导表达，3h表达量达到最高，在随后的处理中又逐渐减弱，表明该基因受到干旱、高盐以及低温非生物胁迫环境的诱导表达。用脱落酸ABA处理中PeDREB2a在转录水平上的表达基本上没有变化，这也说明其不依赖于ABA的信号调节途径。用激素NAA诱导表达的要比GA3和BA诱导表达时间提前，0.5h时就已经明显表达，而且其后的整个过程中诱导表达量又明显降低，而用GA3和BA处理中都在12h和24h才诱导表达，这些均说明这三种激素也诱导PeDREB2a基因的表达。由此看出，PeDREB2a对非生物胁迫具有明显的应答(图7)。综上所述，PeDREB2a基因能被高盐、干旱和低温所诱导表达，并且这种诱导作用并不依赖于ABA信号调节途径。

利用生物学软件对PeDREB2a基因进行分析，发现该基因的AP2/EREBP结构域中的第14位存在着已被证实与DRE顺式作用元件具有特异性结合机制的功能性氨基酸，即缬氨酸(14V)。而第19位均为亮氨酸，并非谷氨酰胺，这也充分说明19位氨基酸的非保守性，进一步证明在DREB相关蛋白中决定DNA结合特异性方面，V14的作用明显要比E19和L19重要。此外，根据植物DREB受不同条件的诱导表达，植物中的DREB类转录因子可分为DREB1和DREB2两种类型。对不同植物DREB转录因子亲缘关系的分析表明，PeDREB2a被归类在双子叶植物的DREB2转录因子类中，与大豆的GmDREB关系最近。

研究表明，在DREB转录因子的C-端一般存在一个转录激活域，它们以富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸或丝氨酸和苏氨酸为特征，此结构域是激活目标基因转录所必须的。在PeDREB2a转录因子基因C-端具有明显的转录激活域，推测该转录因子蛋白应该具有转录激活功能，其生物学功能有待进一步深入研究。同时推测PeDREB2a蛋白中的丝氨酸富集区可能通过位点的磷酸化作用分别调控蛋白的DNA结合域对DRE元件的结合能力和酸性激活域的转录激活能力。

试验例1 植物高效表达载体的构建及胡杨PeDREB2a基因在烟草中的相关功能验证

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

烟草NC89，由本实验室保存。

菌株及载体

大肠杆菌(E.coli)：DH5α                         本室保存

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404    本室保存

pUC-ST4A                                        本室保存

pCAMBIA2301                                     本室保存

pMD19-T克隆载体                                 TaKaRa

PUC19                                           TaKaRa

说明：pCAMBIA2301的全序列已公开于NCBI中AF234316 Binary vector pCAMBIA-2301。

2.1.3实验中所用试剂与药品

各种限制性内切酶、rTaq酶、ExTaq酶购自Takara公司，T4DNA连接酶购自New EnglandBiolabs，Taq酶购自北京普博欣生物技术公司；SuperScript^TMIII Reverse Transcriptase购自Invitrogen公司；TRNzol总RNA提取试剂购自北京天根科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根科技有限公司；Easy Pure Mini Plasmid Purification Kit购自北京全式金生物技术有限公司。

2.1.4培养基

LB细菌培养基、.YEB培养基和MS培养基按照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)所公开的方法进行配制；

MS选择培养基：MS基本培养基中加入6-BA(3.0mg/L)，NAA(0.2mg/L)，头孢拉定(500mg/L)及卡那霉素(100mg/L)。

MS生根培养基：MS基本培养基中加入头孢拉定(500mg/L)及卡那霉素(200mg/L)。

2.2方法

2.2.1引物设计与合成

设计合成含有酶切位点SalI和XbaI的引物p35SGKNOS-PeDREB2a(F)和p35SGKNOS-PeDREB2a(R)，引物序列见表14。

表14构建植物表达载体所用引物

2.2.2植物表达载体的构建

2.2.2.1植物高效表达载体p2MDK-PeDREB2a的构建

利用引物p35SGKNOS-PeDREB2a(F)和p35SGKNOS-PeDREB2a(R)从连接有全长PeDREB2acDNA的pMD19-T载体上扩增出完整的开放阅读框。扩增产物和载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶，构建植物高效表达载体p2MGK-PeDREB2a。

