适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法

摘要

本发明涉及一种适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法。适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：1)按羧甲基壳聚糖与L－半胱氨酸盐酸盐的质量比为1∶1～1∶2，选取羧甲基壳聚糖和L－半胱氨酸盐酸盐，分别配制成水溶液；混合，得到巯基化羧甲基壳聚糖，备用；2)制液体石蜡混合物；3)将巯基化羧甲基壳聚糖配成巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液；用带7#针头的针管将此溶液缓慢滴加至液体石蜡混合物中，得乳化体系；4)再向乳化体系中缓慢加入交联剂，得到白色的乳液；5)将得到的乳液离心分离，得到白色产物；6)白色产物洗涤、干燥，得到巯基羧甲基壳聚糖微凝胶。该方法工艺简单，该方法制备的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶具有良好的生物粘附性，对人体无副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法。

背景技术

与传统的给药形式相比，生物粘附制剂具有作用部位广泛、作用迅速、生物利用度高、给药方便，可随时终止用药及具有缓释作用等特点。羧甲基壳聚糖分子中的氨基、羟基可与粘液中的糖蛋白形成氢键而产生粘附作用，能延长药物在体内特定区域的滞留时间，持续释放药物，可打开粘膜细胞的紧密连接通道，并且对细胞膜无损伤。巯基化聚合物基于巯基与二硫键的交换反应，二硫键在聚合物和半胱氨酸含量丰富的粘液蛋白之间形成，并生成粘液凝胶层。羧甲基壳聚糖巯基化后可模仿自然机制中的糖蛋白分泌黏液(一种生物系统中最常见的结构)，粘附性能可大幅度的提高。微凝胶的尺寸比较小，可渗透到粘膜凝胶层来延长它们在粘膜上的停留时间。但目前常见的离子交联微凝胶稳定性不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法，该方法工艺简单，该方法制备的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶具有良好的生物粘附性，对人体无副作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)按羧甲基壳聚糖与L-半胱氨酸盐酸盐的质量比为1∶1～1∶2，选取羧甲基壳聚糖(不同分子参数的)和L-半胱氨酸盐酸盐，备用；将羧甲基壳聚糖在25～30℃下溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.02～0.03g/mL的羧甲基壳聚糖水溶液；羧甲基壳聚糖水溶液用浓度为1mol/L盐酸溶液调节pH为2.5～5.0，得羧甲基壳聚糖混合溶液；将L-半胱氨酸盐酸盐溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.1～0.2g/mL的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液；

将L-半胱氨酸盐酸盐水溶液滴加到羧甲基壳聚糖混合溶液中，搅拌，恒温震荡3h，静置12～24h，于浓度为1～5mmol/L盐酸溶液中透析48～96h，用无水乙醇洗涤，得到白色的固体；白色的固体在50～80℃下真空干燥，得到巯基化羧甲基壳聚糖，备用；

2)按羧甲基壳聚糖∶液体石蜡∶乳化剂Span80的配比＝1g∶150mL 7.0mL，选取液体石蜡和乳化剂，将液体石蜡中加入乳化剂，搅拌20～40分钟，使充分混合均匀，得液体石蜡混合物，备用；

3)将巯基化羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.02～0.03g/ml的巯基化羧甲基壳聚糖水溶液，用1mol/L的HCl溶液调节pH值为5.0～6.5，得巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液；用带7#针头的针管将巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液缓慢滴加至液体石蜡混合物中，高速搅拌反应20～40min，使乳化体系稳定，得乳化体系；

4)按羧甲基壳聚糖∶交联剂的配比＝1g∶5mL，选取交联剂，交联剂是质量浓度为0.05～2mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺(EDC)盐酸盐溶液(EDC盐酸盐溶于蒸馏水中成为EDC盐酸盐溶液)；再向乳化体系中缓慢加入交联剂，高速搅拌2～3h(所述高速搅拌是指转速为800～1500转/分钟)，得到白色的乳液；

