内皮细胞生物反应器及其制备方法和应用

摘要

本发明属组织工程和医用材料领域，涉及内皮细胞生物反应器及其制备方法和应用。本发明采用聚四氟乙烯无纺布作为内皮细胞生长的载体，联合中空纤维生物反应器，构建制成本生物反应器。所述的无纺布位于所述的中空纤维外侧的间隙中构成所述的聚四氟乙烯无纺布为载体的反应器，所述的内皮细胞种植在所述的无纺布上，制得本内皮细胞生物反应器，本生物反应器中内皮细胞的数量为3×10

说明书

技术领域

本发明属组织工程和医用材料领域，具体涉及一种内皮细胞生物反应器及其制备方法和在治疗重症脓毒症中的应用。

背景技术

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，具有发病率和死亡率高、治疗效果差等特点。一直以来脓毒症严重威胁着人类的生命。流行病学调查显示，全球每年有超过1800万的严重脓毒症患者，且患者数目以每年1.5％的速度递增。在美国，脓毒症的死亡率达28.6％，严重脓毒症死亡率更高达30％-50％，脓毒症休克死亡率为40％-60％，脓毒症的死亡率已超过急性心肌梗塞。因此，2002年10月欧美国家多个组织共同发起并签署了“巴塞罗那宣言”，呼吁全球医务人员、专业组织、政府、卫生机构甚至公众对该行动的支持，力争5年内将脓毒症的病死率减少25％。

近年来关于脓毒症的研究越来越多，但脓毒症的治疗效果仍没有得到明显的改善，脓毒症治疗的出路引起有关研究者的关注。自从PROWESS研究证实活化蛋白C治疗有效后，针对血管内皮细胞的研究受到更大的关注。血管内皮细胞(Vascularendothelial cells，VEC)是介于循环血液与血管平滑肌之间的生理屏障，为单层扁平或多角形的细胞覆盖于血管内膜表面。正常情况下，内皮细胞具有多种生理功能：合成和分泌血管活性物质参与血管紧张性的调节；表达凝血和抗凝相关因子参与血液凝固的调节；与炎症细胞相互作用，调节炎症和免疫反应的水平。严重脓毒症时，内皮细胞无论是形态还是功能上均出现严重的损害，内皮细胞损伤后，内皮细胞的病理生理功能发生一系列变化，造成微循环障碍和组织缺血、缺氧，导致全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征。可见内皮细胞并非是一种构成血管壁的无活性细胞，而是炎症级联反应的调控者，是脓毒症发生发展中极其关键的细胞，如果能逆转其损伤或替代其正常细胞功能将改变脓毒症的进程。

中空纤维生物反应器是由具有内在网络通道的聚合物构成的立体框架结构，同时辅以流动的培养液提供营养。通道内外相隔一层半透膜，这样便为大量有效地培养细胞并使之发挥功能提供了条件。有研究将中空纤维生物反应器应用于生物型人工肝脏。自从1972年Knazek设计了中空纤维生物反应器，1975年Wolf等人将其应用于肝细胞的培养后用来治疗急性肝功能衰竭。还有研究将中空纤维生物反应器应用于人工肾小管辅助装置的构建。

内皮细胞对生长环境要求高，在普通的中空纤维生物反应器中不能良好生长。

内皮细胞在脓毒症的发生发展过程中起着极其重要的作用，目前国内外尚无有关内皮细胞生物反应器及其在重症脓毒症中的应用的报道。研究人员期待通过在生物反应器内、中空纤维外侧种植内皮细胞，中空纤维内通血流，发挥内皮细胞对脓毒症时机体、炎症和凝血的调节作用，从而改善脓毒症的预后，

发明内容

本发明的目的是提供一种内皮细胞生物反应器。该反应器能改善脓毒症时机体的血流动力学指标以及炎症、凝血的紊乱状态，延长生存时间，改善预后。

本发明的另一目的是提供制备内皮细胞生物反应器的方法。

本发明的进一步目的是提供所述的内皮细胞生物反应器在治疗重症脓毒症中的应用。

本生物反应器是由聚四氟乙烯无纺布为载体的反应器和内皮细胞构成的复合体。

本发明采用聚四氟乙烯无纺布作为内皮细胞生长的载体，联合中空纤维生物反应器，构建制成本生物反应器。所述的中空纤维生物反应器的外壳为聚碳酸酯，中空纤维为聚砜膜，分子截留量在50～100kD之间，所述的无纺布位于所述的中空纤维外侧的间隙中构成所述的聚四氟乙烯无纺布为载体的反应器，所述的内皮细胞种植在所述的无纺布上，制得本内皮细胞生物反应器，本生物反应器中内皮细胞的数量为3×10⁹以上。