2.2.2.2重组质粒转化大肠杆菌DH5α及菌落PCR鉴定

方法同实施例1的2.2.3.6和2.2.3.7

2.2.2.3重组质粒的小量提取及酶切鉴定

2.2.3烟草的遗传转化

2.2.3.1农杆菌感受态细胞的制备及转化

按照《植物基因工程原理与技术》(王关林主编，大连师范大学出版社)所公开的方法进行农杆菌感受态细胞的制备及转化操作。

2.2.3.2含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定

挑取YEB平板上的单菌落，接种于5ml YEB液体培养基(含50mg/L Rif，100mg/L Kan)中，28℃培养1-2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR鉴定。

2.2.3.3烟草的遗传转化

1.将含有植物表达载体的农杆菌菌液均匀涂于YEB平板(含50mg/L Rif，100mg/L Kan)，1ml/板，28℃培养过夜；

2.用枪头轻轻刮取菌体，并转入MS液体培养基中，使悬浮液OD₆₀₀约为0.5；

3.取无菌苗的叶片，切去边缘和主要叶脉，切成0.5cm大小的方块；

4.将切好的外植体在农杆菌菌液(OD₆₀₀＝0.5)中浸泡5-10min；

5.用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入表面铺有一层滤纸的MS固体基本培养基，28℃，暗培养3d；

6.将材料转到含有Kan(100mg/L)的分化培养基中25℃培养(光周期为16h光照/8h黑暗)至抗性芽分化。

2.2.4转基因烟草的筛选

2.2.4.1Kan抗性苗的筛选

待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入生根培养基中，培养基中Kan浓度降至50mg/L以利于诱导生根。待幼苗生根后，将其转入新的生根培养基中，此时将Kan的浓度提高至200mg/L，用以降低转化植株的假阳性率，从而减少后续筛选的工作量。

2.2.4.2转基因烟草的DNA水平鉴定

利用CTAB法小量提取在含有Kan培养基中生长的生根烟草苗的总DNA，通过PCR检测进一步筛选阳性转化烟草植株。若扩增出了目标片段，而阴性对照中没有扩增出片段，初步证明目的基因整合到烟草基因组中。

2.2.4.3转基因烟草的RT-PCR检测

选择PCR确定的阳性转化株，剪取叶片，TRNzol提取总RNA，反转录获得cDNA作为模板，RT-PCR检测筛选阳性转化苗。方法参照第二章的2.2.1和2.2.8.4

2.2.5转基因烟草的耐胁迫分析

2.2.5.1转基因烟草的抗旱性分析

将大小生长一致的转PeDREB2a基因阳性烟草苗与转入p2MGK空质粒的对照烟草苗带根取出，将其转移至含有20％PEG的MS培养基中，在28℃的光照培养箱中培养，4天后，将根部盐水用无菌水洗净后，重新移入MS培养基，恢复生长14天，观察植株生长变化情况，并拍照记录实验结果。试验设3个重复。

2.2.5.2转基因烟草的耐盐性分析

将大小生长一致的转PeDREB2a基因阳性烟草苗与转入p2MGK空质粒的对照烟草苗带根取出，将其转移含有300mMNaCl的MS培养基中，在28℃的光照培养箱中培养，7-10天后观察植株生长变化情况，并拍照记录实验结果。试验设3个重复。

2.2.5.3转基因烟草的耐低温分析

将大小生长一致的转PeDREB2a基因阳性烟草苗与转入p2MGK空质粒的对照烟草苗置于-4℃冰箱中进行低温处理20h后转移至正常条件下培养，观察小苗是否能恢复正常生长，并拍照记录实验结果。试验设3个重复。

