一种治疗慢性阻塞性肺病、支气管哮喘的药物组合物

摘要

本发明公开了一种治疗慢性阻塞性肺病(COPD)及支气管哮喘的药物组合物，由一种糖皮质激素和一种支气管扩张剂及药学上可接受的辅料或载体组成，该组合物为口服制剂形式。本发明药物组合物中所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松，所述支气管扩张剂选自福莫特罗、克仑特罗、丙卡特罗或茶碱。本发明的组合物对治疗COPD及支气管哮喘的疗效大于单独服用两种组分的疗效，具有协同作用。本组合物原料易得、价格低廉，增加患者服药顺应性，对于中国广大农村及城市低收入阶层的COPD和支气管哮喘患者疾病的防治具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘的药物组合物，特别是涉及一种由一种糖皮质激素(Glucocorticoid)和一种支气管扩张剂(Bronchodilator)及药学上可接受的辅料或载体所组成的药物组合物，该组合物为口服制剂形式。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘是呼吸系统最常见多发的两种重要疾病，其中COPD是一种可以预防、可以治疗的、以气流受限为特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对有害气体或有毒颗粒的异常炎症反应有关。目前普遍认为其发生机制是：中央气道、外周气道、肺实质和肺血管的慢性炎症引起气道狭窄、肺实质及肺血管床破坏等病理改变，从而最终导致气流受限、肺过度充气、气体交换异常、肺动脉高压等一系列病理生理改变。支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，这种炎症导致气道高反应性，进而引起可逆性的气流受限。因此对于稳定期COPD以及支气管哮喘药物治疗的两个重要方面便是：控制炎症和舒张痉挛的气道。

糖皮质激素口服的抗炎作用已为医学界公认，如泼尼松(Prednisone)、泼尼松龙(Prednisolone)、甲基泼尼松龙(Methylprednisolone)、倍他米松(Betamethasone)、地塞米松(Dexamethasone)和氢化可的松(Hydrocortisone)等可用于治疗慢性阻塞性肺病及支气管哮喘。大量研究发现短期、一定剂量的糖皮质激素口服可以有效地缓解COPD和支气管哮喘的急性发作，长期维持治疗能够有效地控制气道炎症、持续缓解症状、延迟下次急性发作的时间。但长期口服大剂量糖皮质激素可能会带来较大的副作用，主要是全身性副作用，例如小儿生长延迟或骨质疏松。

支气管扩张剂是COPD及支气管哮喘症状治疗的重要药物，β₂受体激动剂(β₂ receptor agonist)是目前应用最广泛的一类，常用的可口服的β₂受体激动剂有克仑特罗(Clenbuterol)、福莫特罗(Formoterol)、丙卡特罗(Procaterol)等。临床研究证实该类药物口服可以有效地控制症状和改善肺功能。但单独使用β₂受体激动剂口服存在副作用，主要为心血管系统副作用，如心动过速。

除β₂受体激动剂外，茶碱(Theophylline)也是支气管扩张剂中的一类，其口服剂有氨茶碱(Aminophylline)、多索茶碱(Doxofylline)等，近年来研究发现小剂量的茶碱具有抗炎、免疫调节和支气管保护的作用，在临床上可应用于缓解COPD及支气管哮喘患者的症状。但单独使用茶碱具有治疗窗狭窄，治疗剂量和中毒剂量接近的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全有效、价格低廉、服用简便、顺应性好的药物组合物，以满足广大农村及城市低收入阶层COPD和支气管哮喘患者疾病防治的需要。

本发明实现上述发明目的的技术方案为：

一种治疗慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘的药物组合物，由活性成分及药学上可接受的辅料或载体组成，其特征在于：所述活性成分由一种糖皮质激素或其可药用盐，和一种支气管扩张剂或其可药用盐组成，所述药物组合物为口服制剂。

本发明药物组合物中，糖皮质激素为泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松和氢化可的松中的任意一种，支气管扩张剂为β₂受体激动剂或茶碱。其中β₂受体激动剂为福莫特罗、克仑特罗、丙卡特罗中的任意一种，茶碱为氨茶碱或多索茶碱。

当本发明药物组合物的活性成分由糖皮质激素或其可药用盐和β₂受体激动剂或其可药用盐组成时，所述糖皮质激素或其可药用盐与β₂受体激动剂或其可药用盐的重量比为：0.15～80:0.0125～0.1，优选为：1～30:0.015～0.08，更加优选为：2～24:0.02～0.06，最优选为：2.5～5:0.03～0.045。

当本发明药物组合物的活性成分由糖皮质激素或其可药用盐和茶碱或其可药用盐组成时，所述糖皮质激素或其可药用盐与茶碱或其可药用盐重量比为：0.15～80:50～450，优选为：1～30:100～300，更加优选为：2～24:120～200，最优选为：2.5～5:150～180。

本发明的药物组合物，是由糖皮质激素或其可药用盐与支气管扩张剂或其可药用盐组成药物活性成分，加上药学上可接受的常规辅料或载体，可制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂等各种口服制剂，用于治疗COPD及支气管哮喘。常用口服制剂辅料可选用，崩解剂如：羟丙基淀粉、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如：乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精等；润湿剂和粘合剂如：乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如：滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000。活性组分为糖皮质激素与β₂受体激动剂时，活性组分与辅料重量比为：1～40:100～3000，优选1～40:100～2000，进一步优选为1～40:100～1000，最优选为1～30:100～500。活性组分为糖皮质激素与茶碱时，活性组分与辅料重量比为：30～600:100～5000，优选50～450:100～2000，进一步优选为50～150:100～1500，最优选为80～120:100～500。

