公开/公告号CN101549152A
专利类型发明专利
公开/公告日2009-10-07
原文格式PDF
申请/专利权人 新疆埃乐欣药业有限公司;
申请/专利号CN200910009030.8
申请日2009-02-13
分类号A61K38/51(20060101);A61K9/20(20060101);A61P31/04(20060101);A61P31/10(20060101);A61P15/02(20060101);A61K31/198(20060101);
代理机构11249 北京中恒高博知识产权代理有限公司;
代理人夏晏平
地址 830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市河南东路16号创业大厦1306室
入库时间 2023-12-17 22:44:28
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2011-06-15
授权
授权
2010-01-27
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-10-07
公开
公开
技术领域
本发明涉及医用药品领域,是一种新的蒜氨酸/蒜酶二元释药制剂。
背景技术
大蒜作为药食两用植物已有悠久历史,近年来我们对其作了深入的研究,从大蒜中分别提取蒜氨酸与蒜酶,组合成新制剂,在体内产生大蒜辣素,具有良好的抗菌、抗病毒、及抗肿瘤作用。
蒜氨酸(Alliin)化学名:S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-Allyl-L-cysteine)。熔点:163-165℃(分解、炭化),[α]D=+60°,白色结晶性粉末,几乎无臭。
C6H11NO3S=177.22
蒜酶
蒜酶(Alliinase,EC 4.4.1.4)又名蒜氨酸裂解酶、烷基半胱氨酸亚砜酶、C-S酶、(S-allyl-L-cysteine sulfoxide lyase,Cysteine sulfoxide lyase;Alkylcysteinesulfoxide lyase)。属二聚体糖蛋白,两个亚基分子量均为51.5KDa。结晶呈黄色,无臭,等电点pH=4.9。
蒜酶活力(效价)的测定
酶活力(效价)单位定义为:每分钟裂解1μmol蒜氨酸相当的蒜酶量,为一个活力单位。蒜酶在适当条件下,具有催化裂解底物蒜氨酸的酶解反应,产生大蒜辣素和丙酮酸,这些酶释反应产物的多少直接与蒜酶的活力(效价)有关。
大蒜辣素
大蒜辣素(Allicin),化学名:二烯丙基硫代亚磺酸酯(2-propene-1-sulfinothioic acidS-2-propenyl ester),鲜蒜中原本不含大蒜辣素,由蒜酶与蒜氨酸相遇催化裂解反应产生。是大蒜次级反应产生的最重要的生物活性成分。Mw:162.3。密度:1.112g/cm。熔点:<25℃。易挥发,具有浓烈气味,微溶于水,化学性质不稳定。
C6H10OS2=162.3g/mol
蒜酶对蒜氨酸的催化反应如下:
蒜酶催化蒜氨酸反应动力学的研究如下:
蒜酶产品加底物(蒜氨酸)分别配成试液。超声混合30秒,35℃水浴保温。分别于5、15、25min,及1、3、5、7、9、11、13hr吸取反应液适量,加甲醇混匀。过0.45um滤膜,HPLC进样10ul,得到色谱图。计算蒜氨酸、丙酮酸及大蒜辣素含量。绘制酶促反应曲线,如附图1所示。
显示蒜酶的特性的反应曲线:5分钟以内为酶促反应初速度(呈现一级反应:S+E→P。其速度方程为:-d[S]/dt=k1[S]);25分钟达到最大反应速度(呈现混合级反应:。)。大蒜辣素随时间浓度增加,15分钟至13hr,其浓度基本稳定(25分--13hr接近零级反应)。
以上实验情况说明,蒜酶对蒜氨酸的催化反应仅在5~15分钟内完成,以达到更大的疗效,这是本发明所追求的。
发明内容
本发明的目的为提供一种在体内蒜酶对蒜氨酸产生酶解催化反应,生成大蒜啊辣素的药物新制剂。进一步开发以大蒜为原料的治疗幽门螺旋杆菌、白色念珠菌等感染性疾病及其他对此药物敏感的疾病的药物。
实现上述目的的技术方案如下:
一种抗菌、抗病毒、及抗肿瘤的蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片,其特征在于:该制剂分三层组成,中间为隔离层,在隔离层一侧为蒜氨酸与辅料混合层,另一侧为蒜酶与辅料混合层(见附图2a),在三层结构外面包有肠溶薄膜衣或普通薄膜衣(见附图2b)。
包有肠溶薄膜衣的二元释药多层片为口服用药,包有普通薄膜衣的二元释药多层片为阴道用药。
所述隔离层为羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉等惰性粘合材料,辅料为羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉,及硬脂酸镁等。
