法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-02-02
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N27/416 授权公告日:20131211 终止日期:20161213 申请日:20071213
专利权的终止
2013-12-11
授权
授权
2009-12-09
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-10-14
公开
公开
技术领域
本发明涉及用于测定血液中受到葡萄糖和/或其衍生物干扰的1，5- 脱水葡萄糖醇的方法，具体涉及电化学测定血液中的1，5-脱水葡萄糖醇 的方法、用于测定的传感器芯片和包括所述传感器芯片的用于测定1，5- 脱水葡萄糖醇的试剂盒，所述方法的特征在于使用全血作为样本，并 且不需要血细胞分离。
背景技术
近年来，随着饮食变得更加丰富，糖尿病患者数目也在增加。为 了预防糖尿病患者的并发症，血糖水平需要保持在接近健康人的水平， 血糖水平自测装置被广泛使用，使得患者可以自己在家里监测血糖水 平。然而，由于血糖水平随膳食而改变，并且测定需要频繁进行，因 此患者遭受沉重的负担。对于患者而言，还由于缺乏知识而难以正确 解释测定值，并且严格控制血糖水平也并不容易。
同时，由于1，5-脱水葡萄糖醇不受膳食影响并且反映糖尿病患者 在过去一周内的血糖控制，因此糖尿病患者只要在家里通过“一周一 次”测定就能够准确了解他们的血糖控制。1，5-脱水葡萄糖醇自测试剂 盒将为患者提供极大好处，但使用血清或血浆作为样本来测定1，5-脱水 葡萄糖醇的常规方法需要血细胞分离而且不适合用于自测，因为测定 需要大量的样本。因此，还没有实现1，5-脱水葡萄糖醇自测试剂盒，包 括使用痕量原样全血作为样本的自测试剂盒。
专利文献1至9中所述的1，5-脱水葡萄糖醇测定方法使用血清或 血浆而不是全血作为样本，并且不涉及电化学测定。
此外，当将全血样本用于由和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)销售的动物用1,5AG试剂盒(日本化药株式会 社(Nippon Kayaku Co.，Ltd.))时，通过添加净化水或10mM乙二胺四乙 酸(EDTA)水溶液将血液溶解，再离心分离，用柱处理上清液，并通过 使用色素的比色法测定1，5-脱水葡萄糖醇。换句话说，这种方法不是在 不分离血细胞的情况下使用原样全血作为样本以电化学测定1，5-脱水 葡萄糖醇的方法。
通常使用血清或血浆而不是全血作为样本的原因在于血细胞中还 包含葡萄糖。即使当将用于消除或转化葡萄糖的试剂添加到全血中时， 葡萄糖仍保留在血细胞中而未消除或转化。由于葡萄糖在测定血液中 的1，5-脱水葡萄糖醇的步骤中通过细胞膜释放，因此不能完全消除葡萄 糖的干扰。在用于检测血液中的1，5-脱水葡萄糖醇的反应中，预期会受 到具有氧化-还原能力的红细胞中血色素的干扰。到目前为止，通过预 先酶促消除或转化葡萄糖而不分离血细胞，使用全血测定血液1，5-脱水 葡萄糖醇的方法是未知的。
此外，电化学测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法描述于非专利文献1 及专利文献10和11中。然而，非专利文献1描述了使用由过氧化氢 电极和酶固定膜组成的酶传感器测定尿中的1，5-脱水葡萄糖醇的方法。 然而，没有提及在共存有葡萄糖等的全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的测 定。在专利文献10中，通过使用脱氢酶和吩嗪硫酸二甲酯作为电子受 体的电流分析法测定1，5-脱水葡萄糖醇。然而，只提到了1，5-脱水葡萄 糖醇的参比标准的例子，但没有关于在全血中测定的描述。在专利文 献11中，使具有氧化1，5-脱水葡萄糖醇的能力的酶发挥作用，并使用 过氧化氢电极电化学测定所产生的过氧化氢。然而，该测定中也使用 血清，这不是使用全血的测定方法。
同时，1，5-脱水葡萄糖醇是作为在1位的还原葡萄糖的化合物并具 有与葡萄糖极为相似的化学结构。因此，用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的 许多酶也与葡萄糖反应。血液包含比1，5-脱水葡萄糖醇高20倍或更多 的葡萄糖。因此，要测定1，5-脱水葡萄糖醇，必须通过某种方式消除或 转化葡萄糖，以使葡萄糖不应与用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶反应。 此外，当通过该转化产生的葡萄糖衍生物与用于测定1，5-脱水葡萄糖醇 的酶反应时，这些衍生物也必须被消除或转化。
葡萄糖通过如下方式来消除或转化，在专利文献1中，用葡萄糖 氧化酶氧化葡萄糖或用己糖激酶将葡萄糖磷酸化；在专利文献2中， 用葡萄糖氧化酶和葡糖酸内酯酶或葡萄糖脱氢酶和葡糖酸内酯酶氧化 葡萄糖；在专利文献3和4中，用己糖激酶、己糖磷酸异构酶和6-磷 酸果糖激酶或葡萄糖异构酶、果糖激酶和6-磷酸果糖激酶将葡萄糖转 化成果糖1，6-二磷酸；在专利文献5中，用葡萄糖激酶或己糖激酶将葡 萄糖磷酸化；及在专利文献6中，用使葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸 的酶将葡萄糖磷酸化，然后测定1，5-脱水葡萄糖醇。在这些文献中，葡 萄糖被转化为葡糖酸-1，5-内酯、葡萄糖-6-磷酸、葡糖酸、果糖-6-磷酸、 果糖1，6-二磷酸等。然而，到目前为止，通过用酶消除或转化全血中的 葡萄糖，然后用酶电化学定量全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的测定法是未 知的。
专利文献1：日本专利2983015号
专利文献2：JP-A-2001-78797
专利文献3：日本专利3170320号
专利文献4：日本专利3217180号
专利文献5：JP-A-2001-116756
专利文献6：日本专利2872983号
专利文献7：JP-A-63-185397
专利文献8：JP-A-10-191998
专利文献9：JP-A-8-70893
专利文献10：JP-A-7-67697
专利文献11：JP-A-62-79780
专利文献12：JP-A-5-304997
专利文献13：JP-A-63-22185
专利文献14：JP-A-2-268679
专利文献15：JP-A-2000-135079
专利文献16：JP-A-11-18760
专利文献17：JP-A-2000-175698
专利文献18：JP-A-10-179140
非专利文献1：Biomed.Chromatogr.，vol.7，p.41(1993)
发明内容
本发明要解决的问题
近来，对于临床实验室测试来说，称为即时检验(Point of Care Testing)的各种床边或门诊测试项目的快速测定和由患者自己在家中进 行的血糖水平测定已经日益实施。由于在这样的情况下使用离心机获 得血清或血浆是复杂的并且需要时间，因此在实际临床环境(clinical setting)中难以使用。尤其是，在由患者自己在家中进行的测定中，将 使用穿刺装置和样品采集装置采集的例如不超过几十μL的痕量血液用 作样品。因此，不能使用应用离心机获得血清的测定方法。由此，期 待使用原样全血作为样本测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法。
解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题进行了各种研究。结果，他们发现了 使用原样全血作为样本电化学测定血液中1，5-脱水葡萄糖醇的方法，并 且完成了本发明。
也就是说，本发明涉及下列内容。
(1)一种测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的方法，所述方法包括消 除或转化干扰测定的葡萄糖和/或其衍生物的步骤和测定1，5-脱水葡萄 糖醇的后续步骤，其中不分离血细胞而使用原样全血消除或转化葡萄 糖和/或其衍生物，然后不分离血细胞而让用于测定1，5-脱水葡萄糖醇 的酶发挥作用，以电化学测定1，5-脱水葡萄糖醇。
(2)上面(1)的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中所述用于测定 1，5-脱水葡萄糖醇的酶是氧化还原酶。
(3)上面(2)的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化还原 酶是吡喃糖氧化酶、L-山梨糖氧化酶或1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶。
(4)上面(3)的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化还原 酶衍生自假单孢菌(Pseudomonas)属或土壤杆菌(Agrobacterium)属。
(5)上面(1)至(4)中任一项的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中 在氧化还原介体的存在下，电化学测定所述1，5-脱水葡萄糖醇。
(6)上面(5)的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化还原 介体为锇络合物、醌化合物、二茂铁化合物、吩噻嗪化合物、吩噁嗪 化合物、吩嗪化合物、靛酚化合物、二苯胺化合物或酚化合物。
(7)上面(1)至(6)中任一项的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中 不分离血细胞，用酶从原样全血中消除或转化所述葡萄糖和/或其衍生 物。
(8)上面(1)至(7)中任一项的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中 在稳定剂的存在下，电化学测定所述1，5-脱水葡萄糖醇。
(9)上面(8)的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中所述稳定剂是 2-磺基苯甲酸或3-磺基苯甲酸。
(10)上面(1)至(9)中任一项的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中 通过电流分析法、电量分析法或循环伏安法来电化学测定所述1，5-脱水 葡萄糖醇。
(11)上面(1)至(10)中任一项的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其 中使用具有用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极和对电极的电极，电 化学测定所述1，5-脱水葡萄糖醇，所述用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工 作电极包含用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的氧化还原酶和氧化还原介体。
(12)上面(11)的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中使用差分电 极(differential electrode)，电化学测定1，5-脱水葡萄糖醇。
