用于降低疾病发生率和病期的益生菌剂

摘要

本发明提供适于降低人类疾病发生率和病期的益生菌组合物。更具体地，本发明提供适于预防幼儿疾病的方法和组合物。一些具体优选的实施方式中，本发明用于儿童呼吸疾病的预防。

说明书

发明领域

[01]本发明提供适于降低人类疾病发生率和病期的益生菌组合物。更具体地，本发明提供适于预防幼儿疾病的方法和组合物。一些具体优选的实施方式中，本发明用于儿童呼吸疾病的预防。

发明背景

[02]呼吸道感染已被认为是所有传染病中最常见的。上呼吸道感染包括大量急性、炎性过程，其主要涉及鼻、鼻旁窦、中耳、喉会厌(laryngeal-epiglottal)组织和口咽。这些急性感染列为所有年龄的患者需要医药治疗的最频繁的成因。此外，所有传染性呼吸道疾病中很大比例是下呼吸道感染。

[03]尽管多数上呼吸道疾病是自限性的和良性的，它们代表了群体的相当大的社会经济负担。相反，下呼吸道感染通常伴随有威胁生命的过程，其可以严重地危害末端肺泡性肺气道系统，尤其是在具有肺功能改变的个体中。

[04]儿童和老年人存在更大的因上和下呼吸道感染而患重症疾病的风险。与其它个体密切接触的那些人甚至具有更高的风险。事实上，上日间托儿所的儿童比在家庭照顾或在小的家庭群中照顾的儿童具有1.5至3倍增加的胃肠道和呼吸道感染的风险(参见例如，Hatakka等人，BMJ 322：1-5[2001])。除了与此感染相关的直接医疗成本以外，还有父母不工作而照顾患病儿童所招致的间接成本。对于这些疾病中的许多都缺少有效疫苗致使与这些疾病相关的负担。因此，需要帮助预防和/或降低呼吸疾病严重性的组合物和方法。

发明概述

[05]本发明提供适于降低人类疾病发生率和病期的益生菌组合物。尤其是，本发明提供适于预防幼儿疾病的方法和组合物。一些具体优选的实施方式中，本发明用于儿童呼吸疾病的预防。

[06]本发明提供减少儿童呼吸疾病的方法，包括：提供嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)培养物；提供处于患呼吸疾病风险中的儿童；和向处于风险中的儿童施用该嗜酸乳杆菌培养物，在这种条件下以致降低患呼吸疾病的风险。一些优选实施方式中，该培养物还包括其它的细菌菌株。一些特别优选的实施方式中，该其它细菌菌株是乳双歧杆菌(B.lactis)。其它优选的实施方式中，儿童处于学龄前的年龄。一些优选的实施方式中，儿童为约3岁和约5岁之间的年龄。另外其它实施方式中，在秋季或冬季进行给药。一些实施方式中，经口施用培养物。一些优选的实施方式中，以至少一种营养添加剂形式提供培养物。另外其它实施方式中，该方法降低了治疗儿童呼吸疾病而给药抗微生物剂的需要。进一步更优选的实施方式中，该方法防止儿童由于所述呼吸疾病的缺勤。

[07]本发明也提供减少儿童呼吸疾病症状的方法，包括：获得嗜酸乳杆菌的培养物；提供处于患呼吸疾病风险中的儿童；和向处于风险中的儿童施用嗜酸乳杆菌的培养物，在这种条件下以致减少儿童的呼吸疾病症状。一些特别的实施方式中，该培养物还包括其它的细菌菌株。一些具体优选的实施方式中，该其它细菌菌株是乳双歧杆菌。其它优选的实施方式中，儿童处于学龄前的年龄。一些优选的实施方式中，儿童为约3岁和约5岁之间的年龄。另外其它实施方式中，在秋季或冬季进行给药。一些实施方式中，通过口施用培养物。一些实施方式中，以至少一种营养添加剂形式提供培养物。一些实施方式中，该呼吸疾病症状包括发烧、咳嗽、流涕、头痛、肌肉疼痛、喉咙痛、鼻塞、不适、腹泻和呕吐中的至少一种症状。另外其它实施方式中，该方法降低了治疗儿童呼吸疾病所需要的抗微生物剂给药。进一步更优选的实施方式中，该方法防止儿童由于所述呼吸疾病的缺勤。