糖皮质激素的抗炎作用已为医学界公认，而又基于气道炎症是COPD和支气管哮喘重要的发病环节，因此其在治疗COPD和支气管哮喘方面应有一定疗效。近年来随着研究的深入，对于激素的应用趋于肯定的态度，大多数基础和临床方面、大样本研究结果证实，全身应用糖皮质激素可以改善COPD和支气管哮喘患者的生活质量，减少急性加重次数，降低住院天数，减轻气道炎症，甚至在一定程度上延缓FEV₁(第一秒用力呼气容积)下降的进程。

β₂受体激动剂可以作用于位于气道平滑肌细胞膜上的β₂受体，发挥松弛气道平滑肌的作用，并能够抑制肥大细胞、中性粒细胞释放炎性介质与过敏介质，增强纤毛运动，促进气道粘液分泌，降低血管通透性和减轻气道粘膜下水肿等。大量研究证实，β₂受体激动剂可以增加FEV₁、减轻呼吸困难、增加活动耐量、改善生活质量，减少COPD及支气管哮喘的急性发作。

本发明人经过大量试验研究发现，糖皮质激素联合β₂受体激动剂具有协同增效作用，能降低糖皮质激素的用量以减轻副作用，其协同作用机制包括：1.糖皮质激素受体复合物能够启动β₂受体基因，增强其在肺组织细胞膜上的转录和在呼吸道粘膜上的受体蛋白的合成，或逆转β₂受体的下调，发挥上调受体数量或使“受体增敏”的作用。2.β₂受体激动剂在激动细胞膜β₂受体的同时，还能够通过细胞分裂素活化蛋白激酶的作用使细胞浆内的无活性糖皮质激素受体磷酸化，使之“预激活”，从而增加其对糖皮质激素的敏感性，增强抗炎作用。糖皮质激素联合β₂受体激动剂还可减少β₂受体激动剂在心血管系统方面的副作用。

茶碱可以通过抑制磷酸二酯酶、阻断腺苷受体、干扰气道平滑肌的钙离子转运，使气道平滑肌松弛；能增加膈肌收缩力，减少膈肌疲劳，同时还可以增加呼吸中枢驱动，有利于COPD及支气管哮喘的治疗。

本发明人经过试验惊奇地发现，糖皮质激素和茶碱的组合物同样具有协同增效作用，不仅能降低糖皮质激素的用量以减轻副作用，而且能克服茶碱治疗窗狭窄，治疗剂量和中毒剂量接近的缺点。

因此，通过使用组合药物制剂可增加疗效，降低糖皮质激素以及支气管扩张剂的使用剂量，减少或避免激素及支气管扩张剂的副作用，对COPD及支气管哮喘的防治具有重要意义。

与现有技术相比，本发明的有益效果：经过大量的研究，我们已通过动物模型实验的结果证实：本发明的糖皮质激素与支气管扩张剂的组合物对治疗COPD或支气管哮喘的效果并非是组成成分药效的简单叠加，而是具有协同作用的效应，疗效大于单独服用两种组成成分，因此，本发明的组合物可以通过增加各组分的疗效、降低各组分的用量来减少长期口服大剂量糖皮质激素及支气管扩张剂的副作用。

单独使用β₂受体激动剂存在严重的心血管系统副作用，甚至死亡。虽然说明书上明确指出了这点，但仍然有给患者单独开β₂受体激动剂的情况发生(主要出现在基层医院)，即使医生同时开了激素，有些患者也会漏服。如使用本发明的复方组合物制剂，可有效避免以上漏开漏服情况发生，同时增加患者服药的顺应性，方便服药。除此之外，本发明的组合物制剂由于是口服制剂，具有原料易得、价格低廉的特点，因此，本发明的糖皮质激素和支气管扩张剂的组合制剂对于中国广大农村及城市低收入阶层的COPD和支气管哮喘患者疾病的防治来说具有重大的意义。

附图说明

图1为泼尼松及福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图2为泼尼松及福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图3为泼尼松和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图4为泼尼松和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图5为泼尼松和氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图6为泼尼松和氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图7为泼尼松龙及福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图8为泼尼松龙及福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图9为泼尼松龙和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图10为泼尼松龙和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图11为泼尼松龙和氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图12为泼尼松龙和氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图13为甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图14为甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图15为甲基泼尼松龙和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图16为甲基泼尼松龙和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图17为甲基泼尼松龙及氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类的影响。

图18为甲基泼尼松龙及氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度的影响。

图19为泼尼松及福莫特罗组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图20为泼尼松及福莫特罗组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图21为泼尼松及克仑特罗组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图22为泼尼松及克仑特罗组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图23为泼尼松及氨茶碱组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图24为泼尼松及氨茶碱组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图25为泼尼松龙及福莫特罗组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图26为泼尼松龙及福莫特罗组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图27为泼尼松龙及克仑特罗组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图28为泼尼松龙及克仑特罗组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图29为泼尼松龙及氨茶碱组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图30为泼尼松龙及氨茶碱组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图31为甲基泼尼松龙及福莫特罗组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图32为甲基泼尼松龙及福莫特罗组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图33为甲基泼尼松龙及克仑特罗组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图34为甲基泼尼松龙及克仑特罗组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

图35为甲基泼尼松龙及氨茶碱组合物对致敏鼠引喘潜伏期时间的影响。

图36为甲基泼尼松龙及氨茶碱组合物对致敏鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度的影响。

具体实施方式

本发明的治疗慢性阻塞性肺病、支气管哮喘的药物组合物，由活性成分及药学上可接受的辅料或载体组成，所述活性成分由一种糖皮质激素或其可药用盐，和一种支气管扩张剂或其可药用盐组成，所述药物组合物为口服制剂。