各组成物料的重量配方如下:
隔离层 45~55克
蒜氨酸与辅料混合层
蒜氨酸 80~120克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 8~12克
(2)硬脂酸镁 0.5~1克
蒜酶与辅料混合层
蒜酶 80~120克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 8~12克
(2)硬脂酸镁 1~2克
制备方法如下:
(1)蒜氨酸与辅料混合层的组成物料混匀分成1000份备用;
(2)蒜酶与辅料混合层的组成物料混匀分成1000份备用;
(3)在压片机上装冲模,取一份蒜氨酸与辅料的混匀物料放入冲模中,作为下层,加压;将隔离层物料加在上面,再加压;形成隔离层。再取蒜酶与辅料混匀物料加在隔离层上面,再加压;成三层片。
(4)在上述每三层片外面包肠溶衣(口服)或普通衣(阴道用)。
(5)共制成1000片成品药。
由蒜氨酸与蒜酶催化作用生成的大蒜辣素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药效。
本发明蒜氨酸/蒜酶二元释药制剂,因为是三层组成,催化剂和被催化剂受隔离剂阻挡不能产生反应,进入人体后,体液溶化薄膜衣,蒜氨酸与蒜酶相遇,迅速反应而发挥疗效。
蒜氨酸/蒜酶抗幽门螺旋杆菌、白色念球菌、耐甲氧西林金葡菌等的药效实验
实验内容
(1)、试液:蒜氨酸(alliin)与蒜酶(Alliinase)新鲜配制。模拟蒜氨酸/蒜酶二元释药系统新制剂释放大蒜辣素(allicin)。
(2)、药效观察采用琼脂(挖孔)扩散法,以便临用时在琼脂孔中同时加入蒜酶和蒜氨酸。按两个分子alliin转化为一个allicin(实际上是1.78个分子)计算,Alliin的每孔加量应为500μg,因此alliin的浓度应是50000mg/L(50g/L)。蒜酶的浓度按1∶1计算,亦应是50000mg/L。
根据大蒜辣素的药效学文献推算,按每孔allicin 250μg设计可能较为合适。琼脂扩散法所挖孔的孔径在3mm~6mm皆可,以孔径3mm计算,孔体积约7μl,最大可加10μl,则药液浓度可配成25mg/ml[25000mg/L,(25g/L)],
(3)、加药方法:蒜氨酸和蒜酶溶液临时现配,然后等量混合加10μl入孔中(或者各加5μl)。
(4)、原液的配制:蒜酶和蒜氨酸各配成0.1g/2ml原液(后改为0.1g/4ml),现配现用。
(5)、受试菌的选择:选取目前临床上常见的难题菌株,主要包括MRSA、白念、铜绿假单胞菌、不动杆菌,考虑口服给药的情况,加做幽门螺杆菌,沙门菌和志贺菌。
试验记录
(1)、2007-10-09
A液为alliin,0.1g/2ml;B液为蒜酶,0.1g/2ml
结论:①、MRSA未生长,可见药物浓度太高,建议药物浓度稀释一倍,即各配成0.1g/4ml原液
②、A10μl加B10μl的结果和A10μl+B5μl的结果基本一样,足见蒜酶的浓度(1∶1加量)已足够(实际上已过量)。
(2)、2007-10-10实际试验结果
因为每孔加上述浓度的药液抑菌圈太大,遂将药物原液改为0.1g/4ml
按每孔加两种药液各5μl、10μl、和15μl进行试验
(3)、2007-10-12
要求对这几个试验菌做MIC,以比较抑菌圈直径与MIC的关系,确定试验的最佳浓度。初步看来,各加5μl已经够了,因为多加一倍或三倍并未显著增加抑菌圈直径。
(4)、2007-10-15,MIC测定:
A/B各配成0.1g/4ml原液,各取1ml加9ml肉汤为第一管,继续倍比稀释至第九管,第十管为无药对照。加菌液,如常规测MIC。
结果:沙门在第二管,350μg/ml;
痢疾在第三管,175μg/ml
白念在第三管,175μg/ml
MRSA在第七管,10.95μg/ml
(5)、20071006和20071018的结果
A/B各配成0.1g/4ml原液,按每孔加两种药液各5μl、10μl、和15μl
结论:①、各加5μl即可
②、大蒜辣素对MRSA效果最好,然后依次为白念、痢疾、沙门氏菌。
③、对于细菌而言,抑菌圈结果与MIC结果较一致的是孔中各加10μl,其对应结果见下表;白念的MIC结果与扩散法结果不太一致(采用扩散法,孔中各加5μl和10μl,或许对于评价痢疾与白念之间的差异较好)。
大蒜辣素对幽门螺杆菌(Hp)的药效观察
(7)、2007-12-25,Hp标准株的检测结果(72h培养)
(8)、2007-12-28,临床分离株72h培养的药敏结果
(9)、2007-12-29结果(48h培养)
小结:大蒜辣素对Hp有较高的抗菌药效,以A、B药液各5μl加量的实验结果进行统计,平均抑菌圈直径为29.7mm(18~45mm),推算其MIC值约为29.96mg/L.