(13)上面(12)的测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，其中所述差分电 极是这样的电极，它具有用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极、用于 测定空白的工作电极和对电极，所述用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作 电极包含用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的氧化还原酶和氧化还原介体，所 述用于测定空白的工作电极包含氧化还原介体但不含用于测定1，5-脱 水葡萄糖醇的氧化还原酶。
(14)一种用于测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片，其 包括具有用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极和对电极的电极，所述 用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极包含用于测定1，5-脱水葡萄糖 醇的氧化还原酶和氧化还原介体。
(15)上面(14)的测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片， 其还包括用于消除或转化葡萄糖和/或其衍生物的试剂。
(16)上面(14)或(15)的测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的传感器 芯片，其包括差分电极，所述差分电极包括具有用于测定1，5-脱水葡萄 糖醇的工作电极、用于测定空白的工作电极和对电极的电极，所述用 于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极包含用于测定1，5-脱水葡萄糖醇 的氧化还原酶和氧化还原介体，所述用于测定空白的工作电极包含氧 化还原介体但不含用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的氧化还原酶。
(17)一种用于测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的试剂盒，其包括 上面(14)至(16)中任一项所述的传感器芯片、用于采血的穿刺装置和 1，5-脱水葡萄糖醇的测定装置。
(18)上面(17)的测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的试剂盒，其还 包括用于消除或转化葡萄糖和/或其衍生物的试剂。
本发明的有益效果
根据本发明，由于可以使用全血作为样本电化学测定1，5-脱水葡 萄糖醇，并且血细胞不需要分离，因此测定变得简单而无需使用离心 机等，这使得测定可由患者自己在家中进行。
实施本发明的最佳方式
下面，将详细解释本发明。
本发明是电化学测定血液中受到葡萄糖干扰的1，5-脱水葡萄糖醇 的方法，其特征在于，在测定血液中的1，5-脱水葡萄糖醇时，使用全血 作为样本而无需分离血细胞。具体地，本发明的测定1，5-脱水葡萄糖醇 的方法的特征在于，不分离血细胞，从原样全血中消除或转化葡萄糖 和/或其衍生物，然后不分离血细胞而让用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的 酶发挥作用，以电化学测定1，5-脱水葡萄糖醇。如上所述，由于用于测 定1，5-脱水葡萄糖醇的酶也对作为底物的葡萄糖起作用，因此需要消除 或转化葡萄糖和/或其衍生物以防止葡萄糖的干扰。
在本发明的测定方法中，消除或转化葡萄糖和/或其衍生物的步骤 和测定1，5-脱水葡萄糖醇的步骤可以连续进行或与其间的其它步骤依 次进行。
本发明使用的全血是处于采集状态的血液，其血细胞未分离，并 且可以包含用于采血的采血管中所含的抗凝剂、糖解抑制剂等，例如 肝素、氟化钠和一碘乙酸。当使用保存的血液时，优选通过含有氟化 钠和肝素的采血管采血。另外，本发明的全血还包括不使用采血管等， 而通过用于自测血糖水平的穿刺装置等采集的血液。采血部位没有特 别限制，包括指尖以及前臂外侧、腹壁或上臂外侧。采血量为例如50μL 或更少，优选为0.1-30μL。更优选地，3-20μL就足够了。
将葡萄糖和/或其衍生物消除或转化为不干扰本发明测定的物质 的步骤没有特别限制，只要它不影响血液中目标1，5-脱水葡萄糖醇的测 定即可。其例子包括专利文献1至9中所述的将葡萄糖和/或其衍生物 消除或转化为不干扰测定的物质的方法。更优选使用酶的方法，其例 子包括将葡萄糖酶促氧化或酶促磷酸化的方法。
用酶消除或转化全血中的葡萄糖已经取得进展，而没有与上面提 及的预期相反的问题，这使得能够如后面描述的实施例所示，测定全 血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
用于酶促氧化葡萄糖的方法的例子包括：包括用葡萄糖氧化酶氧 化葡萄糖的方法、包括在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的存在下，用葡萄糖脱氢酶氧化葡萄糖的方 法。用于酶促磷酸化葡萄糖的方法的例子包括：包括用己糖激酶或葡 萄糖激酶将葡萄糖磷酸化以转化成葡萄糖-6-磷酸的方法。根据用于测 定1，5-脱水葡萄糖醇的酶的类型，通过葡萄糖磷酸化产生的葡萄糖-6- 磷酸可能需要进一步转化。在这种情况下，其例子包括：包括在辅酶 NAD+或NADP+的存在下用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶将葡萄糖氧化成葡糖 酸内酯-6-磷酸的方法，包括在腺苷-5′-二磷酸(ADP)和腺苷-5′-三磷酸的 存在下使己糖激酶、磷酸己糖异构酶和6-磷酸果糖激酶起使用以将葡 萄糖转化为果糖-1，6-二磷酸的方法，和包括在核苷二磷酸(NDP)或核苷 三磷酸(NTP)的存在下使葡萄糖异构酶、果糖激酶和6-磷酸果糖激酶起 作用，以将葡萄糖转化为果糖-1，6-二磷酸的方法。
最重要的是，更优选用己糖激酶或葡萄糖激酶将葡萄糖磷酸化的 方法。例如，特别优选在镁离子、ATB、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮 酸激酶(PK)的存在下，通过使用己糖激酶或葡萄糖激酶的酶促环化方 法，将葡萄糖磷酸化的方法。
用于上述转化的酶没有特别限制，只要它们不需要1，5-脱水葡萄 糖醇作为底物即可，其例子包括根据IUPAC-IUB命名法，归类为葡萄 糖氧化酶(EC1.1.3.4)、、葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47、EC1.1.1.118、 EC1.1.1.119和EC1.1.99.10)、己糖激酶(EC2.7.1.1)、葡萄糖激酶 (EC2.7.1.2)、作为磷酸己糖异构酶的葡萄糖-6-磷酸酮醇异构酶 (EC5.3.1.9)、葡萄糖异构酶(EC5.3.1.18)、果糖激酶(EC2.7.1.4)和作为 6-磷酸果糖激酶的磷酸己糖激酶(EC2.7.1.11)的酶。也可以使用市售品。 使用NDP依赖性己糖激酶，特别是例如ADP依赖性己糖激酶作为己 糖激酶没有问题。
另外，在包括用葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶氧化葡萄糖的方法 中，也可以使用葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)，将产生的葡糖酸-1，5-内酯 完全转化为葡糖酸，如果必要，可以组合使用变旋酶(EC5.1.3.3)。
在本发明的测定方法中，将葡萄糖和1，5-脱水葡萄糖醇两者磷酸 化的己糖激酶或葡萄糖激酶也可以用于包括将1，5-脱水葡萄糖醇转化 成1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸并使用对1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸起作用 的酶测定的方法中。
通过例如使转化试剂和全血彼此接触，进行将葡萄糖和/或其衍生 物转化成不干扰本发明测定的物质。具体地，这些物质可以预先在容 器中混合，或者可以将转化试剂装载到后面所述的传感器芯片上。转 化试剂的例子包括由己糖激酶(HK)和/或葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶 (PK)、腺苷-5′-三磷酸(ATP)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、氯化镁或硫酸镁 和氯化钾组成的溶液和溶液的干燥试剂。
己糖激酶优选衍生自酵母，葡萄糖激酶优选衍生自嗜热脂肪芽孢 杆菌(Bacillus stearothermophilus)。所述转化试剂可以包含己糖激酶和 葡萄糖激酶两者或其中任何一种。己糖激酶和/或葡萄糖激酶在转化试 剂溶液中的浓度为1-500U/mL，优选为20-300U/mL。
丙酮酸激酶在转化试剂溶液中的浓度为1-500U/mL，优选为 20-300U/mL。ATP的浓度为1-200mM，优选为10-80mM。磷酸烯醇 丙酮酸的浓度为10-1500mM，优选为100-500mM。氯化镁或硫酸镁 的浓度为1-200mM，优选为5-50mM。氯化钾的浓度为1-200mM， 优选为5-50mM。
另外，向转化试剂中添加对各干扰物质起作用的酶如抗坏血酸氧 化酶、尿酸氧化酶或胆红素氧化酶有效防止除葡萄糖以外的其它干扰 物质干扰测定。例如，抗坏血酸氧化酶在转化试剂溶液中的浓度为 1-1000U/mL，优选为5-500U/mL。
下面将解释使用酶电化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的步 骤。测定方法的例子包括：包括用酶直接测定由氧化还原反应产生的 过氧化氢的方法和使用作为参与氧化还原反应的电子传递媒介的氧化 还原介体的方法。
酶的例子包括氧化1，5-脱水葡萄糖醇的酶，更优选氧化还原酶。 其例子包括根据IUPAC-IUB命名法，归类为吡喃糖氧化酶 (EC1.1.3.10)、L-山梨糖氧化酶(EC1.1.3.11)、L-山梨糖脱氢酶 (EC1.1.99.12)、1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(EC1.1.99.13)的酶。