2.2.6转基因烟草在逆境条件下的生理生化指标测定

2.2.6.1保水性实验

剪取PCR检测呈阳性的转PeDREB2a的烟株和转p2MGK空质粒的对照烟株的自上而下第3片展开叶，C1-202AREA METER型叶面积仪测量叶面积，然后置滤纸上，室温条件下，自然失水7h，每隔半小时称量一次叶重，记录叶片失水情况，计算单位叶面积累计失水量。

2.2.6.2胞质总蛋白含量的测定

将洗去根部基质的转基因阳性烟草苗和转p2MGK空质粒的对照烟株分别放于含有20％PEG6000的MS溶液和含有300mmol/L NaCl的MS溶液中分别进行干旱和高盐处理，在处理7h和12h后，取第3和4片叶测定胞质总蛋白含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量。

1.实验原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，是一种比较好的蛋白质定量法。

2.蛋白质含量标准曲线绘制

参照文献所公开的方法绘制蛋白质含量标准曲线(高淑梅.TERF1在转基因水稻中得功能分析[D].2006年)

3.样品提取液中蛋白质浓度的测定

参照文献所公开的方法测定样品提取液中蛋白质的浓度(高淑梅.TERF1在转基因水稻中得功能分析[D].2006年)。

2.2.6.3脯氨酸含量的测定

1.实验原理

在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物，此产物在520nm波长下具有最大吸收峰，颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低，酸性氨基酸和中性氨基酸不能与酸性茚三酮反应，碱性氨基酸含量甚微，可以忽略不计。

2.脯氨酸含量标准曲线绘制

参照文献所公开的方法绘制脯氨酸含量的标准曲线(高淑梅.TERF1在转基因水稻中得功能分析[D].2006年)。

3.样品中脯氨酸含量的测定

参照文献所公开的方法测定样品中脯氨酸的含量(高淑梅.TERF1在转基因水稻中得功能分析[D].2006年)。

2.2.6.4可溶性糖含量的测定

1.实验原理

苯酚法测定可溶性糖原理：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。

2.可溶性糖含量的标准曲线绘制

参照文献所公开的方法绘制可溶性糖含量的标准曲线(高淑梅.TERF1在转基因水稻中得功能分析[D].2006年)。

3.样品中可溶性糖含量的测定

参照文献所公开的方法测定样品中可溶性糖的含量(高淑梅.TERF1在转基因水稻中得功能分析[D].2006年)。

3.实验结果与分析

3.1植物表达载体的构建

3.1.1高效表达载体p2MGK-PeDREB2a的构建

3.1.1.1通过PCR扩增，得到带有2个增强子的CaMV 35S启动子序列，两端分别带有HindIII和Pst I酶切位点，HindIII和PstI双酶切此片段与克隆载体PUC19，经T4连接酶连接得到载体PUC-35S.

3.1.1.2从植物表达载体pTΩ4A上PCR扩增得到两端分别带有EcoR I和Kpn I酶切位点的PolyA、NOS序列，EcoR I和Kpn I酶切此片段与载体PUC-35S，经T4连接酶连接得到载体PUC-35SNOS。

3.1.1.3设计两条长链引物，两端分别带有Pst I酶切点，两条引物退火，得到带酶切位点粘性末端的Ω序列，Pst I酶切PUC-35SNOS，经T4连接酶与Ω连接得到载体PUC-Ω35SNOS。

3.1.1.4从载体163上PCR扩增得到两端分别带有BamH I和Kpn I酶切位点的GFP+KDEL序列，BamH I和Kpn I酶切此片段与载体PUC-Ω35SNOS，经T4连接酶连接得到载体PUC-Ω35SGKNOS。

3.1.1.5将连接到克隆载体PMD-19上的PeDREB2a与PUC-Ω35SGKNOS分别Sal I和Xba I双酶切，经T4连接酶与Ω连接得到载体PUC-Ω35SNOS-PeDREB2a。

3.1.1.6HindHI和EcoR I双酶切PUC-Ω35SNOS-PeDREB2a，回收小片段，连接到HindIII和EcoR I双酶切后的pCAMBIA2301植物表达载体上得到载体pGK.

