腺病毒选择性互补复制的方法

摘要

腺病毒选择性互补复制的方法属生物医学领域，涉及使复制缺陷型腺病毒选择性、互补性地在肿瘤细胞内复制的方法。特点是两种复制缺陷型腺病毒互补性地拥有对方所缺失的一种早期基因，且其中一种复制缺陷型腺病毒的该早期基因由肿瘤特异性启动子控制，而另一复制缺陷型病毒带有前者缺乏的早期基因和肿瘤治疗基因，两者共同使用能使腺病毒在肿瘤细胞中选则性互补复制。该法能够选择性地杀伤肿瘤细胞，而又不会影响到正常细胞。本发明能够提高腺病毒携带目的基因对肿瘤进行基因治疗的安全性、靶向性和有效性。

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域。涉及两种复制缺陷型腺病毒选择性、互补性地在肿瘤细胞内复制方法的建立。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的最严重疾病之一，是全球主要的死亡原因。世界卫生组织报道，2007年全球癌症死亡人数达790万(约占所有死亡人数的13％)，预计癌症死亡人数将继续增加，2030年将有1200万人死于癌症。我国卫生部2008年4月公布的第三次居民死亡原因抽样调查结果显示，恶性肿瘤是我国城市人口死因首位(占死亡总数25.0％)，是农村人口死因第二位(占死亡总数21.0％)。

到目前为止，作为恶性肿瘤的主要治疗手段，手术、化疗和放疗虽然获得了一定的治疗效果，但仍存在着很大的局限性，如手术的打击、放化疗对肝肾、造血、免疫等系统的毒副作用、晚期恶性肿瘤疗效的有限性等。近年对恶性肿瘤发生机制的研究提示，癌基因的激活、抑癌基因的突变失活、细胞周期调控基因改变等导致的细胞生长失控、恶变是发生恶性肿瘤的主要机制。针对肿瘤发生的分子遗传学背景，肿瘤的基因治疗技术随之迅速发展，成为当今肿瘤治疗研究的最前沿，为肿瘤治疗开辟了全新途径。

基因治疗的关键之一是要选择合适的载体将外源目的基因安全高效地导入靶细胞，使外源基因在靶细胞中特异地表达或按一定要求调控表达。目前常用的载体是经过改造的无害病毒，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等。理想的载体应具备低毒、高效、大容量这几个重要条件。人类2型和5型腺病毒更多地被用于肿瘤基因治疗，由于它们具有以下特点：1.宿主范围广，且有嗜上皮细胞性，而人类大多数的肿瘤为上皮细胞来源；2.对人致病性低；3.在增殖和非增殖细胞中均能感染和表达基因；4.不整合到染色体中，无插入致突变性；5.能同时表达多个基因；6.能进行有效扩增，滴度高，并能进行大剂量制备。

复制缺陷型腺病毒是基因治疗常用的载体之一，由于失去了复制功能，这种载体具有较高的生物安全性，但常规应用效果存在明显的不足。复制缺陷型腺病毒感染细胞后由于不具有复制能力，不能将目的基因导入所有或大部分靶细胞中，加上机体免疫系统的清除作用，表达外源基因的时间较短，需要在治疗过程中多次、大量、局部应用，而这可能激活免疫记忆反应引起机体强烈的致敏。

近年来，人们利用肿瘤细胞与正常细胞之间某些生物学性状的差异，构建了肿瘤选择复制型腺病毒。这种腺病毒载体能使外源目的基因选择性地在肿瘤细胞内高效复制最终杀死肿瘤细胞，同时减少治疗所需病毒剂量，减少对正常细胞毒性和对宿主的免疫反应。

目前有研究利用肿瘤特异性启动子(端粒酶TERT启动子)控制病毒复制必需的基因，如E1a基因等，使这些基因只在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，从而使病毒只在肿瘤细胞中复制。

这种肿瘤选择复制型腺病毒为肿瘤的基因治疗开辟了新思路，但是必须注意的是，尽管人体绝大多数正常细胞不具有TERT活性，而生殖细胞和造血干细胞已被证实具有端粒酶活性。这种复制型腺病毒可能会在造血干细胞等细胞内复制，从而可能使人体造血等重要功能受到影响。为了避免上述选择性复制病毒的缺陷，提高治疗的安全及有效性，我们有必要探索新的治疗策略。