所述支气管扩张剂为β₂受体激动剂或茶碱。

所述活性成分为一种糖皮质激素或其可药用盐和一种β₂受体激动剂或其可药用盐时，活性成分与药学上可接受的辅料或载体的重量比为：1～40:100～3000，优选1～40:100～2000，进一步优选为1～40:100～1000，最优选为1～30:100～500。所述糖皮质激素为泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松中的任意一种，所述β₂受体激动剂为福莫特罗、克仑特罗、丙卡特罗中的任意一种。所述糖皮质激素或其可药用盐与β₂受体激动剂或其可药用盐的重量比为：0.15～80:0.0125～0.1，优选1～30:0.015～0.08，进一步优选2～24:0.02～0.06，最好为2.5～5:0.03～0.045。

所述活性成分为一种糖皮质激素或其可药用盐和一种茶碱或其可药用盐时，活性成分与辅料重量比为：30～600:100～5000，优选50～450:100～2000，进一步优选为50～150:100～1500，最优选为80～120:100～500。所述糖皮质激素为泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松中的任意一种，所述茶碱为氨茶碱或多索茶碱。所述糖皮质激素或其可药用盐与茶碱或其可药用盐的重量比为：0.15～80:50～450，优选1～30:100～300，进一步优选2～24:120～200，最好为2.5～5:150～180。

所述活性成分加上药学上可接受的常规辅料或载体，如羟丙基淀粉、羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、乙基纤维素、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000等，可制备成各种口服制剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、散剂或丸剂等。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1复方泼尼松福莫特罗片

1000片复方泼尼松福莫特罗片的配方为：

泼尼松　　　　　　　　1.25g

福莫特罗              0.08g

淀粉                  100g

微晶纤维素            50g

羧甲基淀粉钠          20g

低取代羟丙基纤维素    20g

5％聚维酮乙醇溶液     10-20g

硬脂酸镁              2g

制备方法：将原辅料粉碎过80目筛，干燥备用。取1.25g泼尼松、0.08g福莫特罗按照等量递增法混合均匀，按照处方量分别加入淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠和低取代羟丙基纤维素，按等量递增法混合均匀，用5％聚维酮乙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃干燥约2小时，18目筛整粒，将干燥后的颗粒与硬脂酸镁混合均匀，测定含量，确定片重，压制成1000片，每片含泼尼松1.25mg，福莫特罗80μg。

实施例2泼尼松氨茶碱复方制剂

1000片泼尼松氨茶碱复方制剂的配方为：

泼尼松　　　　　　　　　　3.75g

氨茶碱                    100g

微晶纤维素                40g

羟丙甲基纤维素            125g

乙基纤维素　　　　　　　25g

5％聚维酮乙醇溶液       20g

硬脂酸镁                2g

制备方法：将原辅料粉碎过80目筛，干燥备用。取3.75g泼尼松、100g氨茶碱按照等量递增法混合均匀，按照处方量分别加入微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、乙基纤维素，按等量递增法混合均匀，用5％聚维酮乙醇溶液制软材，20目筛制粒，40℃干燥约2小时，18目筛整粒，将干燥后的颗粒与硬脂酸镁混合均匀，测定含量，确定片重，压制成1000片。制成的复方片剂中每片含泼尼松3.75mg、氨茶碱100mg。

实施例3-18，单位剂量中活性成分含量见表1。

表1、实施例3-18单位剂量中活性成分及其含量

 

实施例组分1及重量(mg)组分2及重量(mg)3泼尼松24克仑特罗0.0154泼尼松5多索茶碱4505泼尼松2.5丙卡特罗0.01256泼尼松龙5福莫特罗0.047泼尼松龙1.25福莫特罗0.028泼尼松龙2.5克仑特罗0.039泼尼松龙30克仑特罗0.04510泼尼松龙3.75氨茶碱5011甲基泼尼松龙1福莫特罗0.0612甲基泼尼松龙4克仑特罗0.0613甲基泼尼松龙24氨茶碱20014甲基泼尼松龙2福莫特罗0.115甲基泼尼松龙3克仑特罗0.07516倍他米松0.15氨茶碱15017地塞米松0.75氨茶碱30018氢化可的松80氨茶碱180

实施例3-18的活性成分加上药学上可接受的常规辅料或载体，按照常规制备方法分别制备成片剂、胶囊、颗粒剂、散剂或丸剂等口服剂型。其中实施例4、实施例10、实施例13、实施例16-18中活性成分与辅料或载体的重量比为50～450:100～2000，其余实施例中活性成分与辅料或载体的重量比为1～40:100～2000。

以下通过药效学试验说明本发明的有益效果：

一.各药物组合物对COPD大鼠气道炎症的影响研究：

1.模型制备及给药

健康雄性Wistar大鼠232只，鼠龄12周，体重250士20g，应用香烟熏吸加气管内注入脂多糖法建立COPD模型，药物均用生理盐水进行溶解，采用随机数字表法将动物分为以下组：

(1)健康对照组(n＝8)：置于室内正常喂养，不做任何干预；

(2)COPD模型组(n＝8)：第1、14天气管内注入脂多糖各200μg/200μL，第2-13、15～28天将大鼠放入50×60×70cm大小的有机玻璃熏箱内被动吸烟，每天熏烟2次，每次10支香烟，时间持续1小时，两次熏烟间隔4小时，玻璃熏箱的右上角保留一个直径为1cm的通气孔，保持箱内气压的稳定。被动吸烟方法：将点燃的红梅牌香烟通过三通管的一端将烟雾吸入到50mL注射器中，然后立即关闭吸烟通路一端，将三通管的另一端打开，推动注射器活塞将其中的烟雾注入到有机玻璃箱内进行大鼠被动吸烟。香烟焦油含量为15mg/支，烟气烟碱量为1.2mg/支。本组动物每天灌胃2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用5mL生理盐水灌胃，作为COPD模型对照；