3.1.1.7从载体PMD-MAR上PCR扩增得到两端分别带有EcoR I酶切位点的MAR序列，EcoRI酶切此片段与载体pGK，经T4连接酶连接得到载体pMGK。

3.1.1.8从载体PMD-MAR上PCR扩增得到两端分别带有HindIII酶切位点的MAR序列，HindIII酶切此片段与载体pMGK，经T4连接酶连接得到载体p2MGK-PeDREB2a。具构建流程见图8。

图9为p2MGK的图谱。

3.1.2重组质粒的菌落PCR鉴定

在三个重组质粒的转化LB(Kan+)平板上，分别挑取两个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果均为阳性，见图10。

3.1.3重组质粒的酶切鉴定

将PCR检测的阳性菌落转入LB(Kan+)液体培养基，37℃摇菌过夜，碱法小量提取重组质粒，进行酶切鉴定。p2MGK-PeDREB2a重组质粒被切出目标带，酶切结果正确，见图11。

3.2含有表达载体的农杆菌PCR检测

将重组质粒p2MGK-PeDREB2a转化农杆菌LBA4404以转化后的农杆菌的菌液作模板，未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR鉴定。检测结果表明，重组质粒已成功转入农杆菌中，见图12。

3.3转基因烟草的筛选和检测

3.3.1转基因烟草的DNA水平检测

采用经典的农杆菌介导法对烟草进行遗传转化。选择已经生根的Kan抗性苗，剪取其叶片，采用CTAB法提取烟草DNA，以烟草DNA为模板，以构建转化载体时设计的p35SGKNOS-PeDREB2a(F)和p35SGKNOS-PeDREB2a(R)引物为引物，采用PCR技术，对Kan抗性苗进行DNA水平的检测。结果表明，检测p2MGK-PeDREB2a转化的Kan抗性苗36株，PCR检测24株为阳性，阳性率67％，证明PeDREB2a已经整合到烟草基因组中。见图13。

3.3.2转基因烟草的RT-PCR检测

选取DNA水平鉴定的24个阳性烟草株为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果表明，24株p2MGK-PeDREB2a转化的烟草株中，18株检测为阳性，阳性率75％，见图14。

3.4转基因烟草对非生物胁迫的耐受分析

3.4.1转基因烟草的抗旱性分析

以p2MGK空质粒的烟草转化苗作对照，将转基因阳性烟草苗与对照小苗带根取出，将其转移到含有20％PEG的MS培养基中，进行抗旱性分析。处理6天后，可以观察到对照烟草植株叶片萎蔫较转基因烟草严重，转基因烟草叶片的心叶和上数第二片叶仍然保持一定膨压，而对照烟草叶片的心叶就已经开始萎蔫，叶缘卷曲、叶片下垂等现象，超过95％的对照烟草苗在含PEG的培养基上基本都死亡。将此烟草重新恢复培养20天后，可以看到转基因烟草植株叶片的恢复程度好于对照(图15)。

3.4.2转基因烟草的耐盐性分析

以p2MGK空质粒的烟草转化苗作对照，将转基因和对照烟草苗转入含有300mmol/L NaCl的MS培养基中，连续处理7d后，对照烟草苗叶片发生明显萎蔫，且部分发黄，萎蔫程度较严重，转基因植株发生萎蔫的程度较轻，恢复培养20天后，可以看到转基因烟草植株叶片的恢复程度明显好于对照(图16)，上述试验结果表明胡杨PeDREB2A基因在烟草中的过量表达确实能够提高转基因植株对盐胁迫的抗性。

3.4.3转基因烟草的耐低温分析

以p2MGK空质粒的烟草转化苗作对照，将对照与转基因植株放在-6℃低温光照培养箱中，处理8小时，观察对照与转基因植株的表型，发现对照植株的叶片冻伤萎蔫，转基因植株也有少数苗萎蔫但绝大多数仍然正常，然后放至正常条件下生长，3天后发生萎蔫的植株均黄化死去。对照与转基因植株冻害处理后的存活率分别为43.3％和83.4％。由此可见，转入PeDREB2a基因使植株的抗寒性得到了一定的提高。