本发明内皮细胞生物反应器可用于重症脓毒症的治疗。

本发明所述的内皮细胞生物反应器通过下述方法和步骤制备：

1、内皮细胞培养

采用猪髂动脉内皮细胞株(购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库)。本实验在此细胞株的3～4代完成。

所述的猪髂动脉内皮细胞生长于含胎牛血清和双抗(青霉素和链霉素)的RPMI1640培养液中，在5％CO2、37℃培养箱孵育，当培养瓶中正常培养的PIEC细胞达到90％融合后，PBS洗涤一次，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA 1∶1混合液将其消化下来，培养液终止消化后1800rpm离心5min，弃去上清，加入含血清和“双抗”的培养液，吹打为细胞悬液，传代培养。

2、制备内皮细胞生物反应器

采用聚四氟乙烯无纺布为载体的反应器(购自博傲西腾医疗科技(上海)有限公司)，该反应器的中空纤维外侧缠绕一层聚四氟乙烯无纺布；用生理盐水冲洗所述的反应器的内腔和外腔后，将上述制得的内皮细胞悬液植入其外腔，封闭外腔口；内腔与培养液循环式人工毛细管培养系统相连接，所述的培养液为含10％胎牛血清和“双抗”的RPMI1640培养液；上述管路连接后将整个装置置于5％CO2、37℃培养箱中孵育，定时取反应器内腔培养液，用于乳酸、葡萄糖、一氧化氮、蛋白C和vWF的检测；内皮细胞在生物反应器外腔生长5d后，剖开反应器外壳，取出其中的无纺布，行光镜、荧光显微镜和电镜检查，观察内皮细胞在无纺布上的生长情况。

对上述以无纺布为载体的内皮细胞生物反应器进行鉴定，

1)无纺布生物反应器中内皮细胞的形态

内皮细胞在无纺布生物反应器外腔中生长5d后剖开反应器，即刻取出其中的聚砜膜中空纤维和无纺布，行DAPI染色后在荧光显微镜下观察，结果显示：中空纤维丝外表面光滑，未见内皮细胞贴附生长(图1A)，而无纺布上可见大量内皮细胞贴附生长，部分细胞可见双核，增值明显，但尚未互相衔接，连接成片(图1B)；动物实验结束后再次取无纺布行DAPI染色观察，结果显示：内皮细胞数量并无明显减少。

电镜下观察到无纺布是由丝状物不规则交错编织而成，内皮细胞在无纺布上贴壁伸展，伸出触角，具有内皮细胞的形态特征；偶见内皮细胞成团状生长，多数内皮细胞单个生长，尚未互相衔接(图1C，1D，1E)。

2)培养液中乳酸和葡萄糖浓度变化测定

测定结果显示：随着时间变化，培养液中乳酸浓度进行性升高，乳酸浓度升高的速率也在逐渐增加，如图2所示，其中箭头A、B、C的斜率反应的是0h、48h和110h时乳酸浓度升高的速率，箭头C斜率(1.3)是箭头A斜率(0.13)的10倍，是箭头B斜率(0.4)的3.3倍。94h时培养液颜色变黄，测定PH值7.1，弃氧合器中旧培养液，加入250ml新培养液，更换培养液后乳酸含量明显下降；相反地，随着时间变化，培养液中葡萄糖浓度则进行性下降，下降的速率逐渐加快，更换培养液后，葡萄糖浓度明显增加。

3)细胞数量测定

内皮细胞从培养瓶中消化后细胞计数，细胞总量约3×10⁸。在无纺布生物反应器外腔生长5d后，取外腔培养液，离心后见细胞数量少。

按下述3种方法估算反应器中内皮细胞的数量：

A、取出无纺布，对无纺布不同部位行DAPI染色，细胞计数，细胞的密度约2×10⁶/cm²，无纺布面积为0.1m²，计数得内皮细胞数量达2×10⁹以上；

B、根据乳酸产生的速率，计算细胞数量，如图2所示，箭头斜率代表乳酸产生的速率，箭头A时反应器外腔的细胞数量为3×10⁸，箭头C斜率是箭头A斜率的10倍，计算得内皮细胞数量约3×10⁹；