氧化还原酶的例子包括：专利文献12所述由担子菌类真菌 (Basidiomycetous fungi)No.52(国际专利生物保藏机构，日本产业技术 综合研究所：保藏编号FERM P-10106)产生的吡喃糖氧化酶，专利文 献7所述的钝头多孔菌(Polyporus obtusus)ATCC26733等，专利文献13 所述由血红色陀螺孔菌(Trametes sanguinea)IFO4923产生的L-山梨糖 氧化酶、由氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)UV-10(国际专利生物 保藏机构，日本产业技术综合研究所：保藏编号FERM P-8422)产生的 L-山梨糖脱氢酶等，专利文献11所述由假单孢菌sp.NK-85001(国际专 利生物保藏机构，日本产业技术综合研究所：保藏编号BP-1037)产生 的1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶等，专利文献14所述由真菌如皮壳正青霉 (Eupenicillium crustaceum)IFO-8938产生的1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶 等，专利文献15所述由长枝木霉菌(Trichoderma longibrachiatum) KDK3003(国际专利生物保藏机构，日本产业技术综合研究所：保藏编 号FERM BP-6458)产生的1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶等，专利文献16所 述由水生拉恩杆菌(Rahnella aquatilis)474(国际专利生物保藏机构，日 本产业技术综合研究所：保藏编号FERM P-16158)、阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)340(国际专利生物保藏机构，日本产业技术综合 研究所：保藏编号FERM P-16157)和粘质沙雷菌(Serratia marcescens) 825(国际专利生物保藏机构，日本产业技术综合研究所：保藏编号 FERM P-16159)产生的1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶等，可以无需要电子受 体而使1，5-脱水葡萄糖醇脱氢的专利文献6所述由土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)NT1130菌株(国际专利生物保藏机构，日 本产业技术综合研究所：保藏编号FERM BP-5997)产生的1，5-脱水葡 萄糖醇脱氢酶，专利文献10所述由海黄嗜纤维菌(Cytophaga marinoflava)ATCC19326产生的D-葡糖苷-3-脱氢酶等，以及专利文献 17、18和12所述的酶。另外，也可以使用氧化1，5-脱水葡萄糖醇的其 它市售氧化还原酶。
其中，更优选吡喃糖氧化酶、L-山梨糖氧化酶和1，5-脱水葡萄糖 醇脱氢酶。
另外，在通过普通基因操纵技术识别并改进或修饰这些酶的基因 后，则使用重组大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)等产生的酶也可以用 于本发明的测定方法，只要它们是需要1，5-脱水葡萄糖醇作为底物的氧 化还原酶即可。
电化学测定方法的例子包括电流分析法(包括测定电流的方法)、电 量分析法(包括测定电量的方法)、电位扫描法和循环伏安法。其中，更 优选电流分析法和电量分析法。
可以使用金、铂、碳、钯、银或银-氯化银，在绝缘板上形成用于 电化学测定方法的电极。绝缘板材料的例子包括塑料如聚对苯二甲酸 乙二酯、聚碳酸酯和聚碳酸乙烯酯以及玻璃，更优选聚对苯二甲酸乙 二酯。可以通过丝网印刷、真空沉积、溅射等在该板上形成电极。在 这些方法中，更优选丝网印刷。具体地，优选的是，通过将导电碳墨 或银-氯化银丝网印刷到由聚对苯二甲酸乙二酯制成的板上，并在 100-150℃淬火所述板，从而形成电极。
作为用于本发明的电化学测定1，5-脱水葡萄糖醇的电极，可以使 用形成工作电极、对电极和参比电极的三电极或者形成工作电极和对 电极的双电极。通常，在使用三电极测定时，将电位施加到工作电极 上，使用参比电极作为参照，并测定在工作电极和对电极之间流动的 电流。在使用双电极测定时，使用对电极作为参比电极，将预定的电 位施加到工作电极上，使用对电极作为参照，并测定在工作电极和对 电极之间流动的电流。
各种方法均可用于电化学测定，本发明的例子包括：包括使用过 氧化氢电极直接测定所产生的过氧化氢的测定方法和使用作为参与氧 化还原反应的电子传递媒介的氧化还原介体的测定方法。
氧化还原介体的例子包括氧化介体和还原介体，更优选氧化介体。 其中，更优选锇络合物、醌化合物、二茂铁化合物、吩噻嗪化合物、 吩噁嗪化合物、吩嗪化合物、靛酚化合物、二苯胺化合物、酚化合物 等。锇络合物的例子包括[Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2及其聚合 物。醌化合物的例子包括苯醌、2-甲基苯醌、2，6-二甲基苯醌、2，6-二 氯苯醌、2，5-二羟基苯醌、2-羟基-1，4-萘醌、2-甲基-1，4-萘醌、2，3-二甲 氧基-5-甲基-1，4-苯醌、吡咯并喹啉醌(PQQ)和泛醌。二茂铁化合物的例 子包括二茂铁基PEG、二茂铁基TMA、N，N-二甲氨基甲基二茂铁和二 茂铁甲醇。吩噻嗪化合物的例子包括硫堇、亚甲蓝、亚甲基绿、10-(羧 甲基氨基羰基)-3，7′-双(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐、甲苯胺蓝O、天青I、 天青Z、天青A、新亚甲蓝和苯甲酰基无色亚甲蓝。吩噁嗪化合物的例 子包括麦尔多拉蓝。吩嗪化合物的例子包括吩嗪硫酸二甲酯、1-甲氧基 吩嗪硫酸二甲酯、番红和酚番红。靛酚化合物的例子包括2-二氯苯酚- 靛酚(DCIP)。二苯胺化合物的例子包括4，4′-双(二甲氨基)二苯胺、N-(羧 甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)-二苯胺钠盐、N-甲基-N-苯基-1，4-苯二 胺盐酸盐和N-甲基-N-(3-甲氧基苯基)-1，4-苯二胺盐酸盐。酚化合物的 例子包括对氨基苯酚。
此外，可以用于本发明的介体的例子包括铁菁化合物(铁氰化钾 等)、钌络合物或其聚合物、联吡啶化合物(甲基紫精等)、三苯基甲烷 化合物(孔雀绿、TPM-PS等)、苯并噻唑啉化合物(2-亚肼基-2，3-二氢-3- 甲基-6-苯并噻唑、其磺酸盐等)、菁化合物(棓花青、酞菁、藻青素等)、 偶氮化合物(品红J-3GL、黄C-Y9、黑C-BK4等)、联吡啶基偶氮化合 物(5-Br-PSAA、5-Br-PAPS、TAMSMB等)、苯胺及其衍生物(DAPS、 HALPS、ADPS、ALPS、TOOS、ALOS等)、聚苯胺及其衍生物、酚化 合物(对氨基苯酚等)、苯二胺化合物(Baliamine蓝B、2，3，5，6-四甲基- 对苯二胺等)、罗丹明化合物(罗丹明B等)、呫吨化合物(派洛宁Y、派 洛宁B、荧光素钠等)、异咯嗪化合物(核黄素、FAD等)、靛化合物(靛 蓝三磺酸、靛蓝胭脂红等)、菲咯啉化合物(浴铜灵磺酸钠、红菲绕啉磺 酸钠等)、磺酞化合物(甲基百里酚蓝等)、联苯胺化合物(TMBZ、 TMBZ·PS、DAB、茴香胺蓝等)、四唑鎓化合物(WST-1、MTT、Nitro-TB、 XTT等)、细胞色素C、光色素、铁氧化还原蛋白、EDTA、NAD和NADP。
在本发明的1，5-脱水葡萄糖醇的电化学测定中，将由电极负载的 化合物如上面提到的酶和氧化还原介体溶于净化水或合适的缓冲溶液 中作为电极试剂并涂布到电极上作为电极试剂溶液。
电极试剂中所含的上述氧化还原介体的浓度为例如大约0.01μM 至1M，优选为0.1μM至200mM，作为在通过溶于净化水或合适的 缓冲溶液中获得的要涂布到电极上的电极试剂溶液中的浓度。上述酶 的浓度为例如大约0.1-5000U/mL，优选为1-2000U/mL，作为在通过 溶于净化水或合适的缓冲溶液中获得的要涂布到电极上的电极试剂溶 液中的浓度。作为缓冲溶液，可以使用普通生化反应所用的缓冲液， 其例子包括2-吗啉基乙磺酸(MES)缓冲液、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基] 乙磺酸(HEPES)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)缓冲 液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris buffer)和磷酸盐缓冲液。pH为3至10， 优选为5至9。缓冲溶液的浓度为1mM至1M，优选为5-500mM。
所述电极试剂溶液优选包含低分子量化合物如磺基苯甲酸、糖和 糖醇，蛋白质如白蛋白，或亲水大分子化合物如羧甲基纤维素、聚乙 二醇、聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮作为稳定剂，所述稳定剂提高酶 和氧化还原介体的稳定性，导致在长时期内稳定测定1，5-脱水葡萄糖醇 和以有利的精确度测定血液中的1，5-脱水葡萄糖醇。磺基苯甲酸的优选 例子包括2-磺基苯甲酸和3-磺基苯甲酸。当低分子量化合物如磺基苯 甲酸被用作稳定剂时，其浓度为大约0.1-500mM，优选为大约1-100 mM，作为在要涂布到电极上的电极试剂溶液中的浓度。当亲水大分子 化合物如白蛋白被用作稳定剂时，其浓度为例如大约0.01-20％，优选 为大约0.02-10％，作为在要涂布到电极上的电极试剂溶液中的浓度。
优选使上面提到的电极负载上面提到的电极试剂。这可以通过已 知方法实现。例如，将预定量的上述电极试剂通过点涂、浸渍或旋涂 涂布到电极上，并干燥。另外，除了这样的物理吸附之外，可以将上 面提到的电极试剂化学结合到电极上。
为了负载到电极上，将上面提到的稳定剂添加到上面提到的电极 试剂溶液中，然后涂布并干燥，或者层压到负载着酶等的层上。
下面将解释差分电极。
差分电极是例如这样的电极，它具有负载氧化还原酶和氧化还原 介体试剂的工作电极(例如用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极)、负 载氧化还原介体试剂但不含氧化还原酶的工作电极(例如用于测定空白 的电极)和对电极，使用负载氧化还原酶和氧化还原介体试剂的工作电 极及负载氧化还原介体试剂但不含氧化还原酶的工作电极，同时测定 包含涉及氧化还原介体等的干扰物质的样本，并通过减去干扰所产生 的信号部分，除去干扰物质的影响，所述差分电极的结构不受限制， 只要起到这种作用即可。其例子包括在后面描述的实施例中的差分电 极，它具有用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极、用于测定空白的工 作电极和对电极，所述用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极包含用于 测定1，5-脱水葡萄糖醇的氧化还原酶和氧化还原介体，所述用于测定空 白的工作电极包含氧化还原介体。
这种使用差分电极的电化学测定方法被称为差分法，以葡萄糖为 目标的测定是已知的。在这种情况下，干扰物质是尿酸和抗坏血酸。 基于5500-33000μmol/L葡萄糖，尿酸的血液浓度为120-770μmol/L， 抗坏血酸的血液浓度为1-210μmol/L。这些浓度远远低于葡萄糖的血液 浓度。
同时，血液中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为6-300μmol/L，这远远低 于葡萄糖的浓度。在电化学测定血液中的1，5-脱水葡萄糖醇时，尿酸和 抗坏血酸同样是干扰物质。然而，这些物质的浓度几乎等于或超过1，5- 脱水葡萄糖醇的浓度。
也就是说，当干扰物质的浓度明显低于待测物质的浓度时所用的 差分法是已知的，但到目前为止，没有报导当干扰物质的浓度等于或 超过待测物质的浓度时所用的差分法。因此，差分法是否有效和即使 当存在浓度等于或超过1，5-脱水葡萄糖醇(待测物质)的浓度的干扰物质 (尿酸、抗坏血酸)时是否能够获得正确的测定结果是未知的。
本发明用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片由在绝缘板上形 成的上述电极、要与测定装置相连的接合部件、连接电极和接合部件 的导线部件、另外用于使电极面积保持恒定以使导线部件绝缘的保护 体(resist)(绝缘部件)等构成，还包括用于采集血液作为样本的开孔、血 液进入其中的空间、流体通道等。这种结构由膜材料如聚乙烯膜或聚 酰亚胺膜、粘合剂如熔性粘合剂、缠绕剂(taping agent)如双侧胶带等形 成。