[08]本发明还提供预防儿童呼吸疾病的方法，包括：提供嗜酸乳杆菌的培养物；提供儿童；和向儿童施用嗜酸乳杆菌的培养物，在这种条件下致使该儿童在随后暴露于能引起呼吸疾病的生物时不患呼吸疾病。一些优选的实施方式中，该培养物还包括其它的细菌菌株。一些特别优选的实施方式中，该其它细菌菌株是乳双歧杆菌。其它优选的实施方式中，儿童处于学龄前的年龄。一些优选的实施方式中，儿童为约3岁和约5岁之间的年龄。然而，本发明并不旨在局限于这一年龄范围，如所预期的本发明将用于多种其它年龄。另外其它的实施方式中，在秋季或冬季进行给药。然而，本发明并不旨在局限于那些特定季节，如所预期的本发明将用于其它季节。一些实施方式中，经口给予培养物。一些实施方式中，以至少一种营养添加剂形式提供培养物。一些实施方式中，呼吸疾病症状包括发烧、咳嗽、流涕、头痛、肌肉疼痛、喉咙痛、鼻塞、不适、腹泻、和呕吐中的至少一种症状。另外其它实施方式中，该方法降低了治疗儿童呼吸疾病所需要的抗微生物剂给药。进一步更优选的实施方式中，该方法防止儿童由于所述呼吸疾病的缺勤。

[09]本发明也提供预防儿童呼吸疾病症状的方法，包括：提供嗜酸乳杆菌的培养物；提供儿童；和向儿童施用嗜酸乳杆菌的培养物，在此情况下致使该儿童在随后暴露于能产生呼吸疾病症状的生物时不发生呼吸疾病症状。一些优选的实施方式中，该培养物还包括其它的细菌菌株。一些特别优选的实施方式中，该其它细菌菌株是乳双歧杆菌。其它优选的实施方式中，儿童处于学龄前的年龄。一些优选的实施方式中，儿童为约3岁和约5岁之间的年龄。另外其它实施方式中，在秋季或冬季进行给药。一些实施方式中，通过口给予培养物。一些实施方式中，以至少一种营养添加剂形式提供培养物。一些实施方式中，该呼吸疾病症状包括发烧、咳嗽、流涕、头痛、肌肉疼痛、喉咙痛、鼻塞、不适、腹泻和呕吐中的至少一种症状。另外其它实施方式中，该方法降低了治疗儿童呼吸疾病所需要的抗微生物剂给药。进一步更优选的实施方式中，该方法防止儿童由于所述呼吸疾病的缺勤。

[10]本发明也提供单独使用嗜酸乳杆菌或其与乳双歧杆菌组合使用以制备适合降低儿童呼吸疾病风险的组合物的方法。另外其它实施方式中，本发明也提供单独使用嗜酸乳杆菌或其与乳双歧杆菌组合使用以制备适合减少儿童呼吸疾病症状的组合物的方法。更进一步的实施方式中，本发明也提供单独使用嗜酸乳杆菌或其与乳双歧杆菌组合使用以制备适于预防儿童在随后暴露于能在儿童中引起呼吸疾病的生物时患呼吸疾病的组合物的方法。更进一步的实施方式中，本发明也提供单独使用嗜酸乳杆菌或其与乳双歧杆菌组合使用以制备适于预防儿童在随后暴露于能在儿童中引起呼吸疾病的生物时患呼吸疾病的组合物的方法。更进一步的实施方式中，本发明也提供单独使用嗜酸乳杆菌或其与乳双歧杆菌组合使用以制备适于预防儿童在随后暴露于能在儿童中引起呼吸疾病的生物时经历和/或产生呼吸疾病症状的组合物的方法。更进一步的实施方式中，该方法降低了治疗儿童呼吸疾病所需要的抗微生物剂给药。进一步更优选的实施方式中，该方法防止儿童由于所述呼吸疾病的缺勤。

[11]也预期所有上述方法将单独或与每种其它方法组合使用。还预期该方法将与用于预防和/或减少呼吸疾病和/或呼吸疾病症状的其它手段组合使用。

附图说明

[12]图1提供了示出研究组具有明显症状的时间百分数的图表。

发明说明

[13]本发明提供适于降低人类疾病发生率和病期的益生菌组合物。更具体地，本发明提供适于预防幼儿疾病的方法和组合物。一些具体优选的实施方式中，本发明用于儿童呼吸疾病的预防。