C、根据乳酸产生的浓度，计算细胞数量，

反应器96-120h产生乳酸2.291mmol/L，如果内皮细胞产生乳酸的速率为0.43±0.01μmol/10⁶/24h，计算得内皮细胞的数量达4.86×10⁹。

4)培养液中vWF的检测和NO的浓度变化

所述的vWF是内皮细胞的标志之一，反应器构建结束后检测其中的vWF，浓度为28.538pg/ml，从而间接鉴定内皮细胞；所述的NO是反应内皮细胞功能的指标之一，在最初的数小时内略下降后进行性升高，120h点达232μmol/L(图3)。

3、动物实验-治疗脓毒症猪

本发明构建的血管内皮细胞生物反应器用于内毒素血症猪治疗。

选择健康杂交家猪10头(购自复旦大学实验动物部)，雌雄不限，治疗组和假性循环组(对照组)各5头。用氯胺酮将实验用猪肌注麻醉后进行气管插管，然后进行颈内动脉和静脉置管后，静滴内毒素(LPS，0.25mg/kg)，0.5h内滴完。之后进行体外循环，血流量为30-50ml/min。对照组则通过未种植内皮细胞的反应器。密切监测其血流动力学变化：包括心率、平均动脉压、中心静脉压、肺动脉压和肺动脉锲压。实验开始后0、1、3、6小时取实验动物血液标本，测定血气分析、血常规、肝肾功能、乳酸的血清浓度，并用ELISA法分别测定血清中白介素-1、白介素-10、内皮素-1和一氧化氮的含量，最后记录实验动物的生存时间。

治疗效果显示：

1)生存时间

对照组的平均生存时间为5.20±0.57h(4.5h-6h)，实验组的平均生存时间为6.9±1.08h(5.5-8.5h)，较对照组延长了32.7％，p＜0.05，有统计学差异(图4)。

2)血流动力学指标

所有动物在滴完内毒素后平均动脉压(MAP)均进行性下降，实验组降至58.2±9.6mmHg，低于对照组64.80±11.31mmHg，p＞0.05，无统计学意义；此后实验组的平均动脉压有所上升，3h点为60.80±8.15mmHg，6h点为72.20±2.74mmHg，而对照组血压则进行性下降直至死亡，p＜0.05。

3)生化指标

两组动物实验开始时脏器功能无差异，治疗开始后3h、6h点，对照组血肌酐较实验组明显升高p＜0.01；血钾两组均先降低后升高，但实验组浓度始终低于对照组，在3h、6h点，与对照组相比p＜0.05。

4)血清NO，ET-1，vWF

NO和ET-1的水平均转化为与起始点(0h)的比值进行比较。1h时治疗组的NO浓度下降至最低值，而对照组的NO浓度则升高至最高值，两组比较p＜0.01，有统计学差异；3h时治疗组NO浓度有所下降，而对照组NO浓度略升高，但治疗组仍显著高于对照组，p＜0.05，有统计学差异；之后治疗组NO浓度继续下降，而治疗组浓度继续升高，治疗组比较对照组p＝0.10，无统计学差异。

血清中ET-1浓度变化趋势和NO变化趋势相反。1h时治疗组的ET-1浓度下降，而对照组的ET-1浓度升高，两组之间存在统计学差异，p＜0.01；3h时治疗组的ET-1浓度继续下降至最低值，此时对照组的ET-1明显下降，但治疗组的ET-1浓度仍低于对照组，p＜0.05；6h时治疗组的ET-1浓度略升高，而对照组的ET-1浓度继续下降，两组之间ET-1浓度无明显差异，p＝0.53。

两组的vWF均升高后逐渐降低，对照组升高比治疗组明显，在1h、3h两组vWF的血清浓度具有显著性差异，p＝0.037。

动物实验证实，本发明内皮细胞反应器能改善脓毒症时机体的血流动力学指标以及炎症、凝血的紊乱状态，延长生存时间，改善预后。可用于治疗重症脓毒症。

附图说明

图1内皮细胞在生物反应器内的生长情况，

其中，内皮细胞种植在无纺布生物反应器外腔5d后，A：聚砜膜中空纤维(DAPI×100)，B：无纺布(DAPI×40)，C：无纺布(扫描电镜×500)，D：无纺布(扫描电镜×1000)，E：无纺布(扫描电镜×1500)。

图2培养液中乳酸和葡萄糖浓度随时间变化

其中，箭头A、B、C的斜率反应的是0h、48h和110h时乳酸浓度升高的速率，箭头C斜率(1.3)是箭头A斜率(0.13)的10倍，是箭头B斜率(0.4)的3.3倍。