也可以使用传感器芯片测定1，5-脱水葡萄糖醇，在传感器芯片中， 电极不负载电极试剂，并将样本和试剂预先混合并添加。然而，优选 包括这样的电极的传感器芯片，所述电极具有用于测定1，5-脱水葡萄糖 醇的工作电极和对电极，所述用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的工作电极包 含用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的氧化还原酶和氧化还原介体，更优选包 括差分电极的传感器芯片，所述差分电极具有用于测定1，5-脱水葡萄糖 醇的工作电极、用于测定空白的工作电极和对电极，所述用于测定1，5- 脱水葡萄糖醇的工作电极包含用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的氧化还原 酶和氧化还原介体，所述用于测定空白的工作电极包含氧化还原介体 但不含氧化还原酶。如果必要，所述对电极可以负载上面提到的电极 试剂。
另外，可以使用具有预处理部件的传感器芯片，所述预处理部件 包含实施将葡萄糖和/或其衍生物转化成不干扰测定的物质的步骤的试 剂。
本发明所用的传感器芯片的一个例子的简化图示于图1至3。
本发明还包括用于测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的试剂盒，所 述试剂盒至少由上面提到的传感器芯片、用于采血的穿刺装置和1，5- 脱水葡萄糖醇的测定装置组成。所述穿刺装置可以类似于血糖水平自 测装置上所附的穿刺装置。该试剂盒还可以包括将葡萄糖和/或其衍生 物转化成不干扰测定的物质的步骤中所用的试剂。
另外，这种用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的试剂盒可以具有用于采 集样品的装置、用于预处理的试剂、校正器等。用于采集样品的装置 没有特别限制，只要可以采集约几十μL或更少的全血即可，并且可以 类似于用于测定血细胞比容的毛细管。
下面，将参考下列实施例和参考例更具体地解释本发明。然而， 这些实施例仅显示本发明的一方面，并非限制本发明的范围。实施例 中使用通过已知方法获得的酶或市售的酶。
所有实施例及参考例9、10和11中所用的电化学检测器是由东方 技研株式会社(Toho Giken)制造的配有GPIB RS232C的8-CH多功能恒 电位仪(Multipotentiostat)型号PS-08，参考例7和8中所用的电化学检 测器是由东方技研株式会社制造的配有函数生成器FG-02的8-CH多功 能恒电位仪型号PS-08。
附图中的1，5AG指1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例1
1)葡萄糖转化试剂
在10.0mM MES缓冲液中，溶解各组分，在使用1N氢氧化钠水 溶液将pH调整到7.0后的组成为：17.6mM MgCl2、17.6mM KCl、175.7 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mM ATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK)、 75U/mL葡萄糖激酶、200U/mL抗坏血酸氧化酶、100mM氯化钠、0.1％ NaN3、0.1mM EDTA和0.06％牛血清白蛋白(BSA)，以制得葡萄糖转 化试剂。
2)电极试剂溶液
将23.6mM日本专利3713049号所述的锇(III)络合物([Os(III)(联吡 啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)、930U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自担子菌类真菌 No.52)和50mM 3-磺基苯甲酸按该组成溶于净化水中，制备电极试剂 溶液。
3)传感器芯片
将碳墨(产品名，Carbon Paste TU15ST：朝日化学研究所(Asahi Chemical Research Laboratory Co.，Ltd.))以10μm的厚度丝网印刷到由 聚对苯二甲酸乙二酯制成的基盘上，并在150℃淬火40分钟，以形成 工作电极和导线部件以及对电极和导线部件。然后，将保护体油墨(产 品名，CR18G-KF：朝日化学研究所)以20μm的厚度丝网印刷到除了 电极部件和与测定装置的结合处以外的部分上，并在130℃淬火15分 钟。由此制备了图1所示的电极11。
电极11在样本添加位置1上涂布4μL上面2)获得的电极试剂溶 液，并在50℃干燥13分钟，制备传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将通过将各20μL已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的后述 参考例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为3.8、7.8、15.8、 31.4和63.9μg/mL)添加到血浆中获得的5份样本与10μL葡萄糖转化 试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混合 物逐滴地涂布到电极11的样本添加位置1上。80秒后，在10秒内相 对于对电极将0.15V施加到工作电极上，并用电化学检测器(配有GPIB RS232C的8-CH多功能恒电位仪型号PS-08：东方技研株式会社)测定 接下来5秒后的电流值。由用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片获 得的库仑量与用于测定空白的传感器芯片获得的库仑量之间的差值和 1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立校正曲线。
5)1，5-脱水葡萄糖醇测定步骤
将各20μL尿酸水平几乎等于上面4)获得的样本的尿酸水平或者 测定样本具有低尿酸水平的来自3名正常健康受试者的全血与10μL 葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL 反应混合物逐滴地涂布到电极11的样本添加位置1上。80秒后，在 10秒内相对于对电极将0.15V施加到工作电极上，并用电化学检测器 测定接下来5秒后的电流值。使用上面4)建立的校正曲线，获得1，5- 脱水葡萄糖醇在3份全血样本中的量。结果示于表1。将4次测定的平 均值用于建立校正曲线的样本，并将1次测定的值用于所述样本。
参考例1
将来自实施例15)中的测定所用的3名正常健康受试者的相同全血 样本在3000rpm离心分离10分钟，并且按照下列参数，使用1，5-脱水 葡萄糖醇测定试剂(Lana 1，5AG Auto Liquid：日本化药株式会社)和自动 分析仪7150(日立制作所株式会社(Hitachi，Ltd.))测定上清液(血浆)中 的1，5-脱水葡萄糖醇。结果示于表1。
分析方法 2点法
读取点 24-50
样本体积 8μL
Lana 1，5AG Auto Liquid预处理试剂(R1) 240μL
Lana 1，5AG Auto Liquid发色试剂(R2) 120μL
温度 37℃
测定波长(副/主) 700/546nm
[表1]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与电极试剂反应时，1，5-脱水葡萄糖醇在全血 样本中的测得值(实施例1)与通过参考例1的已知测定方法获得的值非 常一致(相关系数，0.9881)，表明可以通过本发明测定全血中的1，5-脱 水葡萄糖醇。
实施例2
1)葡萄糖转化试剂
在10.0mM MES缓冲液中，溶解各组分，在使用1N氢氧化钠水 溶液将pH调整到7.0后的组成为：17.6mM MgCl2、17.6mM KCl、175.7 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mM ATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK)、 97U/mL己糖激酶和20U/mL抗坏血酸氧化酶溶解，以制得葡萄糖转 化试剂。
2)电极试剂溶液
(i)用于测定1，5-脱水葡萄糖醇
将23.6mM锇(III)络合物([Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)和 465.2U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自担子菌类真菌No.52)按该组成溶于净 化水中，制备电极试剂溶液。
(ii)用于测定空白
将23.6mM锇(III)络合物([Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)按该 组成溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
制备按照与实施例1的3)相同的方式制得的两个电极11，将各4 μL上面2)中用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或空白的电极试剂溶液涂布到 各电极的样本添加位置1上，并在50℃干燥13分钟，制备用于测定 1，5-脱水葡萄糖醇和空白的传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各20μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为9.4、18.8、37.5、 75.0和150.0μg/mL)添加到血浆中获得的5份样本与10μL葡萄糖转化 试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混合 物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇和空白的各电极11的样本 添加位置1上。80秒后，在10秒内相对于对电极将0.15V施加到工 作电极上，并用电化学检测器测定接下来5秒后的电流值。由用于测 定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片获得的电流值与用于测定空白的传 感器芯片获得的电流值之间的差值和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立校 正曲线。
5)1，5-脱水葡萄糖醇的测定
将各20μL用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的来自6名正常健康受试 者的全血与10μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。 然后，将各10μL反应混合物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇 和空白的各电极11的样本添加位置1上。80秒后，在10秒内相对于 对电极将0.15V施加到工作电极上，并用电化学检测器测定接下来5 秒后的电流值。将用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片获得的电流 值与用于测定空白的传感器芯片获得的电流值之间的差值与校正曲线 相比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在6份全血样本中的量。结果示于表2。 将4次测定的平均值用于建立校正曲线的样本，并将1次测定的值用 于所述样本。
参考例2