(3)服用泼尼松及福莫特罗组合物组(本发明实施例1)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(0.14mg/kg)5mL灌胃；

(4)单独服用(3)组对应剂量泼尼松组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用泼尼松(0.13mg/kg)5mL灌胃；

(5)单独服用(3)组对应剂量福莫特罗组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用福莫特罗(8.3μg/kg)5mL灌胃；

(6)服用泼尼松及克仑特罗组合物组(本发明实施例3)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(2.5mg/kg)5mL灌胃；

(7)单独服用(6)组对应剂量泼尼松组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用泼尼松(2.5mg/kg)5mL灌胃；

(8)单独服用(6)组对应剂量克仑特罗组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用克仑特罗(1.6μg/kg)5mL灌胃；

(9)服用泼尼松及氨茶碱组合物组(本发明实施例2)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(10.8mg/kg)5mL灌胃；

(10)单独服用(9)组对应剂量泼尼松组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用泼尼松(0.39mg/kg)5mL灌胃；

(11)单独服用(9)组对应剂量氨茶碱组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用氨茶碱(10.4mg/kg)5mL灌胃；

(12)服用泼尼松龙及福莫特罗组合物组(本发明实施例6)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(0.53mg/kg)5mL灌胃；

(13)单独服用(12)组对应剂量泼尼松龙组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用泼尼松龙(0.52mg/kg)5mL灌胃；

(14)单独服用(12)组对应剂量福莫特罗组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用福莫特罗(4.2μg/kg)5mL灌胃；

(15)服用泼尼松龙及克仑特罗组合物组(n＝8)(本发明实施例9)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(3.1mg/kg)5mL灌胃；

(16)单独服用(15)组对应剂量泼尼松龙组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用泼尼松龙(3.1mg/kg)5mL灌胃；

(17)单独服用(15)组对应剂量克仑特罗组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用克仑特罗(4.7μg/kg)5mL灌胃；

(18)服用泼尼松龙及氨茶碱组合物组(本发明实施例10)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(5.6mg/kg)5mL灌胃；

(19)单独服用(18)组对应剂量泼尼松龙组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用泼尼松龙(0.39mg/kg)5mL灌胃；

(20)单独服用(18)组对应剂量氨茶碱组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用氨茶碱(5.2mg/kg)5mL灌胃；

(21)服用甲基泼尼松龙及福莫特罗组合物组(本发明实施例14)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(0.22mg/kg)5mL灌胃；

(22)单独服用(21)组对应剂量甲基泼尼松龙组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用甲基泼尼松龙(0.21mg/kg)5mL灌胃；

(23)单独服用(21)组对应剂量福莫特罗组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用福莫特罗(10.4μg/kg)5mL灌胃；

(24)服用甲基泼尼松龙及克仑特罗组合物组(本发明实施例12)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(0.42mg/kg)5mL灌胃；

(25)单独服用(24)组对应剂量甲基泼尼松龙组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用甲基泼尼松龙(0.42mg/kg)5mL灌胃；

(26)单独服用(24)组对应剂量克仑特罗组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用克仑特罗(6.25μg/kg)5mL灌胃；

(27)服用甲基泼尼松龙及氨茶碱组合物组(本发明实施例13)(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，每天分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用组合制剂(23.3mg/kg)5mL灌胃；

(28)单独服用(27)组对应剂量甲基泼尼松龙组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用甲基泼尼松龙(2.5mg/kg)5mL灌胃；

(29)单独服用(27)组对应剂量氨茶碱组(n＝8)：模型制备方法同COPD模型组，本组动物每天灌胃给药2次，分别于首次烟熏前0.5小时及末次烟熏后1.5小时用氨茶碱(20.8mg/kg)5mL灌胃；

2.支气管肺泡灌洗液白细胞计数及分类

以血管钳夹闭右肺门，于气管壁上剪一T字形切口，于切口处插入前端呈尖端的灌洗管至肺门处，旋转灌洗管以使之插入左主支气管约1cm，缓慢注入温生理盐水3mL，缓慢回抽，将回抽液再次注入支气管中；如此共反复三次，应回抽出至少2mLBALF。取1mLBALF离心，3000转/分×15分钟，取上清液EP管分装，存于-20℃待测。取沉渣涂片，计算白细胞总数及分类计数。

3.支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度测定

应用IL-8和TNF-α检测试剂盒，按照说明书用酶联免疫吸附试验(ELISA)对上一步骤中所得支气管肺泡灌洗液进行IL-8和TNF-α浓度的检测。

4.统计方法

应用SPSS 13.0统计软件包进行分析。方差齐者使用方差分析法，方差不齐者使用秩和检验。确定以P<0.05为有统计学意义。

5.结果

(1)泼尼松及福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表2和图1所示，模型组较对照组白细胞计数总数及分类构成均有明显差异，白细胞数升高，中性粒细胞比例增高，而不论是使用单药或是使用两药的组合物，与COPD模型组相比均在不同程度上能够降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，但服用泼尼松和福莫特罗组合物组较单独使用组降低中性粒细胞的比例的作用更明显。其结果表明组合物组较对应剂量单药对COPD的抗炎效果更好。