发明内容

本发明的目的是综合上述复制缺陷型腺病毒及选择复制型腺病毒的优点，进一步避免了它们的缺陷，通过构建两种选择性、互补复制的复制缺陷型腺病毒，建立一种新型的、高度选择性的、高效的、更加安全的肿瘤基因治疗方法。

本发明的特点是两种复制缺陷型腺病毒分别缺失各不相同的一种早期基因，如E1a和E4，其中缺失E4基因的复制缺陷型腺病毒含有TERT启动子控制的E1a基因，而另一种缺乏E1a基因的复制缺陷型病毒带有E4基因及肿瘤治疗基因。二者单独存在于正常细胞和肿瘤细胞中时，它们均因缺乏腺病毒复制所需的蛋白而不能复制。如将二者混合后感染肿瘤细胞，它们能够在其内相互提供对方缺失基因的表达蛋白从而互补复制，病毒复制后，再感染周围的肿瘤细胞，并再次互补复制。由于E1a基因是由TERT启动子控制，这种互补复制和再感染的循环作用过程会在具有TERT活性的肿瘤细胞中不断进行，最后停止在肿瘤的边界，而在不具有TERT活性的正常细胞内，这种互补复制不再发生。这样，可以使携带有肿瘤治疗基因的腺病毒完全感染肿瘤组织中每一个肿瘤细胞，达到最佳的杀瘤效果，而又不会影响到正常细胞。

由于两种病毒必须在同一细胞内才可能具有复制性的特点，这样即使是少量病毒从肿瘤中漏出，通过血循环进入感染骨髓等组织，病毒复制的可能性也大大降低，同时也就极大地减少了对正常血细胞的攻击，较选择复制型腺病毒的安全性有了很大提高。

带有TERT启动子控制E1a基因而缺失E4基因的复制缺陷型腺病毒，可以同多种现在已有的或将来不断出现的携带有抗肿瘤基因且E1a基因缺失的复制缺陷型腺病毒联合使用，会很好的克服这类基因治疗的缺点，提高这类肿瘤基因治疗的效果。

本发明具有以下优点：1.对肿瘤细胞高度选择性；2.更高的安全性；3.携带外源目的基因的能力更高；4.可以继续使用以往验证有效的复制缺陷型腺病毒，各种方案组合使治疗灵活多样。

实现本发明的步骤包括：1.应用分子克隆技术，分离TERT启动子和E1a基因；2.构建互补性、复制缺陷型腺病毒；3.包装、扩增、纯化病毒；4.病毒感染和复制能力鉴定。

附图说明

图1Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP体外感染肿瘤细胞(Hela细胞)情况。感染次日，荧光显微镜下观察到每孔均有很少量绿色荧光表达，说明每孔均有细胞被病毒感染(A、B、C)。感染后第三天，双病毒感染组荧光增强(F)，而单病毒组荧光均无明显变化(D、E)。复制缺陷型病毒Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP能够感染肿瘤细胞，并且二者同时应用时，才能在肿瘤细胞内互补复制。

图2Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP体外感染正常细胞(MRC-5细胞)情况。感染次日，荧光显微镜下观察到每孔均有很少量绿色荧光表达，说明每孔均有细胞被病毒感染(A、B、C)。感染后第三天，单病毒及双病毒组荧光均无明显变化(D、E、F)。复制缺陷型病毒Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP虽然能够感染正常细胞，但无论单独还是共同应用均不在正常细胞内复制。

图3Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP体外感染肿瘤细胞(Hela细胞)情况。200MOI病毒感染细胞(A、D、G)，荧光显微镜下观察到每孔均有绿色荧光蛋白表达，说明每孔均有细胞被病毒感染。感染后第三天，分别取一半细胞裂解液加入另一孔Hela细胞中(B、E、H)，双病毒感染组出现很强的荧光信号，说明产生了可感染细胞的病毒颗粒(H)。继续将一半细胞裂解液感染下一孔细胞(C、F、I)，双病毒感染组仍能复制产生可感染细胞的病毒(I)。

图4Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP体外感染正常细胞(MRC-5细胞)情况。200MOI病毒感染细胞(A、D、G)，荧光显微镜下观察到每孔均有绿色荧光蛋白表达，说明每孔均有细胞被病毒感染。感染后第三天，分别取一半细胞裂解液加入另一孔MRC-5细胞中(B、E、H)，仅双病毒组有很弱的荧光信号(H)。继续将一半细胞裂解液感染下一孔细胞(C、F、I)，三组均无荧光信号。在正常细胞中，即使两种病毒同时应用，也不能复制产生有感染能力的病毒。