通过与参考例1相同的方式，测定与实施例2的5)中所测相同的 全血样本中的1，5-脱水葡萄糖醇。结果示于表2。
[表2]
当使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转化成不干扰测定 的物质，并不分离血细胞而使全血与电极试剂反应时，通过差分法获 得的1，5-脱水葡萄糖醇在全血中的测得值与通过参考例2的测定获得 的值非常相关(相关系数，0.8943)，表明可以通过本发明测定全血中的 1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例3
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)获得的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
(i)用于测定1，5-脱水葡萄糖醇
将23.6mM锇(III)络合物([Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)、930 U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自担子菌类真菌No.52)和50mM 3-磺基苯甲 酸按该组成溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
(ii)用于测定空白
将23.6mM锇(III)络合物([Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)和50 mM 3-磺基苯甲酸按该组成溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
通过与上面实施例2的3)相同的方式，制备用于测定1，5-脱水葡 萄糖醇的传感器芯片和用于测定空白的传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各20μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本的1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为9.5、19.6、39.6、 78.5和159.8μg/mL)添加到血浆中获得的5份样本与10μL葡萄糖转化 试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混合 物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇和用于测定空白的各电极 11的样本添加位置1上。80秒后，在10秒内相对于对电极将0.15V 施加到工作电极上，并用电化学检测器测定接下来5秒后的电流值。 由用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片获得的电流值与用于测定 空白的传感器芯片获得的电流值之间的差值和1，5-脱水葡萄糖醇的浓 度建立校正曲线。
5)1，5-脱水葡萄糖醇的测定
将各20μL用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的来自6名正常健康受试 者的全血与10μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合，并使混合物 静置5分钟。然后，将各10μL反应混合物逐滴地涂布到用于测定1，5- 脱水葡萄糖醇和用于测定空白的电极11的样本添加位置1上。80秒后， 在10秒内相对于对电极将0.15V施加到工作电极上，并用电化学检测 器测定接下来5秒后的电流值。将用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器 芯片获得的电流值与用于测定空白的传感器芯片获得的电流值之间的 差值与校正曲线相比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在6份全血样本中的量。 结果示于表3。将4次测定的平均值用于建立校正曲线的样本，并将1 次测定的值用于所述样本。
参考例3
通过与参考例1相同的方式，测定与实施例3的5)所测相同的全 血样本中的1，5-脱水葡萄糖醇。结果示于表3。
[表3]
当使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转化成不干扰测定 的物质，并不分离血细胞而使全血与电极试剂反应时，通过差分法(实 施例3)测得的1，5-脱水葡萄糖醇在全血中的值与通过参考例3的已知 测定方法测得的值非常相关(相关系数，0.9982)，表明可以通过本发明 测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。另外，结果清楚地显示比上面实施例 2(相关系数，0.8943)更好的相关性。也就是说，已经证实通过组合使 用稳定剂和差分法，以较好的精确度测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例4
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
(i)用于测定1，5-脱水葡萄糖醇
将11.8mM锇(III)络合物([Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)和 111.0U/mL 1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌sp.NK-85001)按 该组成溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
(ii)用于测定空白
为了制备电极试剂溶液，将组分溶于净化水中，使得组成应该为 11.8mM锇(III)络合物([Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)。
3)传感器芯片
制备按照与实施例1的3)相同的方式制得的两个电极11，将各4 μL上面2)获得的用于测定1，5-脱水葡萄糖醇和用于测定空白的电极试 剂溶液涂布到各电极的样本添加位置1上，并在50℃干燥8分钟，制 备用于测定1，5-脱水葡萄糖醇和用于测定空白的传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各20μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为24.2、49.3和98.8 μg/mL)添加到血浆中获得的3份样本与10μL葡萄糖转化试剂在 Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混合物逐滴 地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇和用于测定空白的各电极11的样 本添加位置1上。80秒后，在10秒内相对于对电极将0.15V施加到 工作电极上，并用电化学检测器测定接下来5秒后的电流值。由用于 测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片获得的电流值与用于测定空白的 传感器芯片获得的电流值之间的差值和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立 校正曲线。
5)1，5-脱水葡萄糖醇的测定步骤
将各20μL用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的来自4名正常健康受试 者的全血与10μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。 然后，将各10μL反应混合物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇 和用于测定空白的各电极11的样本添加位置1上。80秒后，在10秒 内相对于对电极将0.15V施加到工作电极上，并用电化学检测器测定 接下来5秒后的电流值。将用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片获 得的电流值和用于测定空白的传感器芯片获得的电流值之间的差值与 校正曲线相比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在4份全血样本中的量。结果示 于表4。将4次测定的平均值用于建立校正曲线的样本，并将1次测定 的值用于所述样本。
参考例4
通过参考例1的步骤，测定与实施例4所测相同的全血样本中的 1，5-脱水葡萄糖醇。结果示于表4。
[表4]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与包含1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶的电极试剂 反应时，通过差分法(实施例4)测得的1，5-脱水葡萄糖醇在全血中的值 与参考例4测定的值非常相关(相关系数，0.9974)，表明可以通过本发 明测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
参考例5
1)葡萄糖转化试剂
将各组分添加到10.0mM MES缓冲液中，在使用1N氢氧化钠水 溶液将pH调整到7.0后的组成为：17.6mM MgCl2、17.6mM KCl、175.7 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mM ATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK) 和97U/mL己糖激酶，以制得葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
为了制备具有两种组成的电极试剂溶液，将11.8mM锇(III)络合 物([Os(III)(联吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)、930U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自 担子菌类真菌No.52)和50mM 2-磺基苯甲酸(参考例5-1)或50mM 3- 磺基苯甲酸(参考例5-2)按该组成溶于净化水中。指定未添加磺基苯甲 酸的电极试剂溶液制备为参考例5-3。
3)传感器芯片
通过与上面实施例1的3)相同的方式制备用于测定1，5-脱水葡萄 糖醇的传感器芯片。
4)测定步骤
在第0天(就在制备后)和在室温和大约20％的湿度下贮存5天后 使用上面3)制备的传感器芯片，将各20μL包含0μg/mL和50μg/mL 1，5-脱水葡萄糖醇的样品与10μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混 合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混合物逐滴地涂布到各电极 11的样本添加位置1上。80秒后，在10秒内相对于对电极将0.15V 施加到工作电极上，用电化学检测器测定接下来5秒后的电流值。4次 测定的平均值和标准偏差及变化率示于表5-1和5-2。
[表5-1]
[表5-2]