3.5转基因烟草在逆境条件下的生理生化指标测定

3.5.1转基因烟草叶片保水性分析

由图17可以明显看出，剪叶7h后，转p2MGK空质粒的烟草对照苗叶片失水量大，萎蔫程度严重，叶面积明显缩小，叶片周围已经失水变干，呈无规则形状；而转PeDREB2a阳性苗叶片萎蔫较轻，仅叶边缘卷曲，叶色较亮，叶面积缩小程度没有对照严重，并且具有一定膨压，保持叶片基本形状。

由图18可知，对照与转基因阳性植株在剪叶后半小时内，叶片失水均较快，失水量大；半小时后，失水速率减慢，但累计失水不断增加。相比而言，总体上对照明显比转基因失水快，这也说明Pe DREB2a基因提高了烟草的叶片保水性能。通过两样本均值差异t测验，其均值差异显著性测验t＝4.3998，显著水平p＝0.0064，差异极显著。

3.5.2转基因烟草植株胞质总蛋白含量的测定

表15转基因植株与对照高盐胁迫下胞质总蛋白含量差异

表16转基因植株与对照干旱胁迫下胞质总蛋白含量差异

根据BSA浓度及其对应的OD595nm值制作标准曲线，所得回归方程y＝0.0715X-0.0412，R²＝0.9417，从而计算出样品胞质总蛋白的含量。由图19和图20可以看出，盐处理7h和干旱处理12h后，对照和转基因烟草叶片中的蛋白质含量都有所升高，相比较而言，处理后的蛋白质含量均比处理前的要高，由表15看出转基因株系6、7、10高盐前后胞质总蛋白含量增加百分比分别达到48.13％、40.95％、37.36％。而对照高盐前后含量增加百分比为19.83％、11.71％。证明转基因植株耐盐性高于对照植株。由表16可以得到结论：对照干旱前后对照胞质总蛋白含量增加百分比远不及转基因植株的，相差显著，证明了转基因植株抗旱性明显高于对照植株。

3.5.3转基因烟草植株脯氨酸含量的测定

表17转基因植株与对照高盐胁迫下脯氨酸含量差异

表18转基因植株与对照干旱胁迫下脯氨酸含量差异

脯氨酸作为一种有效的有机渗透调节物质，在干旱、低温、高温、冰冻、盐渍等非生物逆境胁迫中起着重要的作用。几乎所要的逆境都会造成植物体内脯氨酸的积累，并且积累的指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸常作为植物抗旱的一项生理指标。根据脯氨酸浓度测定的OD520nm值制作标准曲线，得到回归方程Y＝0.3167X-0.0595，R²＝0.9492，从而计算出样品中脯氨酸含量。研究结果见图20和21和表17、18，由图21和22直观看出高盐和干旱处理前后对照与转基因植株体内的脯氨酸都提高了，经过表17和18的分析，数据显示总体来说，转基因植株的增加百分比均高于对照，从而推出转基因植株的抗旱、耐盐性明显高于对照。

3.5.4转基因烟草植株可溶性糖含量的测定

表19转基因植株与对照高盐胁迫下可溶性糖含量差异

表20转基因植株与对照干旱胁迫下可溶性糖含量差异

逆境条件下植物体内常常积累大量的可溶性糖，它是一类渗透调节物质，植物通过渗透调节作用可提高其对逆境的抵抗能力。已有研究证明：在细胞的几种渗透调节物质中，对稳定渗透调节能力的相对贡献大小是K⁺＞可溶性糖＞其它游离氨基酸＞Ca²⁺＞Mg²⁺＞脯氨酸。因此，在干旱条件下，细胞内渗透调节物特别是K⁺和可溶性糖的积累是反映抗旱性强弱的有效指标之一。由柱状图(图23和图24)看出高盐和干旱处理后比处理之前植株体内的可溶性糖含量都有较明显的提高，通过计算比较转基因植株与对照在高盐和干旱胁迫下可溶性糖含量的差异，结果显示：转基因植株在胁迫处理后可溶性糖增加百分比均明显高于对照，并且有些转基因株系增加百分比已经达到155.68％，由此可以证明转基因植株的耐盐、抗旱能力明显高于对照。