[14]尤其是，本发明提供适合用于人类受试者的乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的益生菌培养物。一些具体优选的实施方式中，提供嗜酸乳杆菌，而一些替代的优选实施方式中，提供动物双歧杆菌(B.animalis)。另外其它实施方式中，提供动物双歧杆菌乳酸亚种(本文也称作“乳双歧杆菌”)。更进一步具体优选的实施方式中，提供这些生物的组合。

[15]本发明研发期间，发现嗜酸乳杆菌单独和与动物双歧杆菌乳酸亚种组合为预防类似流感症状(例如，发烧、咳嗽、流涕等)提供了显著的保护作用。除了预防类似流感症状，这些生物单独或组合给药导致个体表现症状的日期显著减少。

[16]因此，本发明就预防儿童疾病而言提供许多益处，其也降低疾病对于家庭(例如，直接医疗成本)以及父母缺勤而照顾患病儿童的经济影响。由于表现出对呼吸感染的明显影响，许多工作都针对于预防和降低该疾病的严重性。例如，研发了主张对改善儿童健康有效的营养添加剂，其包括含有乳双歧杆菌(BB-12)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)(ATCC 55730)的益生菌组合物。发现，向在托儿所的婴儿给予补充有这一益生菌的制剂导致婴儿较少且较短的腹泻发作，但不会影响呼吸症状(Weitzman和Alsheikh，Pediatrics 1 15：5-9[2005])。

[17]本发明研发期间，评估了与学龄前儿童消耗益生菌剂产品相关的作用。当一年中疾病在儿童以及成人中更流行(即九月中至二月中)时，每日摄取这些产品两次，为期六个月。特别地，针对上日间托儿所的学龄前儿童的疾病类似流感症状的降低，评估了标准化乳制品中的益生菌剂(例如，1％全脂乳或另一益生菌剂产品)的消耗。这一评估也包括儿童患病但仍上托儿所/幼儿园的天数，以及从疾病开始的恢复期。此外，也评估了其它疾病的发生/未发生，以及营养参数(包括体重增加或者减少)。

定义

[18]除非另有指明，本发明的实践包括食物微生物学、营养添加剂、儿科病、流行病学、分子生物学、微生物学、蛋白质纯化和工业酶应用和研发领域通常使用的常规技术，其所有都属于本领域的技能。本文的上下文中提及的所有专利、专利申请、文章和出版物都在此明确地通过引用作为参考。

[19]此外，本文提供的题目不局限于本发明的多个方面或实施方式，其可以通过参考作为整体的说明书而具有。因此，就在下面限定的术语通过参考作为整体的说明书而更全面地限定。然而，为了帮助理解本发明，下面提供一些术语的定义。

[20]除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology And Molecular Biology(第二版，John Wiley和Sons，NY，1994)；以及Hale和Margham，The HarperCollins Dictionary of Biology(Harper Perennial，NY，1991)为本领域技术人员提供了本文所用术语中许多的普通释义。尽管与本文所述那些相似或等效的任何方法和材料可用于实践本发明，但本文描述了优选的方法和材料。因此，就在下面限定的术语通过参考作为整体的说明书而更全面地限定。另外，如本所使用，除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一”和“该”包括复数参考。应理解，本发明并不限于具体方法学、操作方法和所述反应试剂，本领域技术人员可根据使用它们的上下文而改变它们。

[21]贯穿本说明书所给出的每个最大数限旨在包括每个较小的数限，就如同本文明确书写了该较小的数限一样。贯穿本说明书所给出的每个最小数限将包括每个较大的数限，就如同本文明确书写了该较大的数限一样。贯穿本说明书所给出的每个数值范围将包括落入该较宽数值范围内的每个较窄的数值范围，就如同本文明确书写了该较窄的数值范围一样。

[22]如本文所使用，术语“食物”指任何向植物和/或动物提供营养的营养产品。该术语并不旨在局限于任何具体产品，因为其用于指由植物或动物为存活而摄取和同化的任何物质。该术语也不旨在限于“固态”食物，因为该定义也包括液态营养物。事实上，一些实施方式中，液态营养物比固态食物产品更优选。一些优选的实施方式中，该术语具体用于指人类消耗的食物。

[23]如本文所使用，术语“饲料”指向非人动物提供营养的任何营养产品。该术语并不旨在局限于任何具体产品，因为其用于指任何由植物或动物为存活而摄取和同化的物质。该术语也不旨在限于“固态”食物，因为该定义也包括液态营养物。事实上，一些实施方式中，液态营养物比固态食物产品更优选。