图5Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP在活体肿瘤内的免疫组化GFP染色情况。Ad-GFP单病毒感染组(a)，病毒只在已感染病毒的肿瘤细胞中表达携带的GFP蛋白(a图上部细胞中的棕黄色染色)，而不能再感染其他细胞(a图下部)。Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP双病毒感染组(b，c)，病毒在已感染的SKOV3细胞中能进行复制并继续感染其他肿瘤细胞，直至感染所有肿瘤细胞(b、c图细胞中都存在大量棕黄色染色)。b为高倍镜图片，示肿瘤细胞中GFP蛋白表达，c为低倍镜图片，示几乎所有肿瘤细胞均被病毒感染并表达GFP蛋白。

具体实施方式

实施例1

利用分子克隆技术分离肿瘤特异性TERT启动子及E1a基因。

本发明通过PCR技术，分别以人宫颈癌Hela细胞及野生型腺病毒Ad5 DNA为模板，扩增TERT启动子及E1a基因序列，将其插入穿梭质粒pAdtrack中，构建出由TERT启动子控制E1a表达的pAdtrack-TERTp-E1a质粒。

扩增TERT启动子的引物序列：

上游引物5’-CAATGATATCTTCCCAGGGCCTCCACATCATG-3’

下游引物5’-ATAGTTTAGCGGCCGCACGCAGCGCTGCCTGAAACTC-3’

扩增E1a基因的引物序列：

上游引物5’-ACCGGGACTGAAAATGAGAC-3’

下游引物5’-TTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATATGGCCTGGGGCGTTTAC-3’

实施例2

构建缺失E4基因的由TERT启动子控制E1a基因表达的复制缺陷型病毒Ad-TERTp-E1aΔE4。

本发明利用AdEasy腺病毒载体系统构建复制缺陷型腺病毒，实施步骤为：

1.骨架质粒pAdEasy-2(不带E4基因)电转化BJ5183细菌，抗生素平板筛选，挑出克隆后扩增、抽提质粒，酶切检查pAdEasy-2的完整性，挑选正确克隆即为BJ5183-Ad-2细菌，将其制备电感受态细胞。

2.利用穿梭质粒pAdtrack(携带绿色荧光蛋白基因)和TERT启动子及E1a片段构建重组质粒pAdtrack-TERT p-E1a。

3.pAdtrack-TERTp-E1a电转化BJ5183-Ad-2，抗生素平板筛选，挑出克隆扩增、抽提质粒，酶切检测，挑选正确克隆即为pAdEasy-2-TERTp-E1a。

4.转染、包装、扩增和纯化病毒Ad-TERTp-E1aΔE4。

质粒pAdEasy-2-TERTp-E1a，经限制性内切酶Pac I酶切线性化后，用脂质体lipofectamine 2000^TM转染包装细胞。

911E4细胞在0.4mg/ml G418(Geneticin)、0.2mg/ml潮霉素(Hygromycin B)、1μg/ml强力霉素(Doxycyclin)共同作用下表达E4蛋白；2V6.11细胞在1μg/ml松甾酮(Ponasterone A)作用下表达E4蛋白。这两种表达E4蛋白的细胞系均可用于Ad-TERTp-E1aΔE4病毒包装和扩增。利用荧光显微镜观察荧光表达从而判断病毒包装、扩增情况。用氯化铯密度梯度离心和透析法纯化病毒。纯化的病毒滴度约10⁷pfu/μl。

实施例3

选择性互补复制腺病毒在体外培养细胞中的感染与复制(一)

目前基因治疗常用的复制缺陷型腺病毒一般为E1基因缺失并在该位点插入了治疗基因，这种病毒带有E4基因。以带有绿色荧光蛋白GFP基因的复制缺陷型腺病毒Ad-GFP为例，用我们构建的病毒Ad-TERTp-E1aΔE4与其共同感染体外培养细胞。