植物对渗透胁迫和干旱的抗性一方面表现在逆境下的形态特征，另一方面，植物生理生化的变化也高度适应逆境抗性。脯氨酸的含量作为植物抗旱指标，成为衡量植物是否抗旱的生化依据，可溶性糖、胞质总蛋白作为渗透调节物质，在渗透胁迫下的积累，有助于植物细胞降低渗透势和水势，减少渗透胁迫对植物的危害，这些渗透调节物质的含量也成为植物抗渗透胁迫的重要指标。通过测定生理生化指标得出，转基因植株的可溶性糖、胞质总蛋白和脯氨酸含量高于对照，这些渗透调节物质的大量积累有助于减少渗透胁迫和干旱胁迫对植物的伤害，成为转基因植物抗渗透能力和抗旱能力提高的重要生化证据，也进一步说明过表达PeDREB2a基因可能通过调节渗透调节物质的含量提高转基因烟草的抗旱性和渗透胁迫抗性，以维持植株正常的生理生化功能。DREB转录因子对一系列抗逆功能基因的转录以及对脯氨酸和糖含量的促进作用说明DREB因子在植物抗逆反应中起着重要作用。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所深圳市园林科学研究所

<120>胡杨DREB2转录因子cDNA序列、含有该序列的表达载体、其应用

<130>KLPI0788

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1601

<212>DNA

<213>Populus euphratica

<400>1

ggtttgtttt tggtccctca aggttggttt ttgtgcaaaa aaacctcttc ttttatctgg    60

gttttttttt ttttctcctc ttcctttcgt ttgtaaaact ttcgtaattt tgccacctct   120

ttagttttgt ttcaagttct aattaacagg aatggcagca gctatcgata tctacaacac   180

aacagcgcca gttttttcag atccttgtag agaagaactc atgaaagcac ttgaaccttt   240

tatgaaaagt gcttcgccac caccaacctc cacttattct tcaccttctc cttcaacttc   300

tcctcctttc tcttcttacc cttcttgctt ttacaacaat aactctccca tctcttcata   360

tcccaacttg gaccttagct tttgctctcc aacgagcacc cagatgtttt ctaatgggtt   420

cttggattat aaccaaatgg gttttgagca aacaggtcca attgggctta accaccttac   480

accttcacaa atcctccaaa tccaagccaa aatccacttc caacaacaac agcagcagca   540

gaaaatggaa aatcttgcta ccacatcaca gtgtgtccat aaccgaaagg ctagtaacta   600

cttggctcca aaacctgtcc ctatgaaaca atctggtgct tctcctcaaa agccaacaaa   660

gctttataga ggagtcaggc agaggcattg gggaaaatgg gttgctgaga ttagacttcc   720

aaagaacaga actagactct ggcttggcac ttatgacaca gctgaagagg cagctttggc   780

ttatgataat gctgcttata agctgagagg agaatatgct aggcttaact ttccacatct   840

tcgccaccag ggagctcatg tgtctggtga atttggtgac tacaagcctc tccattcctc   900

tgttgatgca aagttacaag caatttgtca aagcctgggt ttgcaaaaac aggggaaaac   960

aagggagccc agttctgttg ctaattcaaa aaagaccgca acagctcctt tgcaagcaaa  1020

aattgaagat gattgttcta tgagaggtga attgaaaacg gagtacgaga attttggagt  1080

tgaggactat aaggtggaga tcccatcacc atcaccatca ccatcaccag cttcatctga  1140

cgaatcagtg gctggttctt cttcaccaga atctgagatt tctttcttgg attttcccgg  1200

ttctttacat tgggacgagt ttgagaattt tggtttggag aagtaccctt cagttgagat    1260

tgactggtca tccatctagg tcttgaatta ttaccatgta atcttttgtt tttaggttta    1320

ttttggcgtc tttcagtagc ttctgcaatg aagtttttgg catttgcaga agtggtgtta    1380

aggggtcagt cagttttaga ttctaagttc tattaactat gctgtcgata tgtacagtag    1440

gtcgctctct atctttggtc tagctggtac tttttttcct tgcttgacca tggatgagtt    1500

tccatgtttg gtctgtattt ttaggtcagg tgtaattaag catcagtctt cgaatatatc    1560

aatctagtcc aacttttctc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                        1601

<210>2

<211>375

<212>PRT

<213>Populus euphratica

<400>2

Met Ala Ala Ala Ile Asp Ile Tyr Asn Thr Thr Ala Pro Val Phe Ser

1               5                   10                  15