[24]如本文所使用，术语“营养添加剂”和“膳食添加剂”指任何加入膳食中的产品。一些具体优选的实施方式中，通过口摄入营养添加剂且其通常含有一或多种膳食成分，包括但不限于维生素、矿物质、草本、氨基酸、酶和生物培养物。

[25]如本文所使用，术语“营养辅助品”指被认为和/或被摄取以提供健康益处的食物/膳食添加剂。

[26]如本文所使用，术语“益生菌剂”指对健康有益的活微生物食物成分。

[27]如本文所使用，术语“益生元”指有益地影响摄取该益生元的人和/或其它动物的不可消化的食物成分。优选实施方式中，益生元选择性地促进肠道中至少一类细菌的生长和/或活性，以至于改善人和/或其它动物的健康。

[28]如本文所使用，术语“合生素(synbiotic)”指益生元和益生菌剂的混合物。

[29]如本文所使用，术语“疾病”和“疾症”指任何由症状和迹象的特征集合所显示的任何身体部分、器官或系统的正常结构和/或功能的偏离或中断。该术语包括已知或未知病因学和/或病理学的疾病状况。

[30]如本文所使用，术语“治疗”指提供导致疾病、紊乱或疾病症状或疾病状况的改善、减轻和/或补救的组合物。

[31]如本文所使用，术语“口服给药”和“经口”指经口摄入食物和/或添加剂。

[32]如本文所使用，术语“疾病预防”和“疾症预防”指采用措施来避免疾病/疾症发生。一些实施方式中，采用“预防性的”措施以便避免疾病/疾症。

[33]如本文所使用，术语“疾病的症状”指疾病和/或患者的疾病状况的任何主观感知。其用于指任何如由患者所感知的此类迹象。

[34]如本文所使用，术语“疾病的迹象”指疾病/疾症存在的指示。其用于指任何可由检查医生和/或其它保健提供者察觉的疾病的客观迹象。

[35]如本文所使用，术语“缺勤”指由于疾病而不上托儿所和/或幼儿园的缺席率。其也指由于疾病而不上学和/或不去工作。一些具体优选的实施方式中，本发明的方法减少儿童由于疾病(例如，呼吸疾病)而缺勤托儿所和/或缺勤幼儿园。

[36]如本文所使用，术语“病态”指疾病/疾症。

[37]如本文所使用，术语“致死”指死亡。

[38]如本文所使用，术语“发生率”指某些事件发生的比率，如在某时间段特定疾病发生的新病例的数量。

[39]如本文所使用，术语“流行”指某时间给定群体中存在的特定疾病和/或疾病状况的病例的总数。

[40]如本文所使用，术语“呼吸道”指参与呼吸的系统。呼吸道通常分为三部分，即上呼吸道(即，鼻、鼻道、鼻旁窦、喉/咽)，呼吸气道(即，喉头、气管、支气管和细支气管)，以及下呼吸道(即肺，其由呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡组成)。

[41]如本文所使用，术语“呼吸疾病”指呼吸道的任何疾病。

[42]如本文所使用，术语“流感”和“流行性感冒”指由任何流行性感冒病毒引起的传染性呼吸疾病。

[43]如本文所使用，术语“类似流感症状”指通常与流行性感冒有关的症状，包括但不限于咳嗽、流涕、鼻阻塞(即“鼻塞”)、喉痛、发烧、肌肉痛(即肌痛)、胃痛、头痛、不适、腹泻、呕吐、耳痛、中耳炎等。

[44]如本文所使用，术语“后遗症”指作为疾病状况和/或疾病事件结果所发生的疾病/疾症和症状/迹象。一些实施方式中，后遗症在消除初始疾病/疾症后发生很长的一段时间。

[45]如本文所使用，术语“亚临床感染”指不导致疾病的迹象或者症状产生/被观察到的感染。通常，患者由引起疾病的生物感染，但却没有意识到该感染。

[46]如本文所使用，术语“感染”指病原微生物在身体中的侵入和增殖。

[47]如本文所使用，术语“胃肠道”(“GI”)指从口腔到直肠的整个消化道。该术语包括从口延伸到肛门的管，其中肌肉运动以及激素和酶释放来消化食物。消化道从口开始，继续至食管、胃、小肠、大肠、直肠和最终到肛门。