图3培养液中NO浓度随时间的变化。

图4实验组和对照组生存时间的比较。

图5反应器构建模式图

图6动物实验体外循环装置图。

具体实施方式

实施例1内皮细胞培养

猪髂动脉内皮细胞株(购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库)。本实验在此细胞株的3～4代完成。猪髂动脉内皮细胞生长于含10％胎牛血清、双抗(0.0606g/L青霉素和0.1g/L链霉素)、2mmol/L的L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液中，在5％CO2、37℃培养箱孵育。当75cm2培养瓶中正常培养的PIEC细胞达到90％融合后，PBS洗涤一次，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA1∶1混合液将其消化下来，培养液终止消化后1800rpm离心5min，弃去上清，加入5ml含血清和双抗的培养液，轻柔吹打为细胞悬液，传代培养。

实施例2制备无纺布内皮细胞生物反应器

1.培养液循环式人工毛细管培养系统的管路连接  培养液循环式人工毛细管培养系统主要由4部分组成：反应器、循环管路、氧合器和蠕动泵，管路具体连接方法如图5所示。氧合器内装有250ml RPMI 1640+10％FBS培养液，并通过滤器和外界空气相通。管路连接前先用生理盐水预冲反应器的内腔和外腔，排空生理盐水后封闭外腔，内腔与循环管路相连。管路连接结束后，启动蠕动泵，排空内腔气体。

2.内皮细胞的消化、计数  当75cm²培养瓶中正常培养的PIEC细胞达到90％融合后，PBS洗涤一次，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA 1∶1混合液消化细胞，培养液终止消化后1800rpm离心5min，弃去上清，加入5ml含血清和“双抗”的培养液，吹打为细胞悬液，连续消化3-5瓶培养瓶内的细胞，细胞计数，取3×10⁸细胞，根据反应器外腔容量大小将细胞稀释至所需的体积(250ml)。

3.细胞种植取60ml无菌一次性灌注器，将稀释后的细胞悬液缓慢移至无纺布反应器的外腔，封闭外腔口，操作过程严格无菌操作。

4.培养液循环式人工毛细管培养系统的细胞培养将整个反应装置置于37℃、5％CO₂培养箱中，启动蠕动泵，将培养液从氧合器中泵出，通过反应器内腔，再回到氧合器内，泵的循环速度为35ml/min。最初的4个小时，每隔1h将反应器的放置方向旋转180°，重复旋转4次后静置。细胞在反应器中的培养时间为5天，3-4天时更换氧合器中的培养液。

5.标本的留取、保存和测定在PIEC输注入反应器后的0、20h、40h、60h、80h、100h和120h分别从取样孔中抽取3-5ml液体(相当于反应器内腔液)，循环培养的开始和结束即0h和120h时另从外腔口取3-5ml的反应器外腔液，Eppendorf管分装，-70℃冻存。留取的标本用于乳酸、葡萄糖、NO、vWF和蛋白C的检测。随着时间变化，培养液中乳酸浓度进行性升高，乳酸浓度升高的速率也逐渐增加，弃旧培养液，加入250ml新培养液，更换培养液后乳酸含量明显下降；培养液中葡萄糖浓度进行性下降，下降的速率逐渐增加，更换培养液后，葡萄糖浓度明显增加，趋势与乳酸变化完全相反。

6.内皮细胞在无纺布生物反应器外腔中生长5d后剖开反应器，取出其中的聚砜膜中空纤维和无纺布，行DAPI染色后在荧光显微镜下观察。中空纤维丝外表面光滑，未见内皮细胞贴附生长。而无纺布上可见大量内皮细胞贴附生长，部分细胞可见双核，增值明显，但尚未互相衔接，连接成片。电镜下观察到无纺布是由丝状物不规则交错编织而成，内皮细胞在无纺布上贴壁伸展，伸出触角，具有内皮细胞的形态特征。偶见内皮细胞成团状生长，多数内皮细胞单个生长，尚未互相衔接

实施例3动物实验

1、建立猪内毒素血症模型

健康杂交家猪10头(购自复旦大学医学院动物实验中心)，雌雄不限，年龄3个月左右，体重15kg～20kg，分设内皮细胞生物反应器组(实验组)和假性循环组(对照组)各5头。用15mg/kg的氯胺酮麻醉实验猪，行耳缘静脉放静脉套管，给予平衡液20ml/kg/h的速度补液，1h后予10ml/kg/h维持，然后气管插管，用异氟醚静吸复合麻醉维持，再行颈内动脉置入双腔管，及置入漂浮导管。平稳后，静滴内毒素(LPS)，剂量为0.25mg.kg-1，0.5h内滴完，之后进行体外循环。