表2 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与福莫特罗组比P<0.05

2)如表3和图2所示，模型组较对照组IL-8和TNF-α浓度明显增高，各干预组较模型组，两种炎症因子的浓度均有降低，但其中以组合物干预的效果最佳，其IL-8和TNF-α浓度均低于单独使用泼尼松或福莫特罗(P<0.05)，证明使用泼尼松和福莫特罗的药物组合物对COPD模型鼠支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α的浓度有明显降低的作用，能够有效的控制气道炎症反应。

表3 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与福莫特罗组比P<0.05

(2)泼尼松和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表4和图3所示，使用单药以及使用两药的组合物，与COPD模型组相比均在不同程度上能够降低白细胞数，和中性粒细胞的分类比例；服用组合制剂组能够较单用两药组明显降低支气管肺泡灌洗液中的白细胞数，但未能降至正常水平，在降低中性粒细胞比例方面各干预组间未发现有统计学意义的差异，其结果表明在降低白细胞计数方面组合物较服用单药对COPD的效果更好。

表4 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与克仑特罗组比P<0.05

2)如表5和图4所示，各干预组对COPD模型鼠的气道炎症介质IL-8和TNF-α浓度均有不同程度的抑制作用，尽管使用泼尼松和克仑特罗组合物组对TNF-α浓度的降低作用与单独使用两药无明显差异，但其对IL-8降低作用明显优于其它各干预组，证明泼尼松和克仑特罗的组合物能够明显抑制COPD模型鼠支气管中IL-8的释放，发挥气道抗炎的作用。

表5 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与克仑特罗组比P<0.05

(3)泼尼松和氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表6和图5所示，单独服用两药以及服用两药的组合物，与COPD模型组相比均在不同程度上能够降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，服用其组合物组能够较单药组明显降低支气管肺泡灌洗液中的白细胞数和中性粒细胞的比例。结果表明组合物组较服用对应剂量单药对COPD具有更好的抗炎效果。

表6 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与氨茶碱组比P<0.05

2)如表7和图6所示，各干预组大鼠支气管肺泡灌洗液中的IL-8和TNF-α浓度均低于COPD模型组，其中以单独使用泼尼松和氨茶碱组的IL-8和TNF-α浓度相当，使用组合物组的IL-8和TNF-α浓度最低，证明泼尼松和氨茶碱的组合物在控制COPD模型鼠气道炎症介质释放方面具有最佳的效果。

表7 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与氨茶碱组比P<0.05

(4)泼尼松龙及福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表8和图7所示，不论是单独使用两药以及使用两药的组合物，与COPD模型组相比均在不同程度上能够降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，与COPD模型组相比，服用泼尼松龙和福莫特罗组合物组能够较单独使用两药更加有效的降低白细胞数目和中性粒细胞百分比。其结果表明组合物较对应剂量单药对COPD的抗炎效果更好。

表8 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗比P<0.05

2)如表9和图8所示，各干预组均不同程度上降低了COPD大鼠气道内IL-8及TNF-α浓度，其中以泼尼松龙和福莫特罗组合物组的降低程度最明显，较单独使用泼尼松龙或福莫特罗有统计学差异，提示泼尼松龙和福莫特罗的组合物具有明显的抗炎效果。

表9 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗比P<0.05

(5)泼尼松龙和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的影响

表10 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

#：与COPD模型组比P<0.05

^：与泼尼松龙组比P<0.05

$：与克仑特罗比P<0.05

1)如表10和图9所示，不论是单药以及服用两药的组合物，与COPD模型组相比均在不同程度上能够降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，对于白细胞计数方面，服用其组合物组能够明显降低支气管肺泡灌洗液中的白细胞数，且较单独用药的效果明显，组合组较单用泼尼松龙组对中性粒细胞构成比例的降低作用无明显差异。其结果表明组合物组对降低COPD的气道白细胞数的效果更好。

2)如表11和图10所示，各干预组较COPD模型组的IL-8及TNF-α浓度均有不同程度的降低，组合物组较单独使用克仑特罗组降低IL-8及TNF-α浓度的作用更明显，而与单独使用泼尼松龙组效果相当，无统计学差异，表明组合物组抗炎的效果优于单独使用克仑特罗组。

表11 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与克仑特罗比P<0.05

(6)泼尼松龙和氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表12和图11所示，服用单药以及服用两药的组合物，均能在不同程度上能够降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，而服用其组合制剂能够较其它干预组明显降低支气管肺泡灌洗液中的白细胞数，组合物组较单独使用氨茶碱降低使中性粒细胞的比例的作用更强，而与单独使用泼尼松龙组相当，其结果表明两药的组合物具有优于单独使用氨茶碱，但与单独使用泼尼松龙相当的抗炎作用。

表12 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱比P<0.05

2)如表13和图12所示，各干预组大鼠支气管肺泡灌洗液中的IL-8和TNF-α浓度均低于COPD模型组，其中以单独使用泼尼松龙和氨茶碱组的IL-8和TNF-α浓度相当，使用组合物组的IL-8和TNF-α浓度最低，证明泼尼松龙和氨茶碱的组合物在控制COPD模型鼠气道炎症介质释放方面具有更佳的效果。

表13 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱比P<0.05

(7)甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表14和图13所示，使用单药以及使用两药的组合物，均能在不同程度上能够降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，服用甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物组的白细胞数和中性粒细胞比列均较其它各干预组低，差别有统计学意义。其结果表明组合物较对应剂量单药对COPD的抗炎效果更好。

表14 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗比P<0.05

2)如表15和图14所示，各治疗组均不同程度上降低了COPD大鼠气道内IL-8及TNF-α浓度，其中以甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物的降低程度最明显，较单独使用甲基泼尼松龙或福莫特罗有统计学差异，提示甲基泼尼松龙和福莫特罗的组合物具有明显的抗炎效果。