在参考例5-1和5-2中，变化率(第5天的平均电流值/第1天的平 均电流值)低于参考例5-3，显示电流值随时间的上升受到了抑制。另外， 标准偏差小，表明测定的可靠性，也就是说测定的精确度得到了改善。 这些结果证实了将稳定剂添加到电极试剂中的效果，所述稳定剂可以 用于电化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例5
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)制备的葡萄糖转化试剂。
2)预处理步骤(用于1，5-脱水葡萄糖醇和空白的普通测定)
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各10μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为3.8、7.8、15.8和 31.4μg/mL)添加到血浆中获得的4份样本或4份人全血样本与10μL 葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。
3)电极测定前的步骤
(i)1，5-脱水葡萄糖醇测定步骤
向经过上述预处理步骤后的溶液中连续添加5μL其中溶解了22.0 mM 2，6-二甲基苯醌的100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和5μL其中溶解 了200U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自担子菌类真菌No.52)的100mM磷 酸盐缓冲液(pH 7.0)，混合，并静置5分钟。
(ii)空白测定步骤
向经过上述预处理步骤后的溶液中连续添加5μL其中溶解了22.0 mM 2，6-二甲基苯醌的100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和5μL 100mM磷 酸盐缓冲液(pH 7.0)，混合，并静置5分钟。
4)使用传感器芯片的测定步骤
将碳墨(产品名，Carbon Paste TU15ST：朝日化学研究所)以10μm 的厚度丝网印刷到由聚对苯二甲酸乙二酯制成的基盘上，作为工作电 极和导线部件、对电极和导线部件以及参比电极和导线部件，并在150 ℃淬火40分钟。然后，将保护体油墨(产品名，CR18G-KF：朝日化学 研究所)以20μm的厚度丝网印刷到除了电极部件与测定装置之间的接 合部件以外的部分，并在130℃淬火15分钟，制备图2所示的电极12。
将各15μL上面3)获得的反应混合物逐滴地涂布到电极12的样本 添加位置1上，使用参比电极作为参照，在10秒内施加0.5V，在5 秒后，用电化学检测器测定用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片和 用于测定空白的传感器芯片的电流值。
5)1，5-脱水葡萄糖醇的量的计算
从使用用于建立1，5-脱水葡萄糖醇校正曲线的样本，通过上述步 骤测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片获得的电流值中减去用于测定 空白的传感器芯片获得的电流值，由所得的电流值和1，5-脱水葡萄糖醇 的浓度建立校正曲线。
对于4份人全血样本，从用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯 片获得的电流值中减去用于测定空白的传感器芯片获得的电流值，同 样将所得的电流值与校正曲线相比，获得全血中的1，5-脱水葡萄糖醇的 量。结果示于表6。将4次测定的平均值用于建立校正曲线的样本和所 述样本两者。
参考例6
通过与参考例1相同的方式，测定与实施例5所测相同的全血样 本中的1，5-脱水葡萄糖醇。结果示于表6。
[表6]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与未负载到电极上的电极试剂反应时，1，5-脱 水葡萄糖醇在全血中的测得值(实施例5)与通过参考例6的已知测定方 法测得的值非常一致(相关系数，0.9941)，表明可以通过本发明测定全 血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
参考例7
根据Denki Kagaku Vol.63，No.10，p.906-913(1995)所述用于评价 酶和介体的反应速度的方法，检查上述衍生自担子菌类真菌No.52的 吡喃糖氧化酶和表7所列的氧化还原介体与1，5-脱水葡萄糖醇的反应。
将碳墨(产品名，Carbon Paste TU15ST：朝日化学研究所)以10μm 的厚度丝网印刷到由聚对苯二甲酸乙二酯制成的基盘上，作为工作电 极和导线部件以及对电极和导线部件，将银-氯化银油墨(产品名， Electrodag PE-409：埃奇森公司(Acheson))以10μm的厚度丝网印刷作 为参比电极和导线部件，并将它们在150℃淬火40分钟。然后，将保 护体油墨(产品名，CR18G-KF：朝日化学研究所)以20μm的厚度丝网 印刷到除了电极部件与测定装置之间的接合部件以外的部分，并在130 ℃淬火15分钟，制备图3所示的电极13。
使用电化学检测器(配有函数生成器FG-02的8-CH多功能恒电位 仪型号PS-08：东方技研株式会社)进行电化学测定。
将10μL包含20U/mL吡喃糖氧化酶和60μM表7所列的氧化还 原介体的水溶液放到电极13上，电极13在样本添加位置1处与电化 学检测器相连，使用电极13的参比电极作为参照，以1mV/秒从-0.5V 至+1V扫描电位，并通过循环伏安法测定氧化电流值Id。然后，将10 μL包含20U/mL吡喃糖氧化酶、底物(500μg/mL 1，5-脱水葡萄糖醇)和 60μM表7所列的氧化还原介体的水溶液放到电极13的样本添加位置 1上，使用电极13的参比电极作为参照，以1mV/秒从-0.5V至+1V 扫描电位，并通过循环伏安法测定催化电流值Ik。通过将催化电流值 Ik除以只存在氧化还原介体时的氧化电流值Id获得的值Ik/Id，比较氧 化还原介体与酶的反应速度。
各氧化还原介体的Ik/Id结果示于表7。
[表7]
*Nitro-TB：3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1-1′-联苯)-4，4′-基]-双[2-(4-硝基苯 基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物]
表7显示吡喃糖氧化酶与各种氧化还原介体如锇络合物、二茂铁 化合物、醌化合物、吩噻嗪化合物、吩噁嗪化合物、吩嗪化合物、二 苯胺化合物、靛酚化合物和酚化合物快速反应。这些结果表明，通过 使用这些氧化还原介体和吡喃糖氧化酶的方法，例如实施例1至3的 方法，可以电化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
参考例8
通过与参考例7相同的方式，检查上述1，5-脱水葡萄糖醇与表8 所列的氧化还原介体的反应。
通过与参考例7相同的方式制备电极13。
将10μL包含20U/mL 1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌 sp.NK-85001)和60μM表8所列的氧化还原介体的水溶液放到电极13 上，电极13在样本添加位置1处与电化学检测器相连，使用电极13 的参比电极作为参照，以1mV/秒从-0.5V至+1V扫描电位，并通过循 环伏安法测定氧化电流值Id。然后，将10μL包含20U/mL 1，5-脱水葡 萄糖醇脱氢酶、底物(500μg/mL 1，5-脱水葡萄糖醇)和60μM表8所列 的氧化还原介体的水溶液放到电极13的样本添加位置1上，使用电极 13的参比电极作为参照，以1mV/秒从-0.5V至+1V扫描电位，并通 过循环伏安法测定催化电流值Ik。通过将催化电流值Ik除以只含氧化 还原介体而不含底物时的氧化电流值Id获得的值Ik/Id，比较氧化还原 介体与酶的反应速度。
各氧化还原介体获得的Ik/Id结果示于表8。
[表8]
表8显示1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶与各种氧化还原介体如锇络合 物、二茂铁化合物、醌化合物、吩噻嗪化合物、吩噁嗪化合物、吩嗪 化合物、二苯胺化合物、靛酚化合物和酚化合物快速反应。这些结果 表明，通过使用这些氧化还原介体和1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶的方法， 例如实施例4的方法，可以电化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
参考例9
1)葡萄糖转化试剂
将各组分添加到50mM MES缓冲液中，在使用1N氢氧化钠水溶 液将pH调整到7.0后的组成为：14.8mM MgCl2、99.2mM KCl、48mM 磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、2mM ATP、20U/mL丙酮酸激酶(PK)、16U/mL 葡萄糖激酶、10U/mL抗坏血酸氧化酶、200mM氯化钠、0.2mM EDTA·2Na和1.2g/L BSA，以制得葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
为了制备电极试剂溶液(a)、(b)和(c)，将下列物质按该组成溶于100 mM MES缓冲液(pH 7.0)中：
(a)0.54mM二茂铁基PEG(同仁化学研究所株式会社(Dojindo Laboratories))；
(b)6.25U/mL辣根过氧化酶(东洋纺织株式会社(Toyobo Co.， Ltd.))；或者
(c)50U/mL吡喃糖氧化物酶(衍生自担子菌类真菌No.52)。
3)传感器芯片
首先，将10μL 0.5％水性羧甲基纤维素涂布到参考例7制备的电 极13的工作电极位置并在50℃干燥10分钟，使电极表面亲水。然后， 将3μL上面2)获得的电极试剂溶液(a)逐滴地涂布到亲水部件中并干 燥，将3μL电极试剂溶液(b)逐滴地涂布到其上并干燥，然后再逐滴地 涂布3μL电极试剂溶液(c)并干燥，制备传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各20μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0、10和50μg/mL) 添加到生理盐水中获得的3份样本与10μL葡萄糖转化试剂在 Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各15μL反应混合物逐滴 地涂布到3)的传感器芯片的电极13的样本添加位置1上并反应5分钟， 然后使用参比电极(银-氯化银)作为参照，施加0V，并用电化学检测器 测定5秒后的电流值。由电流值和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立校正曲 线，如图4所示。在图中，1,5AG指1，5-脱水葡萄糖醇。
获得的校正曲线显示具有有利的浓度依赖性的校正曲线。这些结 果表明，通过使用二茂铁基PEG和吡喃糖氧化酶的方法，例如实施例 1至3的方法，可以电化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
参考例10
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
将具有表9中的浓度的氧化还原介体和具有表9中的浓度的1，5- 脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌sp.NK-85001)按各自的组成溶 于净化水中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