2、建立体外循环

实验前用肝素化生理盐水500ml(1ml:5U)对循环管路和反应器内腔进行预冲，待LPS静滴完后，在循环泵的驱动下，从颈内动脉双腔管的动脉端引出动脉血，血流量为30-50ml/min，血流经反应器内后经静内静脉回流至体内(图6)。|

3、实验指标监测

a)血流动力学监测实验开始后，用静内动脉双腔管的另外一端持续测定心率、收缩压和舒张压，颈内静脉的漂浮导管自LPS开始给予后6小时内每一小时测定肺动脉压、肺动脉锲压、中心静脉压。采用下述公式计算平均动脉压，平均动脉压＝DBP+(SBP-DBP)/3，结果显示，治疗组的平均动脉压高于对照组，差异有统计学意义。

b)血生化指标检测自LPS静滴开始0h、1h、3h、6h，从动脉置管处抽取10ml动脉血，分别测定血气分析、血常规、肝肾功能(丙氨酸转氨酶、白蛋白、血清肌酐和血钾)、乳酸的血清浓度。其中，血常规、肝肾功能由华山医院检验中心即刻检测，血气分析由机器当场测定；其余血液室温1500rpm离心15分钟留取血清分装于Eppendorf管，保存于-70℃冰箱内，待测血清乳酸(乳酸试剂盒，南京建成)浓度。

c)炎症、凝血指标监测留取和保存标本方法同上，用ELISA法分别测定血清中IL-1、IL-10、ET-1、NOs、PC以及vWF的含量，所用试剂盒购于美国ADL试剂公司。

2.生存时间观察内毒素开始滴入时为事件起点，心跳呼吸停止为事件终点，记录生存时间。结果显示，治疗组生存时间明显长于对照组。

3.治疗实验效果显示：

1)生存时间

对照组的平均生存时间为5.20±0.57h(4.5h-6h)，实验组的平均生存时间为6.9±1.08h(5.5-8.5h)，较对照组延长了32.7％，p＜0.05，有统计学差异(图4)。

2)血流动力学指标

所有动物在滴完内毒素后平均动脉压(MAP)均进行性下降，实验组降至58.2±9.6mmHg，低于对照组64.80±11.31mmHg，p＞0.05，无统计学意义。此后实验组的平均动脉压有所上升，3h点为60.80±8.15mmHg，6h点为72.20±2.74mmHg，而对照组血压则进行性下降直至死亡，p＜0.05。

表1是对照组和实验组血流动力学随时间变化的比较。

表1

与对照组相比：△p＜0.05

3)生化指标

两组实验开始时脏器功能无差异，治疗开始后3h、6h点，对照组血肌酐较实验组明显升高(p＜0.01)。血钾两组均先降低后升高，但实验组浓度始终低于对照组，在3h、6h点，与对照组相比p＜0.05。

表2是对照组和实验组血生化的变化。

表2

与对照组相比，△p＜0.05

4)血清NO，ET-1，vWF

NO和ET-1的水平均转化为与起始点(0h)的比值进行比较。1h时治疗组的NO浓度下降至最低值，而对照组的NO浓度则升高至最高值，两组p＜0.01，存在统计学差异。3h时治疗组NO浓度有所下降，而对照组NO浓度略升高，但治疗组仍显著高于对照组，两组p＜0.05，存在统计学差异。之后治疗组NO浓度继续下降，而治疗组浓度继续升高，虽然治疗组浓度仍高于对照组，但无统计学差异(p＝0.10)。血清中ET-1浓度变化趋势和NO变化趋势相反。1h时治疗组的ET-1浓度下降，而对照组的ET-1浓度升高，两组之间存在统计学差异，p＜0.01；3h时治疗组的FT-1浓度继续下降至最低值，此时对照组的ET-1明显下降，但治疗组的ET-1浓度仍低于对照组，p＜0.05；6h时治疗组的ET-1浓度略升高，而对照组的FT-1浓度继续下降，两组之间ET-1浓度无明显差异，p＝0.53。两组的vWF均升高后逐渐降低，对照组升高比治疗组明显，在1h、3h两组vWF的血清浓度具有显著性差异，p＝0.037。

表3是内皮细胞生物反应器组和假性循环组的细胞因子的比较。

表3：

与对照组相比：△p＜0.05