Asp Pro Cys Arg Glu Glu Leu Met Lys Ala Leu Glu Pro Phe Met Lys

            20                  25                  30

Ser Ala Ser Pro Pro Pro Thr Ser Thr Tyr Ser Ser Pro Ser Pro Ser

        35                  40                  45

Thr Ser Pro Pro Phe Ser Ser Tyr Pro Ser Cys Phe Tyr Asn Asn Asn

    50                  55                  60

Ser Pro Ile Ser Ser Tyr Pro Asn Leu Asp Leu Ser Phe Cys Ser Pro

65                  70                  75                  80

Thr Ser Thr Gln Met Phe Ser Asn Gly Phe Leu Asp Tyr Asn Gln Met

                85                  90                  95

Gly Phe Glu Gln Thr Gly Pro Ile Gly Leu Asn His Leu Thr Pro Ser

            100                 105                 110

Gln Ile Leu Gln Ile Gln Ala Lys Ile His Phe Gln Gln Gln Gln Gln

        115                  120                  125

Gln Gln Lys Met Glu Asn Leu Ala Thr Thr Ser Gln Cys Val His Asn

    130                  135                  140

Arg Lys Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Pro Lys Pro Val Pro Met Lys Gln

145                  150                  155                  160

Ser Gly Ala Ser Pro Gln Lys Pro Thr Lys Leu Tyr Arg Gly Val Arg

                165                  170                  175

Gln Arg His Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Pro Lys Asn

            180                  185                  190

Arg Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala

        195                 200                 205

Leu Ala Tyr Asp Asn Ala Ala Tyr Lys Leu Arg Gly Glu Tyr Ala Arg

    210                 215                 220

Leu Asn Phe Pro His Leu Arg His Gln Gly Ala His Val Ser Gly Glu

225                 230                 235                 240

Phe Gly Asp Tyr Lys Pro Leu His Ser Ser Val Asp Ala Lys Leu Gln

                245                 250                 255

Ala Ile Cys Gln Ser Leu Gly Leu Gln Lys Gln Gly Lys Thr Arg Glu

            260                 265                 270

Pro Ser Ser Val Ala Asn Ser Lys Lys Thr Ala Thr Ala Pro Leu Gln

        275                 280                 285

Ala Lys Ile Glu Asp Asp Cys Ser Met Arg Gly Glu Leu Lys Thr Glu

    290                 295                 300

Tyr Glu Asn Phe Gly Val Glu Asp Tyr Lys Val Glu Ile Pro Ser Pro

305                 310                 315                 320

Ser Pro Ser Pro Ser Pro Ala Ser Ser Asp Glu Ser Val Ala Gly Ser

                325                 330                 335

Ser Ser Pro Glu Ser Glu Ile Ser Phe Leu Asp Phe Pro Gly Ser Leu

            340                 345                 350

His Trp Asp Glu Phe Glu Asn Phe Gly Leu Glu Lys Tyr Pro Ser Val

        355                 360                 365

Glu Ile Asp Trp Ser Ser Ile

    370                 375