小麦花药一步成苗培养方法

摘要

本发明公开了一种小麦花药一步成苗培养方法，选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，低温(2℃～4℃)预处理2天；经预处理的小麦幼穗，经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成苗培养基上遮光培养；待培养的花药组织出现肉眼可见的愈伤组织时，置于1500Lx光照条件下培养一周后，将光照强度增加到3000Lx～4000Lx，连续培养两周，即可产生根、苗健壮的花粉植株。该方法减少了花粉愈伤组织诱导不定芽和不定根两个必须的技术操作环节，培养成本降低了近50％，培养天数缩短了40～50天，绿苗平均诱导率与多步成苗的绿苗平均诱导率相当，白苗率普遍降低10个百分点，且试管苗生长健壮、根系发达，根茎连接部位很少或无愈伤组织残留，试管苗移栽成活率高。

说明书

技术领域

本发明属于粮食作物中的小麦细胞工程育种技术，进一步涉及一种小麦花药一步成苗培养方法。

背景技术

小麦是人类最重要的粮食作物之一。通过各种途径进行小麦遗传改良是小麦优质、高产、稳产的基础。上世纪70年代发展起来的小麦单倍体育种技术已成为现代重要的小麦生物技术育种方法之一，在小麦遗传改良中发挥着重要作用，并培育了一批小麦优良品种，在小麦稳产、高产中发挥了重要作用。目前，小麦单倍体育种一直使用多步成苗技术，即先在脱分化培养基上离体培养小麦花药组织诱导花粉细胞脱分化产生愈伤组织，再在再分化培养基上诱导愈伤组织分化成无根小苗，第三步将诱导的无根小苗转入到生根培养基上壮苗生根，这一花药培养多步成苗技术存在着培养程序复杂、培养周期长、费用高、白化苗率高等问题，限制了这一技术的进一推广和应用。近年来，个别学者进行了小麦花药培养直接出苗研究，但结果很不理想，至今还没有建立完整的花药培养一步成苗技术。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题或不足，本发明的目的在于，提供一种小麦花药一步成苗培养方法，该方法将传统的小麦花药培养多步成苗简化为一步成苗，以较大幅度的简化小麦花药培养程序，缩短培养周期，降低培养成本，减少白化苗率，提高花药培养效率和单倍体育种效率。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种小麦花药一步成苗培养方法，其特征在于，包括下列步骤：

首先选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，于2℃～4℃条件下低温预处理2天；

低温预处理后的小麦幼穗，经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成苗培养基上，于25℃～27℃条件下遮光培养；所述的一步成苗培养基采用通用培养基W₁₄，并以通用培养基W₁₄为基础，添加以下物质：

6-呋喃基氨基嘌呤：1.5mg/L，α-奈乙酸：0.5mg/L，盐酸硫胺素：8mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，谷氨酰胺：5mg/L，蔗糖：60000mg/L；麦芽糖：40000mg/L，琼脂粉：5000mg/L；调整一步成苗培养基pH值为5.6；

待培养的花药组织出现肉眼可见的愈伤组织时，置于1500Lx光照条件下培养一周，一周后，将光照强度增加到3000Lx～4000Lx，培养温度为25℃～27℃，连续培养两周，即可产生根、苗健壮的花粉植株。

本发明的小麦花药一步成苗培养方法，与传统的小麦花药培养单倍体育种技术相比，减少了花粉愈伤组织诱导不定芽和不定根两个必须的技术操作环节，培养成本降低了近50％，培养天数缩短了40～50天，绿苗平均诱导率与多步成苗的绿苗平均诱导率相当，达到5％左右，最高达到10％。白苗率普遍降低10个百分点，且试管苗生长健壮、根系发达，根茎连接部位很少或无愈伤组织残留，试管苗移栽成活率高。本发明总体提高了小麦花药培养效率和单倍体育种效率，大大降低了小麦花药培养和单倍体育种成本和时间。

附图说明

图1是按照本发明的小麦花药一步培养成苗方法得到的试管图片，其中(a)是2007年一步培养成苗的试管图片，(b)是2008年一步培养成苗的试管图片。

以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明主要通过对花药培养基的改进与使用，将小麦花粉细胞脱分化、再分化及完整植株的形成过程在一步培养过程中完成，同时不降低或者还一定程度的提高了培养效率。采用的主要技术手段和措施是：

1)选择了无机盐浓度低的通用W₁₄培养基作为基本培养基。

2)培养基中的渗透压降低，蔗糖浓度由10％降到6％。

3)添加了麦芽糖(促进绿苗率，降低白苗率)；

4)附加重要的有机物质酪蛋白、生物素和谷氨酰胺，使盐酸硫胺素(V_b1)浓度增加到10mg/L。

5)将诱导激素KT与NAA合理搭配。

6)进行了培养前花药组织的低温预处理(2℃～4℃放置2天)。

7)培养过程光条件的调控：由散射光到中等光照再到强光照。

本发明小麦花药一步成苗培养方法，包括下列步骤：

选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，在2℃～4℃条件下低温预处理2天；

预处理后的小麦幼穗经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成苗培养基上，于25℃～27℃条件下遮光培养。

一步成苗培养基选用通用培养基W₁₄，以通用培养基W₁₄为基准，添加以下物质：

6-呋喃基氨基嘌呤(KT)：1.5mg/L，α-奈乙酸(NAA)：0.5mg/L，盐酸硫胺素(V_b1)：8mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，谷氨酰胺：5mg/L，蔗糖：60000mg/L，麦芽糖：40000mg/L，琼脂粉：5000mg/L。

调整一步成苗培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌15分钟(1.0kg/cm²)。

通用培养基W₁₄的配方为：硝酸钾(KNO₃)：2000mg/L，磷酸二氢氨(NH₄H₂PO₄)：380mg/L，氯化钙(CaCl₂·2H₂O)：140mg/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)：200mg/L，硫酸钾(K₂SO₄)：700mg/L，硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)：27.8mg/L，乙二酸四乙钠(Na₂EDTA)：37.3mg/L，硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)：8mg/L，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)：3.0mg/L，硼酸(H₃BO₃)：3.0mg/L，碘化钾(KI)：0.5mg/L，钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)：0.005mg/L，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)：0.025mg/L，氯化钴(CoCl₂·6H₂O)：0.025mg/L，盐酸硫胺素：2mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L。

待培养的花药组织出现肉眼可见的愈伤组织时，置1500Lx光照条件下培养一周，一周后，将光照强度增加到3000Lx～4000Lx，培养温度为25℃～27℃，连续培养两周，即可产生根、苗健壮的花粉植株。

以下是发明人给出的实施例：

利用本发明的小麦花药培养一步成苗方法，发明人所在的小麦细胞工程育种课题组于2007年接种培养共7个杂交组合约30000枚花药，培养时间50天，直接诱导生根完整绿苗1490株绿苗(图1a)，绿苗诱导率4.97％，诱导白苗180株，白苗率0.6％。

2008年接种培养共5个杂交组合约26000枚花药，培养时间50天，直接诱导生根完整绿苗1390株绿苗(图1b)，绿苗诱导率5.35％，诱导白苗193株，白苗率0.7％。培养试剂与传统的方法相比，消耗减少近50％，培养时间缩短45天左右，白苗率大大降低。

图1是按照本发明的一步培养成苗方法得到的试管图片，可以看出，试管苗生长健壮、根系发达，根茎连接部位很少或无愈伤组织残留。