5)将得到的乳液离心分离，得到白色产物；

6)按羧甲基壳聚糖∶石油醚∶无水乙醇的配比＝1g∶150∶50mL，选取石油醚和无水乙醇；白色产物分别用石油醚和无水乙醇分别洗涤2～3次，得淡黄色粉末状固体；淡黄色粉末状固体在25～40℃下真空干燥，得到巯基羧甲基壳聚糖微凝胶。

步骤1)所述的羧甲基壳聚糖水溶液中加入浓度为5mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺(EDC)盐酸盐溶液，按羧甲基壳聚糖∶浓度为5mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺(EDC)盐酸盐溶液的配比＝1g∶5mL，选取5mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺(EDC)盐酸盐溶液。

步骤1)所述的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液加入浓度为5mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺，按羧甲基壳聚糖∶浓度为5mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺的配比＝1g∶5mL，选取浓度为5mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。

本发明的有益效果是：

1、采用EDC盐酸盐作为催化剂催化自交联反应，避免了传统交联剂如戊二醛等对人体的副作用；本发明安全无毒(对人体无副作用)，而且用量微小，经济快捷。

2、从操作过程可知本发明提供的制备方法工艺安全、简单有效、符合环保要求。

3、羧甲基壳聚糖巯基化后可模仿自然机制中的糖蛋白分泌黏液——一种生物系统中最常见的结构，粘附性能可大幅度的提高(具有良好的生物粘附性)。巯基化羧甲基壳聚糖经EDC共价微凝胶不容易瓦解(稳定性高)而又具有优良的黏附性和渗透性。

4、本发明适用于粘膜给药系统。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法，它包括如下步骤：

1)称取脱乙酰度为42.61％、羧甲基取代度为0.154的羧甲基壳聚糖1g，28℃下溶于40mL蒸馏水中，得羧甲基壳聚糖水溶液(质量浓度为0.025g/mL)，用1mol/L盐酸溶液调节pH为5，得羧甲基壳聚糖混合溶液；再称取L-半胱氨酸盐酸盐1g，溶于10mL蒸馏水中，得L-半胱氨酸盐酸盐水溶液(质量浓度为0.1g/mL)；将L-半胱氨酸盐酸盐水溶液滴加到羧甲基壳聚糖混合溶液中，持续搅拌，恒温震荡3h，静置过夜(12h)，于1mmol/L盐酸溶液中透析，用无水乙醇洗涤，得到白色的固体；白色的固体50℃下真空干燥，得到巯基含量为120.32μmol/g的巯基化羧甲基壳聚糖(置磨口棕色瓶中于冰箱中4℃备用)；

2)取液体石蜡150mL，加入7.0mL乳化剂Span80(乳化剂司盘80)，搅拌20分钟，使充分混合均匀，得液体石蜡混合物，备用；

3)将巯基化羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.03g/mL的巯基化羧甲基壳聚糖水溶液，用浓度为1mol/L的HCl溶液调节pH值为5.5，得巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液；用带7#针头的针管将此巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液缓慢滴加至液体石蜡混合物中，高速搅拌反应20min，使乳化体系稳定，得乳化体系；

4)再向乳化体系中用带7#针头的针管缓慢加入5mL质量浓度为0.05mg/mL的EDC.HCl[即EDC盐酸盐]溶液作为交联剂(EDC盐酸盐溶于蒸馏水中成为EDC盐酸盐溶液)，高速搅拌2h，得到白色的乳液；

5)将得到的乳液离心分离，得到白色产物；

6)白色产物用石油醚150mL洗涤3次，用无水乙醇50mL洗涤2次，得淡黄色粉末状固体(4℃冷藏保存)；黄色粉末状固体25℃下真空干燥，得到巯基羧甲基壳聚糖微凝胶。

所得巯基羧甲基壳聚糖微凝胶在体外模拟胃液环境(pH值为1.0)中，对猪胃粘蛋白的粘附率达到68％；明显高于pH1.0条件下，脱乙酰度为42.61％，羧甲基取代度为0.154的羧甲基壳聚糖对猪胃粘蛋白的粘附率(48％)。在模拟结肠环境(pH值为7.4)中对猪胃粘蛋白的粘附率达到54％；明显高于pH7.4条件下，脱乙酰度为42.61％，羧甲基取代度为0.154的羧甲基壳聚糖对猪胃粘蛋白的粘附率(32％)。在pH7.4条件下24h内对BSA(牛血清白蛋白)的释放达到61％。