表15支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗比P<0.05

(8)甲基泼尼松龙和克仑特罗组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表16和图15所示，不论是使用单药以及使用两药的组合物，均能在不同程度上降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，组合物组和单独用药组在降低支气管肺泡灌洗液中的白细胞数的作用上无统计学差异；但组合物组较对应剂量单药组能够更明显地降低中性粒细胞的构成百分比。

表16 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与克仑特罗比P<0.05

2)如表17和图16所示，各干预组对COPD模型鼠的气道炎症介质IL-8和TNF-α浓度均有不同程度的抑制作用，使用甲基泼尼松龙和克仑特罗的组合物对IL-8浓度的降低作用明显优于其它各干预组，而对TNF-α浓度的降低作用在各干预组间无明显差异，证明组合物能够明显抑制COPD模型鼠支气管中IL-8释放，发挥气道抗炎的作用。

表17 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与克仑特罗比P<0.05

(9)甲基泼尼松龙及氨茶碱组合物对COPD大鼠模型的影响

1)如表18和图17所示，使用单药以及使用两药的组合物，均能在不同程度上能够降低白细胞数，或降低中性粒细胞比例，与COPD模型组相比，服用甲基泼尼松龙和氨茶碱组合物组能够有效降低白细胞数目，并且使中性粒细胞的比例降至接近正常水平。其结果表明组合物较单药分别使用对COPD的抗炎效果更好。

表18 支气管肺泡灌洗液中白细胞计数及细胞分类比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱比P<0.05

表19 支气管肺泡灌洗液中IL-8及TNF-α浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与COPD模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱比P<0.05

2)如表19和图18所示，各干预组较COPD模型组的IL-8及TNF-α浓度均有不同程度的降低，甲基泼尼松龙和氨茶碱组合物组与单用甲基泼尼松龙组IL-8及TNF-α浓度无统计学差异，但均明显低于单用氨茶碱组，证明使用两药的组合物在控制气道炎症方面有一定的优势。

二.各药物组合对哮喘豚鼠引喘时间和气道炎症的影响

1.模型建立及给药

参考文献报道方法予以改进：取健康Hartley豚鼠幼鼠，雌雄各半(200～250g)共258只，随机选用雌雄Hartley豚鼠幼鼠各4只作为健康对照组，将卵蛋白粉溶于生理盐水，配成5％的溶液，取其余250只Hartley豚鼠幼鼠，每只豚鼠两后腿部各肌肉注射0.5mL，同时腹腔注射1mL致敏，正常组仅以生理盐水处理。致敏第3天时将动物置于自制的雾化箱内雾化吸入1％卵蛋白60秒，观察豚鼠的引喘潜伏期(即从喷雾开始到哮喘发作、呼吸极度困难，直至抽搐跌倒的时间)，引喘潜伏期>120秒者不选用。

随机选用上述致敏豚鼠224只，雌雄各半，分为28组，每组8只，开始灌胃给药(具体见下述)，共给药14天，药物均用生理盐水进行溶解，正常对照组及模型组给予生理盐水，具体如下：

(1)健康对照组：未致敏豚鼠8只，予盐水5mL灌胃14天，每天两次；

(2)模型组：致敏鼠8只，用生理盐水5mL灌胃14天，每天两次；

(3)服用泼尼松和福莫特罗组合物组(本发明实施例1)：致敏鼠8只，用泼尼松和福莫特罗组合物制剂(0.12mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(4)单独服用(3)组对应剂量泼尼松组：致敏鼠8只，单独用泼尼松(0.12mg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(5)单独服用(3)组对应剂量福莫特罗组：致敏鼠8只，单独用福莫特罗(7.4μg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(6)服用泼尼松和克仑特罗组合物组(本发明实施例3)：致敏鼠8只，用泼尼松和克仑特罗组合物制剂(2.2mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(7)单独使用(6)组对应剂量泼尼松组：致敏鼠8只，单独用泼尼松(2.2mg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(8)单独使用(6)组对应剂量克仑特罗组：致敏鼠8只，单独用克仑特罗(1.4μg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(9)服用泼尼松和氨茶碱组合物组(本发明实施例2)：致敏鼠8只，用泼尼松和氨茶碱组合物制剂(9.6mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(10)单独使用(9)组对应剂量泼尼松组：致敏鼠8只，单独用泼尼松(0.35mg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(11)单独使用(9)组对应剂量氨茶碱组：致敏鼠8只，单独用氨茶碱(9.3mg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(12)服用泼尼松龙和福莫特罗组合物组(本发明实施例7)：致敏鼠8只，用泼尼松龙和福莫特罗组合物制剂(0.12mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(13)单独使用(12)组对应剂量泼尼松龙组：致敏鼠8只，单独用泼尼松龙(0.12mg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(14)单独使用(12)组对应剂量福莫特罗组：致敏鼠8只，单独用福莫特罗(1.9μg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(15)服用泼尼松龙和克仑特罗组合物组(本发明实施例9)：致敏鼠8只，用泼尼松和克仑特罗组合物制剂(2.8mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(16)单独使用(15)组对应剂量泼尼松龙组：致敏鼠8只，单独用泼尼松龙(2.8mg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(17)单独使用(15)组对应剂量克仑特罗组：致敏鼠8只，单独用克仑特罗(4.2μg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(18)服用泼尼松龙和氨茶碱组合物组(本发明实施例10)：致敏鼠8只，用泼尼松龙和氨茶碱组合物制剂(5.0mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(19)单独使用(18)组对应剂量泼尼松龙组：致敏鼠8只，单独用泼尼松龙(0.35mg/kg)5mL，每天2次，灌胃14天；