将2μL上面2)获得的电极试剂溶液涂布到参考例7制备的电极 13的工作电极上并在50℃干燥5分钟，制备传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各10μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0、2.5、11.9、24.2 和49.3μg/mL)添加到0.38％柠檬酸钠溶液中获得的5份样本与5μL葡 萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL 反应混合物逐滴地涂布到电极13的样本添加位置1上，使用参比电极 (银-氯化银)作为参照，施加表9所列的各电位，用电化学检测器测定5 秒后的电流值，并由电流值和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立校正曲线。 这些校正曲线示于图5至13。
[表9]
*AGDH：1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶
获得的校正曲线均为浓度依赖性的平滑校正曲线。这些结果表明， 通过使用这些介体和1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶的电流分析法，可以电化 学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
参考例11
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)中获得的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
将具有表10所列浓度的氧化还原介体和具有表10所列浓度的 1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌sp.NK-85001)按各自的组成 溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
将2μL上面2)获得的电极试剂溶液涂布到参考例7制备的电极 13的工作电极上并在50℃干燥5分钟，制备传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各10μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0、2.5、5.0、11.9、 24.2和49.3μg/mL)添加到0.38％柠檬酸钠溶液中获得的6份样本与5 μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各 10μL反应混合物逐滴地涂布到电极13的样本添加位置1上，使用参 比电极(银-氯化银)作为参照，在10秒内施加表10中的各第一电位， 然后使用参比电极(银-氯化银)作为参照，在110秒内施加第二电位。 使用用于电量分析的电化学检测器，测定从开始施加第二电位起100 秒的库仑量，并由库仑量和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立校正曲线。校 正曲线示于图14至27。
获得的校正曲线均为浓度依赖性的平滑校正曲线。这些结果表明， 通过使用这些介体和1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶的电量分析法，可以电化 学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例6
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)中获得的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
将120μM硫堇乙酸盐(西格玛-奥德里奇日本公司(Sigma-Aldrich Japan K.K.))和40U/mL 1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌sp. NK-85001)按该组成溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
将2μL上面2)获得的电极试剂溶液涂布到参考例7制备的电极 13的工作电极上并在50℃干燥5分钟，制备传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各10μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0、2.5、5.0、11.9、 24.2、49.3和98.8μg/mL)添加到0.38％柠檬酸钠溶液中获得的7份样 本与5μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后， 将各10μL反应混合物逐滴地涂布到电极13的样本添加位置1上，使 用参比电极(银-氯化银)作为参照，在10秒内施加-0.1V，然后在110 秒内施加0V。使用电化学检测器测定从开始施加0V起100秒的库仑 量，并由库仑量和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立校正曲线。显示有利线 性的校正曲线示于图28。
5)1，5-脱水葡萄糖醇测定步骤
将各10μL来自用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的7名受试者的人全 血样本和5μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。 然后，将各10μL反应混合物逐滴地涂布到电极13的样本添加位置1 上，使用参比电极(银-氯化银)作为参照，在10秒内施加-0.1V，然后 在110秒内施加0V。使用电化学检测器测定从开始施加0V起100秒 的库仑量并与校正曲线相比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在7份全血样本中 的量。结果示于表11。结果是4次测定的平均值。
参考例12
为了比较，通过参考例1的步骤，测定与实施例6的5)所测相同 的全血样本中的1，5-脱水葡萄糖醇。结果示于表11。
[表11]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与包含硫堇乙酸盐的电极试剂反应时，1，5-脱 水葡萄糖醇在全血中的测得值(实施例6)与在参考例12中通过已知测 定方法测定的值非常一致(相关系数，0.9771)，表明可以通过本发明电 化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例7
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)中获得的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
(i)用于测定1，5-脱水葡萄糖醇
将50μM亚甲蓝(米山药品工业株式会社(Yoneyama Yakuhin Kogyo Co.，Ltd.))和100U/mL 1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢 菌sp.NK-85001)按该组成溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
(ii)用于测定空白
将50μM亚甲蓝(米山药品工业株式会社)按该组成溶于净化水中， 制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
将2μL上面2)获得的用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或用于测定空白 的电极试剂溶液涂布到参考例7制备的图3所示的两个电极13的工作 电极上并在50℃干燥5分钟，制备用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或用于 测定空白的传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各20μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0.6、2.8、5.0、10.0、 24.7和50.2μg/mL)添加到已知实际上不含1，5-脱水葡萄糖醇的绵羊血 清(日本生物检验实验室株式会社(Nippon Bio Test Lab.))中获得的6份 样本与10μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然 后，将各10μL反应混合物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或 用于测定空白的传感器芯片的电极13的样本添加位置1上，使用各传 感器芯片的参比电极(银-氯化银)作为参照，在10秒内施加-0.2V，然 后在110秒内施加-0.1V。使用电化学检测器测定从开始施加-0.1V起 100秒的库仑量。由从用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片的库仑 量中减去用于测定空白的传感器芯片的库仑量所获得的库仑量和1，5- 脱水葡萄糖醇的浓度建立校正曲线。显示有利线性的校正曲线示于图 29。
5)1，5-脱水葡萄糖醇测定步骤
将各20μL来自实施例6的7名受试者的全血和10μL葡萄糖转 化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混 合物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或用于测定空白的传感 器芯片的电极13的样本添加位置1上，并使用各传感器芯片的参比电 极(银-氯化银)作为参照，在10秒内施加-0.2V，然后在110秒内施加 -0.1V。使用电化学检测器(配有GPIB RS232C的8-CH多功能恒电位 仪型号PS-08：东方技研株式会社)测定从开始施加-0.1V起100秒的库 仑量，并将从用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的传感器芯片的库仑量中减去 用于测定空白的传感器芯片的库仑量所获得的库仑量与校正曲线相 比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在7份全血样本中的量。结果示于表12。 结果是4次测定的平均值。
参考例12
由于实施例7所用的样本是与实施例6相同的全血样本，因此将 实施例6的结果作为参考例12示于表12中。
[表12]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与包含亚甲蓝的电极试剂反应时，1，5-脱水葡 萄糖醇在全血中的测得值(实施例7)与在参考例12中通过已知测定方 法测定的值非常一致(相关系数，0.9658)，表明可以通过本发明电化学 测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例8