结论
蒜氨酸、蒜酶二元释药系统对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、不动杆菌、大肠埃希菌、幽门螺杆菌和白色假丝酵母菌(白念)等具有明显的杀菌活性,其中以MRSA和幽门螺杆菌最为敏感。其MIC值约在10~30mg/L;其次白念对大蒜辣素的敏感性亦较高。蒜氨酸、蒜酶二元释药系统有望替代万古霉素成为治疗MRSA感染的重要药物;可用于治疗幽门螺杆菌引起的胃炎和胃溃疡;蒜氨酸、蒜酶二元释药系统亦可作为酵母样真菌感染的治疗药物(内服或外用)。
附图说明
图1是酶促反应曲线(催化动力学曲线)
图2a为二元释药多层片侧面视图(其中10表示蒜酶,30表示蒜氨酸,20表示隔离层)
图2b为带有包衣的二元释药多层片侧面视图(其中40表示包衣)。
图3是HPLC色谱图(1.蒜氨酸、2.内标)
图4是蒜酶垂直平板电泳及图(Power Pac1000,BIO-RAD)(泳道1:Mark;泳道2、3、4:蒜酶)
具体实施方式
实施例1
隔离层 45克
蒜氨酸与辅料混合层
蒜氨酸 80克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 8克
(2)硬脂酸镁 0.5克
蒜酶与辅料混合层
蒜酶 80克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 8克
(2)硬脂酸镁 1克
制备方法如下:
(1)蒜氨酸与辅料混合层的组成物料混匀分成1000份备用;
(2)蒜酶与辅料混合层的组成物料混匀分成1000份备用;
(3)采用ZPD25多功能压片机,圆凸型冲模,干粉压片法。在压片机上装冲模,取蒜氨酸与辅料的混匀物料放入冲模中,作为下层,加压;将隔离层物料加在上面,再加压,得隔离层;取一份蒜酶与辅料的混匀物料加在隔离层上面,再加压;成三层片;
(4)在上述三层片外面包肠溶衣(口服)或普通衣(阴道用)。
(5)共制成1000片成品药。
实施例2
各组成物料的重量配方如下:
隔离层 55克
蒜氨酸与辅料混合层
蒜氨酸 120克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 12克
(2)硬脂酸镁 1克
蒜酶与辅料混合层
蒜酶 120克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 12克
(2)硬脂酸镁 2克
制备方法同实施例1
实施例3
各组成物料的重量配方如下:
隔离层 50克
蒜氨酸与辅料混合层
蒜氨酸 100克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 10克
(2)硬脂酸镁 0.8克
蒜酶与辅料混合层
蒜酶 100克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 10克
(2)硬脂酸镁 1.5克
制备方法同实施例1
实施例4
各组成物料的重量配方如下:
隔离层 48克
蒜氨酸与辅料混合层
蒜氨酸 110克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 9克
(2)硬脂酸镁 0.9克
蒜酶与辅料混合层
蒜酶 110克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 11克
(2)硬脂酸镁 1.8克
制备方法同实施例1
实施例5
各组成物料的重量配方如下:
隔离层 45克
蒜氨酸与辅料混合层
蒜氨酸 80克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 8克
(2)硬脂酸镁 0.5克
蒜酶与辅料混合层
蒜酶 120克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 12克
(2)硬脂酸镁 2克
制备方法同实施例1
实施例6
各组成物料的重量配方如下:
隔离层 55克
蒜氨酸与辅料混合层
蒜氨酸 120克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 12克
(2)硬脂酸镁 1克
蒜酶与辅料混合层
蒜酶 80克
辅料:
(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉 8克
(2)硬脂酸镁 1克
制备方法同实施例1
蒜氨酸的制备