(20)单独使用(18)组对应剂量氨茶碱组：致敏鼠8只，单独用氨茶碱(4.6mg/kg)5mL，每天2次，灌胃14天；

(21)服用甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物组(本发明实施例14)：致敏鼠8只，用甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物制剂(0.19mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(22)单独使用(21)组对应剂量甲基泼尼松龙组：致敏鼠8只，单独用甲基泼尼松(0.19mg/kg)5mL，每天2次，灌胃14天；

(23)单独使用(21)组对应剂量福莫特罗组：致敏鼠8只，单独用福莫特罗(9.3μg/kg)5mL，每天2次，灌胃14天；

(24)服用甲基泼尼松龙和克仑特罗组合物组(本发明实施例15)：致敏鼠8只，用甲基泼尼松龙和克仑特罗组合物制剂(0.28mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天；

(25)单独使用(24)组对应剂量甲基泼尼松龙组：致敏鼠8只，单独用甲基泼尼松(0.28mg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(26)单独使用(24)组对应剂量克仑特罗组：致敏鼠8只，单独用克仑特罗(6.9μg/kg)5mL灌胃，每天2次，灌胃14天；

(27)服用甲基泼尼松龙和氨茶碱组合物组(本发明实施例13)：致敏鼠8只，用甲基泼尼松龙和氨茶碱组合物制剂(20.7mg/kg)5mL灌胃，每天2次，共14天。

(28)单独使用(27)组对应剂量甲基泼尼松龙组：致敏鼠8只，单独用甲基泼尼松(2.2mg/kg)5mL，每天2次，灌胃14天；

(29)单独使用(27)组对应剂量氨茶碱组：致敏鼠8只，单独用氨茶碱(18.5mg/kg)5mL，每天2次，灌胃14天；

2.测定引喘潜伏期

末次给药1小时后进行引喘试验，将动物置于自制的雾化箱内，予雾化吸入1％卵蛋白60秒，试验观察6分钟，以腹肌连续明显收缩三次算作哮喘发作，记录引喘潜伏期。

3.支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度测定

以血管钳夹闭右肺门，于气管壁上剪一T字形切口，于切口处插入前端呈尖端的灌洗管至肺门处，旋转灌洗管以使之插入左主支气管约1cm，缓慢注入温生理盐水3mL，缓慢回抽，将回抽液再次注入支气管中；如此共反复三次，应回抽出至少2mLBALF。取1mL BALF离心，3000转/分×15分钟，取上清液EP管分装，存于-20℃待测。

应用IL-4和IL-5检测试剂盒，按照说明书用酶联免疫吸附试验(ELISA)对上一步骤中所得支气管肺泡灌洗液进行IL-4和IL-5浓度的检测。

4.统计分析：

应用SPSS13.0统计软件包进行分析。方差齐者使用方差分析法，方差不齐者使用秩和检验。确定以P<0.05为有统计学意义。

5.结果：

(1)泼尼松及福莫特罗组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表20和图19所示：与模型组比较，各组对过敏性哮喘潜伏期均有不同程度的延长作用，特别是泼尼松和福莫特罗组合物组，与模型组和单独使用泼尼松及福莫特罗组相比有显著性差异(P<0.05)，提示组合物较单独用药可明显提高过敏性哮喘阈，对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表20：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与福莫特罗组比P<0.05

表21 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与哮喘模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与福莫特罗组比P<0.05

2)如表21和图20所示，各干预组较哮喘模型组的IL-4及IL-5浓度均有不同程度的降低，使用泼尼松和福莫特罗组合物组的IL-4和IL-5浓度均明显低于各干预组，提示泼尼松和福莫特罗的组合物具有更强的抗炎作用。

(2)泼尼松及克仑特罗组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表22和图21所示：与模型组比较，各组对过敏性哮喘潜伏期均有不同程度的延长作用，但均较健康对照组有统计学差异，泼尼松和克仑特罗组合物组与单独使用泼尼松组的相比无统计学差异，但效果优于单独使用克仑特罗组，提示组合物较使用单药泼尼松可明显提高过敏性哮喘阈，对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表22：引喘潜伏期时间比较

*：与健康对照组比P<0.05

#：与模型组比P<0.05

^：与泼尼松组比P<0.05

$：与克仑特罗组比P<0.05

表23 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

*：与健康对照组比P<0.05

#：与哮喘模型组比P<0.05

^：与泼尼松组比P<0.05

$：与克仑特罗组比P<0.05

2)如表23和图22所示：各干预组的IL-4浓度均较哮喘模型组有明显的降低，两药组合物组的浓度较单独使用泼尼松或克仑特罗无统计学差异，同时各干预组的IL-5浓度也较模型组有不同程度的降低，其中以组合物组的效果最为明显，其浓度值低于其它干预组，提示泼尼松和克仑特罗的组合物有更明显地降低气道灌洗液中IL-5浓度的作用。

(3)泼尼松及氨茶碱组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表24和图23所示：与模型组比较各组对过敏性哮喘潜伏期均有不同程度的延长作用，以泼尼松和氨茶碱组合物组效果最明显，与模型组相比有极显著性差异，与其它各干预组比较也有统计学差异，提示组合物较单独用单药可更明显提高过敏性哮喘阈，对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表24：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松组比P<0.05

^$：与氨茶碱组比P<0.05

2)如表25和图24所示，与哮喘模型组相比，各干预组的IL-5浓度均有明显的降低，两药组合物组的浓度较单独使用泼尼松或氨茶碱降低更明显，同时各干预组的IL-4浓度也较模型组有不同程度的降低，其中以组合物组的效果最为明显，提示在改善哮喘鼠气道炎症介质释放作用中，该泼尼松和氨茶碱组合物的效果较对应剂量的两单药更为明显。