接种人宫颈癌Hela细胞、正常人胚肺成纤维细胞MRC-5于六孔细胞培养板，每孔5×10⁵个细胞。分别在Hela、MRC-5细胞中按以下三个分组加入病毒：即单加Ad-TERTp-E1aΔE4组；单加Ad-GFP组；加双病毒Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP组。按每个细胞感染10MOI计算所加病毒量，双病毒组每种病毒量较单病毒组减半以保持总病毒量相同。次日荧光显微镜下观察到每孔均有很少量绿色荧光表达，说明每孔均有细胞被病毒感染。连续观察5天，发现Hela细胞加单病毒的两个组中，荧光无明显变化，而加双病毒组荧光逐渐增强。MRC-5细胞的两个加单病毒组及双病毒组中荧光均无明显变化。该结果表明复制缺陷型腺病毒Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP能够感染肿瘤细胞及正常细胞，但无论单独还是共同应用均不在正常细胞内复制；只有二种病毒同时感染肿瘤细胞，才能在肿瘤细胞内互补复制。(图1、图2)

实施例4

选择性互补复制腺病毒在体外培养细胞中的感染与复制(二)

接种人宫颈癌Hela细胞、正常人胚肺成纤维细胞MRC-5于六孔细胞培养板，每孔5×10⁵个细胞。按每个细胞感染200MOI病毒在Hela、MRC-5细胞中按以下分组加入病毒：单加Ad-TERTp-E1aΔE4组；单加Ad-GFP组；加双病毒Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP组，双病毒组每种病毒量较单病毒组减半以保持总病毒量相同。次日荧光显微镜下观察到每孔均有大量绿色荧光表达，说明每孔均有细胞被病毒感染。感染3天后，每孔去培养基，PBS洗细胞2次，用胰蛋白酶消化收集细胞，冻融裂解并离心，取一半裂解上清液加入新培养的未感染病毒的细胞中。每3天重复该实验，取一半细胞裂解液感染下一孔新培养的细胞。本验证的目的是验证细胞裂解液中是否含有新复制产生的可继续感染细胞的病毒颗粒，由于每次只取一半细胞裂解液感染新的细胞，如果没有新复制产生的可继续感染细胞的病毒颗粒，绿色荧光表达必然会逐渐减少直至消失，反之荧光蛋白的表达将持续存在。

结果表明单病毒感染不能在肿瘤细胞和正常细胞内复制从而持续产生有感染能力的病毒；双病毒Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP在正常细胞中不能复制产生有感染能力的病毒，而在肿瘤细胞中这两种病毒能互补复制，持续产生有感染能力的病毒，不断感染肿瘤细胞。(图3，图4)

实施例5

选择性互补复制腺病毒在活体肿瘤内的感染与复制。

将对数生长期人宫颈癌Hela细胞消化、计数，用PBS悬浮细胞，按每只裸鼠注射5×10⁵个细胞，总体积为50μl注射于裸鼠后腿皮下。肿瘤长至直径约0.5cm时，取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞，分设三组用病毒感染：1、单加Ad-TERTp-E1aΔE4；2、单加Ad-GFP；3、同时感染Ad-TERTp-E1aΔE4和Ad-GFP两种病毒。感染病毒量均按每个细胞100MOI计算，双病毒组每种病毒量较单病毒组减半以保持总病毒量相同。感染次日，荧光显微镜下观察见均有大量绿色荧光表达，证明感染成功。收集细胞计数，将感染了病毒的SKOV3细胞注射于裸鼠Hela瘤体内，每只裸鼠注射1×10⁶个细胞，每组5只小鼠。待肿瘤继续生长至直径约1cm时，处死裸鼠，病理取材、切片。在三组不同病毒感染的肿瘤的切片上分别做DAB显色的免疫组化实验，用一抗为兔抗GFP。结果示：单一病毒感染的肿瘤，其GFP仅在部分肿瘤组织中分布，而双病毒组可在整个肿瘤中发现GFP分布。我们的实验结果表明两个单病毒组无病毒复制，而双病毒组有复制与再感染情况，几乎所有的肿瘤细胞中出现了GFP蛋白表达。(图5)

我们的发明显示了选择性互补复制腺病毒用于肿瘤治疗的合理性及可行性。复制缺陷型腺病毒Ad-GFP可以为装载各种目的基因的其他复制缺陷型腺病毒，与Ad-TERTp-E1aΔE4灵活组合，为肿瘤高效、安全的靶向治疗提出新方向。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学华西第二医院

<120>腺病毒选择性互补复制的方法

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<140>2009100580576

<141>2009-01-07

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<170>PatentIn version 3.3

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<213>Human

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32

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<212>DNA

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<213>Human

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20

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<212>DNA

<213>Human

<400>4

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