在中国发明专利CN1157373C、专利号为ZL 00101244.4的“从大蒜中提取蒜氨酸的方法”以及中国发明专利CN1203057C、专利号为ZL03100420.2“从鲜蒜中提取蒜氨酸生产工艺”两项发明专利的基础上。以新疆大蒜为原料,蒜瓣经蒜酶灭活、萃取、离子交换柱吸附、氨水洗脱浓缩、重结晶等步骤得到蒜氨酸原料药,蒜氨酸含量≥90%。
蒜氨酸原料药的含量测定
蒜氨酸原料药的含量必需大于90%。测定方法:以利巴韦林为内标物,高效液相色谱法(Agilent 1100)测定蒜氨酸原料药种蒜氨酸的含量。精密称取蒜氨酸对照品20mg,置50ml容量瓶,纯水溶解、定容至刻度。精密移取0.50ml、2.50ml、5.00ml、7.50ml、10.0ml、12.5ml分别置25ml容量瓶中,各加入2.00ml利巴韦林内标液(0.4mg/ml),水定容至刻度。在波长220nm处测定,校正因子(f)为0.5559,RSD=1.8%(n=6),日内精密度为0.6%(n=5)。日间精密度RSD=1.3%(n=5)。测定五批蒜氨酸供试品的蒜氨酸含量≥90%。HPLC色谱图如图3所示。
蒜酶的制备
在中国发明专利CN1222613C、专利号为ZL 03100419.9的“从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺”的基础上,设计在低温车间(0-5℃),鲜蒜经精选、冷却、脱皮、纯水清洗、胶体磨破壁打浆、缓冲-保护液萃取、盐析、超滤、冷冻干燥等步骤,制备蒜酶。
蒜酶活力(效价)的测定
酶活力(效价)单位定义为:在最佳底物(蒜氨酸)、最佳浓度、最佳温度(35℃)、最佳pH(7.0)条件下,每分钟裂解1μmol蒜氨酸相当的蒜酶量,为一个活力单位。依据蒜酶催化裂解底物蒜氨酸的酶解反应,采用高效液相色谱法(HPLC)测定蒜氨酸的减少量,计算蒜酶原料药的活力。经测定,五批蒜酶原料药供试品酶活力为≥1000U/g。
蒜酶纯度与分子量的测定
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定蒜酶纯度及相对分子量。采用图像分析仪成像(图5),并分别量取指示剂移动的距离、Mark移动的距离、蒜酶移动距离计算分子量(表5)。蒜酶浓度1mg/ml时仅呈现一带。蒜酶垂直平板电泳及图(Power Pac1000,BIO-RAD),其中泳道1:Mark;泳道2、3、4:蒜酶
以标准蛋白质分子量的对数lgMr对其相对迁移率Rf进行线性回归,得回归方程:lgMr=-1.3077Rf+2.4917,γ=0.9937
将蒜酶样品的相对迁移率Rf代入回归方程计算得蒜酶亚基分子量为54.0kDa。蒜酶由两个相同的亚基组成,蒜酶分子量为108kDa。蒜酶垂直平板电泳及图(Power Pac1000,BIO-RAD)(泳道1:Mark;泳道2、3、4:蒜酶)见图4。
蒜氨酸/蒜酶二元释药系统的理论依据
蒜酶催化蒜氨酸反应动力学
在适当条件下蒜酶迅速催化裂解蒜氨酸,产生大蒜辣素等系列硫化物。
反应条件:蒜酶与蒜氨酸按制剂配方规定比例(1∶2-0.5)混合。加适量磷酸盐缓冲液(pH=7.8,模拟肠道环境),超声30秒溶解混匀,35-40℃保温(模拟体温),在0、5、15、25、60min及1、3、5、7、9、11、13hr分别测定蒜氨酸、大蒜辣素及付产物丙酮酸含量。得到催化动力学曲线。
米氏常数Km=3.6mmol,最大反应速度Vmax=27.9μmol-1mg-1。显示蒜氨酸/蒜酶二元释药系统设计的科学性及可行性。既实现了药物制剂的稳定性,又保证了药物的有效性。
大蒜辣素化学性质不稳定,常温下空气中数小时即分解变质,需要-20℃保存。本发明以蒜氨酸及蒜酶作为前体药物的二元释药系统:口服“蒜氨酸/蒜酶肠溶多层片”和阴道给药“蒜氨酸/蒜酶多层片”等制剂。药片进入消化道或阴道,在体液的作用下,蒜酶与蒜氨酸相遇,蒜酶催化蒜氨酸产生大蒜辣素,被机体吸收而发挥功效用于治疗幽门螺杆菌和白色假丝酵母菌(白念)等引起的感染性疾病。阴道蒜氨酸/蒜酶多层给药片用于治疗白色假丝酵母菌(白念)等引起的阴道感染性疾病,与肠溶蒜氨酸/蒜酶多层片相似,只是药物剂量加倍,与肠溶蒜氨酸/蒜酶多层片相比较,只是外包普通薄膜衣,而非肠溶薄膜衣。
本发明片剂由蒜氨酸层、隔离层及蒜酶层组成,外包肠溶薄膜衣。蒜氨酸标示量为:100mg/片。潜在大蒜辣素含量:65mg/片。片中原料药重量占75%-80%,辅料重量占20%-25%。
机译: 包含一种具有涂层的高分子材料的眼科镜片,该涂层具有干涉,抗反射,抗虹膜和红外滤光片多层结构。
机译: 包含一种具有涂层的高分子材料的眼科镜片,该涂层具有干涉,抗反射,抗虹膜和红外滤光片多层结构
机译: 包含一种具有涂层的高分子材料的眼科镜片,该涂层具有干涉,抗反射,抗虹膜和红外滤光片多层结构。