表25 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

*：与健康对照组比P<0.05

#：与哮喘模型组比P<0.05

^：与泼尼松组比P<0.05

$：与氨茶碱组比P<0.05

(4)泼尼松龙及福莫特罗组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表26和图25所示：各组较模型组均对过敏性哮喘潜伏期有不同程度的延长作用，泼尼松龙和福莫特罗组合物组与模型组及单独使用两药组相比均有显著性差异，提示组合物较单独用单药可明显提高过敏性哮喘阈，对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表26：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗组比P<0.05

2)如表27和图26所示，各干预组与哮喘模型组相比其IL-4和IL-5浓度均有不同程度的降低，两者均低于单独使用泼尼松龙或福莫特罗组，提示在控制哮喘鼠气道炎症方面，该泼尼松龙和福莫特罗组合物较对应剂量单药有更好的作用。

表27 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与哮喘模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗组比P<0.05

(5)泼尼松龙及克仑特罗组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表28和图27所示：各组较模型组均对过敏性哮喘潜伏期有不同程度的延长作用，以泼尼松龙和克仑特罗组合物组的效果最为明显，与模型组相比有显著性差异，且效果好于其它各干预组，提示组合物较单独用药组可明显提高过敏性哮喘阈，对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表28：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^##：与模型组比P<0.01

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与克仑特罗比P<0.05

2)如表29和图28所示，各干预组的IL-4和IL-5的浓度均较模型组有明显的降低，组合物组和单独使用泼尼松龙组降低两者浓度的效果相当，且明显优于单独使用克仑特罗组，同时组合物组的IL-4浓度水平更接近于健康对照组，提示该组合物具有与对应剂量单用两药更好的抗炎作用。

表29 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与哮喘模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与克仑特罗组比P<0.05

(6)泼尼松龙及氨茶碱组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表30和图29所示：各组较模型组均对过敏性哮喘潜伏期有不同程度的延长作用，但泼尼松龙和氨茶碱组合物组与各干预组相比均有显著性差异，提示组合物较单独使用对应剂量的两药有更明显提高过敏性哮喘阈的作用，对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表30：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^##：与模型组比P<0.01

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱组比P<0.05

2)如表31和图30所示，各干预组与哮喘模型组相比其IL-4和IL-5浓度均有不同程度的降低，组合物组较单用组降低IL-4的作用最为明显，降低IL-5的效果与单用两药相当，提示在控制哮喘鼠气道炎症方面，该剂量泼尼松龙和氨茶碱组合物较对应剂量单药有更好的作用。

表31 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与哮喘模型组比P<0.05

^{^}：与泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱组比P<0.05

(7)甲基泼尼松龙及福莫特罗组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表32和图31所示：与模型组比较各组对过敏性哮喘潜伏期均有不同程度的延长作用，较健康对照组而言尚有统计学差异，且甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物组较其它各干预组均有更明显的延长引喘潜伏期的效果，提示该剂量组合物较对应剂量单药可明显提高过敏性哮喘阈，对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表32：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗比P<0.05

2)如表33和图32所示，较与哮喘模型组相比，各干预组的IL-4及IL-5浓度均有不同程度的降低，使用甲基泼尼松龙和福莫特罗组合物组的IL-4浓度与单用组无统计学差异，但其IL-5浓度低于使用两种单药组，提示该甲基泼尼松龙和福莫特罗的组合物较对应剂量单药具有更强的抗炎作用。

表33 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与哮喘模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与福莫特罗组比P<0.05

(8)甲基泼尼松龙及克仑特罗组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表34和图33所示：各组较模型组均对过敏性哮喘潜伏期有不同程度的延长作用，甲基泼尼松龙和克仑特罗组合物组与各单用药之间无统计学差异，提示组合物与对应剂量单药在提高过敏性哮喘阈方面的作用相当。

表34：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与克仑特罗比P<0.05

2)如表35和图34所示，各干预组较哮喘模型组其IL-4及IL-5浓度均有不同程度的降低，使用甲基泼尼松龙和克仑特罗组合物组的IL-4浓度与单用组无统计学差异，但IL-5浓度明显低于单用组，提示甲基泼尼松龙和克仑特罗的组合物较对应剂量单药具有更强的降低气道IL-5浓度的作用。

表35 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与哮喘模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与克仑特罗组比P<0.05

(9)甲基泼尼松龙及氨茶碱组合物对致敏鼠哮喘发作的影响

1)如表36和图35所示：与模型组比较各组对过敏性哮喘潜伏期均有不同程度的延长作用，但甲基泼尼松龙和氨茶碱组合物组与单独使用甲泼尼龙组的效果相当，但均明显优于氨茶碱组，提示组合物组较与对应剂量甲泼尼龙组的提高过敏性哮喘阈的作用相当，能够对过敏性哮喘豚鼠有较好的保护作用。

表36：引喘潜伏期时间比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱组比P<0.05

2)如表37和图36所示，与模型组相比，各干预组的IL-4和IL-5的浓度均有明显的降低，甲基泼尼松龙和氨茶碱的组合物组的IL-5浓度均低于单独使用甲基泼尼松龙或氨茶碱组，IL-4浓度与单用甲基泼尼松龙组相当，低于单用氨茶碱组，提示该组合物较使用对应剂量单药在一定程度上具有更明显的降低哮喘鼠气道炎症的作用。

表37 支气管肺泡灌洗液中IL-4及IL-5浓度比较

^*：与健康对照组比P<0.05

^#：与哮喘模型组比P<0.05

^{^}：与甲基泼尼松龙组比P<0.05

^$：与氨茶碱组比P<0.05