实施例2：

适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法，它包括如下步骤：

1)称取脱乙酰度为77.61％、羧甲基取代度为0.154的羧甲基壳聚糖1g，28℃下溶于40mL蒸馏水中，用浓度为1mol/L盐酸溶液调节pH为5，加入浓度为5mmol/L的EDC.HCl溶液5mL，得羧甲基壳聚糖混合溶液；再称取L-半胱氨酸盐酸盐1g，溶于10mL蒸馏水中，然后滴加到羧甲基壳聚糖混合溶液中，持续搅拌，恒温震荡3h，静置过夜(12h)，于浓度为1mmol/L盐酸溶液中透析，用无水乙醇洗涤，得到白色的固体；白色的固体在50℃下真空干燥，得到巯基含量为340.47μmol/g的巯基化羧甲基壳聚糖；

2)取液体石蜡150mL，加入7.0mL乳化剂Span80，搅拌20分钟，使充分混合均匀，得液体石蜡混合物，备用；

3)将巯基化羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.025g/mL的巯基化羧甲基壳聚糖水溶液，用浓度为1mol/L的HCl溶液调节pH值为6.0，得巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液；用带7#针头的针管将此巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液缓慢滴加至液体石蜡混合物中，高速搅拌反应20min，使乳化体系稳定，得乳化体系；

4)再向乳化体系中用带7号针头的针管缓慢加入5mL质量浓度为0.05mg/mL的EDC.HCl溶液作为交联剂，高速搅拌2h，得到白色的乳液；

5)将得到的乳液离心分离，得到白色产物；

6)白色产物用石油醚150mL洗涤3次，用无水乙醇50mL洗涤2次，得淡黄色粉末状固体；淡黄色粉末状固体在25℃下真空干燥，得到巯基羧甲基壳聚糖微凝胶。

所得巯基羧甲基壳聚糖微凝胶在体外模拟胃液环境(pH值为1.0)中，对猪胃粘蛋白的粘附率达到85％；明显高于pH1.0条件下，脱乙酰度为77.61％，羧甲基取代度为0.154的羧甲基壳聚糖对猪胃粘蛋白的粘附率(48％)。在模拟结肠环境(pH值为7.4)中对猪胃粘蛋白的粘附率达到64％；明显高于pH7.4条件下，脱乙酰度为77.61％，羧甲基取代度为0.154的羧甲基壳聚糖对猪胃粘蛋白的粘附率(32％)。在pH7.4条件下24h内对BSA的释放达到72％。

实施例3：

巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法，它包括如下步骤：

1)称取脱乙酰度为77.61％，羧甲基取代度为0.101的羧甲基壳聚糖1g，28℃下溶于40mL蒸馏水中，用浓度为1mol/L盐酸溶液调节pH在4.5，加入浓度为5mmol/L的EDC.HCl溶液5mL，得羧甲基壳聚糖混合溶液；再称取L-半胱氨酸盐酸盐2g，溶于10mL蒸馏水中，加入浓度为5mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺5mL，得L-半胱氨酸盐酸盐混合溶液；将L-半胱氨酸盐酸盐混合溶液滴加到羧甲基壳聚糖混合溶液中，持续搅拌，恒温震荡3h，静置过夜，于浓度为1mmol/L盐酸溶液中透析，用无水乙醇洗涤，得到白色的固体；白色的固体在50℃下真空干燥，得到巯基含量为680.12μmol/g的巯基化羧甲基壳聚糖；

2)取液体石蜡150mL，加入7.0mL乳化剂Span80，搅拌20分钟，使充分混合均匀，得液体石蜡混合物，备用；

3)将巯基化羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.03g/mL的巯基化羧甲基壳聚糖水溶液，用浓度为1mol/L的HCl溶液调节pH值为6.0，得巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液；用带7#针头的针管将巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液缓慢滴加至液体石蜡混合物中，高速搅拌反应20min，使乳化体系稳定，得乳化体系；