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)中获得的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
将120μM硫堇乙酸盐(西格玛-奥德里奇日本公司)和40U/mL 1，5- 脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌sp.NK-85001)按该组成溶于净 化水中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
将2μL上面2)获得的电极试剂溶液涂布到参考例7制备的电极 13的工作电极上并在50℃干燥5分钟，制备传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各10μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0.6、2.8、5.0、10.0、 24.7、50.2和103.9μg/mL)添加到绵羊血清(日本生物检验实验室株式 会社)中获得的7份样本与5μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合 并静置5分钟。然后，将各10μL反应混合物逐滴地涂布到电极13的 样本添加位置1上，使用参比电极(银-氯化银)作为参照，施加-0.1V， 使用电化学检测器测定5秒后的电流值，并由电流值和1，5-脱水葡萄糖 醇的浓度建立校正曲线。显示有利线性的校正曲线示于图30。
5)1，5-脱水葡萄糖醇测定步骤
将各10μL来自实施例6的7名受试者的全血和5μL葡萄糖转化 试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混合 物逐滴地涂布到电极13的样本添加位置1上，使用参比电极(银-氯化 银)作为参照，施加-0.1V，使用电化学检测器测定5秒后的电流值，并 将所得电流值与校正曲线相比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在7份全血样本 中的量。结果示于表13。结果是4次测定的平均值。
参考例12
由于实施例8所用的样本是与实施例6相同的全血样本，因此将 实施例6的结果作为参考例12示于表13中。
[表13]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与包含硫堇乙酸盐的电极试剂反应时，1，5-脱 水葡萄糖醇在全血中的测得值(实施例8)与在参考例12中通过已知测 定方法测定的值非常一致(相关系数，0.9700)，表明可以通过本发明电 化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例9
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)中获得的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
将120μM硫堇乙酸盐(西格玛-奥德里奇日本公司)和40U/mL 1，5- 脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌sp.NK-85001)按该组成溶于净 化水中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
将2μL上面2)获得的电极试剂溶液涂布到参考例7制备的电极 13的工作电极上，通过与参考例9相同的方式处理，并在50℃干燥5 分钟，制备传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各10μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0、5.0、11.9和 24.2μg/mL)添加0.38％柠檬酸钠溶液中获得的4份样本与5μL葡萄糖 转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应 混合物逐滴地涂布到电极13的样本添加位置1上，使用参比电极(银- 氯化银)作为参照，在110秒内施加0V，使用电化学检测器测定从开 始施加起100秒的库仑量，并由传感器芯片的库仑量和1，5-脱水葡萄糖 醇的浓度建立校正曲线。显示有利线性的校正曲线示于图31。
5)1，5-脱水葡萄糖醇测定步骤
将各10μL来自用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的6名受试者的人全 血和5μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后， 将各10μL反应混合物逐滴地涂布到电极13的样本添加位置1上，使 用参比电极(银-氯化银)作为参照，在110秒内施加0V，使用电化学检 测器测定从开始施加起100秒的库仑量，并将所得库仑量与校正曲线 相比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在6份全血样本中的量。结果示于表14。 结果是4次测定的平均值。
参考例13
为了比较，通过参考例1的步骤，测定与实施例9的5)所测相同 的全血样本中的1，5-脱水葡萄糖醇。结果示于表14。
[表14]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与包含硫堇乙酸盐的电极试剂反应时，1，5-脱 水葡萄糖醇在全血中的测得值(实施例9)与在参考例13中通过已知测 定方法测定的值非常一致(相关系数，0.9855)，表明可以通过本发明电 化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
实施例10
1)葡萄糖转化试剂
使用实施例1的1)中获得的葡萄糖转化试剂。
2)电极试剂溶液
(i)用于测定1，5-脱水葡萄糖醇
将100μM亚甲蓝(东京化成工业株式会社(Tokyo Kasei Kogyo))和 50U/mL 1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(衍生自假单孢菌sp.NK-85001)按该 组成溶于净化水中，制备电极试剂溶液。
(ii)用于测定空白
将100μM亚甲蓝(东京化成工业株式会社)按该组成溶于净化水 中，制备电极试剂溶液。
3)传感器芯片
制备参考例7制备和图3所示的两个电极13，将2μL上面2)获 得的用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或用于测定空白的电极试剂溶液涂布 到所述电极的工作电极上并在50℃干燥5分钟，制备用于测定1，5-脱 水葡萄糖醇或用于测定空白的传感器芯片。
4)建立校正曲线
为了建立1，5-脱水葡萄糖醇的校正曲线，将各20μL通过将已知 浓度的1，5-脱水葡萄糖醇制剂(在通过除了血细胞分离步骤之外的参考 例1的步骤获得的样本中1，5-脱水葡萄糖醇的浓度为0.6、10.0、50.2 和103.9μg/mL)添加到绵羊血清(Nippon Bio Test Lab.)中获得的4份样 本与10μL葡萄糖转化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后， 将各10μL反应混合物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或用于 测定空白的传感器芯片的电极13的样本添加位置1上，使用传感器芯 片的参比电极(银-氯化银)作为参照，在110秒施加-0.1V，并使用电化 学检测器测定从开始施加-0.1V起100秒的库仑量。由用于测定1，5- 脱水葡萄糖醇的传感器芯片获得的库仑量与用于测定空白的传感器芯 片获得的库仑量之间的差值和1，5-脱水葡萄糖醇的浓度建立校正曲线。 具有有利线性的校正曲线示于图32。
5)1，5-脱水葡萄糖醇测定步骤
将各20μL来自实施例9的6名受试者的全血和10μL葡萄糖转 化试剂在Eppendorf管中混合并静置5分钟。然后，将各10μL反应混 合物逐滴地涂布到用于测定1，5-脱水葡萄糖醇或用于测定空白的传感 器芯片的电极13的样本添加位置1上，使用传感器芯片的参比电极(银 -氯化银)作为参照，在110秒内施加-0.1V，使用电化学检测器测定从 开始施加-0.1V起100秒的库仑量，并将由从用于测定1，5-脱水葡萄糖 醇的传感器芯片的库仑量中减去用于测定空白的传感器芯片的库仑量 所获得的库仑量与校正曲线相比，获得1，5-脱水葡萄糖醇在6份全血样 本中的量。结果示于表15。结果是4次测定的平均值。
参考例13
由于实施例10所用的样本是与实施例9所用的相同的全血样本， 因此将实施例9的结果作为参考例13示于表15中。
[表15]
当不分离血细胞而使葡萄糖转化试剂对全血起作用以将葡萄糖转 化成不干扰测定的物质并与包含亚甲蓝的电极试剂反应时，通过差分 法测定的1，5-脱水葡萄糖醇在全血中的测得值(实施例10)与参考例13 中通过已知测定方法测定的值非常一致(相关系数，0.9964)，表明可以 通过本发明电化学测定全血中的1，5-脱水葡萄糖醇。
工业实用性
通过本发明用于测定1，5-脱水葡萄糖醇的方法，可以测定痕量全 血中的1，5-脱水葡萄糖醇，所述方法电化学测定1，5-脱水葡萄糖醇而不 使用离心机等。因此，本发明的测定方法可以用于在床边或门诊中快 速测定1，5-脱水葡萄糖醇和由患者自己在家中进行测定。
附图说明
图1是显示本发明所用电极11的简化图；
图2是显示本发明所用电极12的简化图；
图3是显示本发明所用电极13的简化图；
图4是参考例9建立的校正曲线；
图5是参考例10的表9中1号试验的校正曲线；
图6是参考例10的表9中2号试验的校正曲线；
图7是参考例10的表9中3号试验的校正曲线；
图8是参考例10的表9中4号试验的校正曲线；
图9是参考例10的表9中5号试验的校正曲线；
图10是参考例10的表9中6号试验的校正曲线；
图11是参考例10的表9中7号试验的校正曲线；
图12是参考例10的表9中8号试验的校正曲线；
图13是参考例10的表9中9号试验的校正曲线；
图14是参考例10的表10中1号试验的校正曲线；
图15是参考例10的表10中2号试验的校正曲线；
图16是参考例10的表10中3号试验的校正曲线；
图17是参考例10的表10中4号试验的校正曲线；
图18是参考例10的表10中5号试验的校正曲线；
图19是参考例10的表10中6号试验的校正曲线；
图20是参考例10的表10中7号试验的校正曲线；
图21是参考例10的表10中8号试验的校正曲线；
图22是参考例10的表10中9号试验的校正曲线；
图23是参考例10的表10中10号试验的校正曲线；
图24是参考例10的表10中11号试验的校正曲线；
图25是参考例10的表10中12号试验的校正曲线；
图26是参考例10的表10中13号试验的校正曲线；
图27是参考例10的表10中14号试验的校正曲线；
图28是实施例6建立的校正曲线；
图29是实施例7建立的校正曲线；
图30是实施例8建立的校正曲线；
图31是实施例9建立的校正曲线；和
图32是实施例10建立的校正曲线。
附图标记描述
1.样本添加位置
2.支撑体
3.工作电极
4.对电极
5.保护体
6.参比电极(碳墨)
6a.参比电极(银-氯化银油墨)
11.电极
12.电极
13.电极
机译： 全血中1，5-脱水葡萄糖醇的测定方法以及该方法中使用的传感器芯片和测定试剂盒
机译： 1,5-脱水葡萄糖醇全血的测定方法，使用的传感器芯片和测定试剂盒
机译： 1,5-脱水葡萄糖醇全血的测定方法，测定试剂盒和使用的传感器芯片