4)再向乳化体系中用带7号针头的针管缓慢加入5mL质量浓度为0.05mg/mL的EDC.HCl溶液作为交联剂，高速搅拌2h，得到白色的乳液；

5)将得到的乳液离心分离，得到白色产物；

6)白色产物分别用石油醚150mL洗涤3次，用无水乙醇50mL别洗涤2次，得淡黄色粉末状固体；淡黄色粉末状固体在25℃下真空干燥，得到巯基羧甲基壳聚糖微凝胶。

所得巯基羧甲基壳聚糖微凝胶在体外模拟胃液环境(pH值为1.0)中，对猪胃粘蛋白的粘附率达到128.34％；明显高于pH1.0条件下，脱乙酰度为77.61％，羧甲基取代度为0.101的羧甲基壳聚糖对猪胃粘蛋白的粘附率(48％)。在模拟结肠环境(pH值为7.4)中对猪胃粘蛋白的粘附率达到77％；明显高于pH7.4条件下，脱乙酰度为77.61％，羧甲基取代度为0.101的羧甲基壳聚糖对猪胃粘蛋白的粘附率(32％)。在pH7.4条件下24h内对BSA的释放达到82％。

实施例4：

适用于粘膜给药的巯基羧甲基壳聚糖微凝胶的制备方法，它包括如下步骤：

1)按羧甲基壳聚糖与L-半胱氨酸盐酸盐的质量比为1∶1.5(如羧甲基壳聚糖1g，L-半胱氨酸盐酸盐1.5g)，选取羧甲基壳聚糖和L-半胱氨酸盐酸盐，备用；将羧甲基壳聚糖在30℃下溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.03g/mL的羧甲基壳聚糖水溶液；羧甲基壳聚糖水溶液用浓度为1mol/L盐酸溶液调节pH为2.5，得羧甲基壳聚糖混合溶液；将L-半胱氨酸盐酸盐溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.2g/mL的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液；

将L-半胱氨酸盐酸盐水溶液滴加到羧甲基壳聚糖混合溶液中，搅拌，恒温震荡3h，静置24h，于浓度为5mmol/L盐酸溶液中透析96h，用无水乙醇洗涤，得到白色的固体；白色的固体在80℃下真空干燥，得到巯基化羧甲基壳聚糖，备用(置磨口棕色瓶中于冰箱中4℃备用)；

2)按羧甲基壳聚糖∶液体石蜡∶乳化剂Span80的配比＝1g∶150mL 7mL，选取液体石蜡和乳化剂，将液体石蜡中加入乳化剂，搅拌40分钟，使充分混合均匀，得液体石蜡混合物，备用；

3)将巯基化羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中配成质量浓度为0.03g/ml的巯基化羧甲基壳聚糖水溶液，用1mol/L的HCl溶液调节pH值为6.5，得巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液；用带7#针头的针管将巯基化羧甲基壳聚糖混合溶液缓慢滴加至液体石蜡混合物中，高速搅拌反应40min，使乳化体系稳定，得乳化体系；

4)按羧甲基壳聚糖∶交联剂的配比＝1g∶5mL，选取交联剂，交联剂是质量浓度为2mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺(EDC)盐酸盐溶液(EDC盐酸盐溶于蒸馏水中成为EDC盐酸盐溶液)；再向乳化体系中缓慢加入交联剂，高速搅拌3h(所述高速搅拌是指转速为800～1500转/分钟)，得到白色的乳液；

5)将得到的乳液离心分离，得到白色产物；

6)按羧甲基壳聚糖∶石油醚∶无水乙醇的配比＝1g∶150∶50mL，选取石油醚和无水乙醇；白色产物分别用石油醚和无水乙醇分别洗涤2次，得淡黄色粉末状固体(4℃冷藏保存)；淡黄色粉末状固体在40℃下真空干燥，得到巯基羧甲基壳聚糖微凝胶。

不同分子参数的羧甲基壳聚糖都能实现本发明，本发明所列举的各原料都能实现本发明，以及各原料的上下限取值、区间值都能实现本发明，本发明的工艺参数(如温度、时间、pH值等)的上下限取值以及区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。