[48]如本文所使用，术语“胃肠道菌群”指居住于人和其它动物胃肠系统中的微生物。一些具体优选的实施方式中，该术语用于指细菌生物，但该术语并不旨在被如此限制。

[49]如本文所使用，术语“儿童”和“儿童们”指18岁以下的年轻人。

[50]如本文所使用，术语“婴儿”指1岁以下的儿童。“新生儿”是刚出生的婴儿(即从出生至约4周龄)。

[51]如本文所使用，术语“幼儿”指学习走路的儿童。通常，该术语用于指一和三岁之间的儿童。

[52]如本文所使用，术语“学龄前儿童”指上幼儿园的儿童，以及太小还不能上学前班的儿童。一些优选的实施方式中，该术语用于指幼儿和学龄群体之间的儿童(例如，约两岁和5岁之间)。

[53]如本文所使用，术语“学龄儿童”指年龄适合上学，尤其是学前班到高中的儿童。

[54]如本文所使用，术语“培养物”指任何含有一或多种微生物的样品或产品。“纯培养物”是其中存在的生物仅仅是具体属和种的一种菌株的培养物。这与“混合培养物”相反，“混合培养物”是其中存在一种以上的微生物属和/或种的培养物。本发明一些实施方式中，使用纯培养物。例如，一些具体优选的实施方式中，使用乳杆菌(例如嗜酸乳杆菌)的纯培养物。然而，替代的实施方式中，使用混合培养物。例如，一些具体优选的实施方式中，使用由嗜酸乳杆菌和双歧杆菌属组成的培养物。

[55]如本文所使用，术语“乳杆菌”指乳杆菌科(Lactobacillaceae)中，乳杆菌属(Lactobacillus)属的成员。这些细菌是代表细菌群中大部分通常称作“乳酸菌”的革兰氏阳性兼性厌氧菌。已经鉴定了乳杆菌的多个种，包括但不限于嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、干酪乳杆菌(L.casei)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)等。虽然本发明并不旨在局限于乳杆菌的任何具体物种，但一些具体优选实施方式中，本发明使用嗜酸乳杆菌NFCM。该属旨在包括已经被重新分类的物种(例如，由于遗传和其它研究导致的生物物种形成的改变)。

[56]如本文所使用，术语“双岐杆菌”指双岐杆菌属的成员。这些细菌是胃肠道菌群中存在的主要细菌菌株的一类革兰氏阳性厌氧菌。虽然本发明并不旨在局限于双岐杆菌属的任何具体物种，但一些具体优选实施方式中，本发明使用乳双岐杆菌Bi-07。该属旨在包括已经被重新分类的物种(例如，由于遗传和其它研究导致的生物物种形成的改变)。

[57]如本文所使用，术语“抗微生物剂”指任何抑制微生物生长或杀死微生物的化合物。该术语旨在以其最广义方面使用且包括但不限于诸如天然或合成产生的抗生素的化合物。该术语还旨在包括用于抑制微生物生长或杀死微生物的化合物和元素。一些优选实施方式中，本发明降低向处于患呼吸疾病风险中或经历呼吸疾病的儿童施用抗微生物剂的需要。

[58]如本文所使用，术语“微生物培养基”、“培养物培养基”和“培养基”指任何适于微生物生长和繁殖的物质。该术语包括固体平板培养基，以及半固体和液体微生物生长体系。

[59]如本文所使用，术语“秋季”指通常被认为是在秋天或秋日存在的那些月份。在北半球，这些月份包括九月、十月和十一月。在南半球，这些月包括三月、四月和五月。

[60]如本文所使用，术语“冬季”指通常被认为是在冬天存在的那些月份。在北半球，这些月份包括十二月、一月和二月。在南半球，这些月包括六月、七月和八月。

[61]如本文所使用，术语“春季”指通常被认为是在春天存在的那些月份。在北半球，这些月份包括三月、四月和五月。在南半球，这些月包括九月、十月和十一月。

[62]如本文所使用，术语“夏季”指被认为是在夏天存在的那些月份。在北半球，这些月份包括六月、七月和八月，在南半球，这些月包括十二月、一月和二月。

实施例

[63]为了阐述并进一步解释本发明某些优选的实施方式和方面，提供下面的实施例，但并不认为该实施例限制本发明的范围。

[64]在下面的实验公开内容中，使用下面的缩写：℃(摄氏度)；H₂O(水)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩)；μM和uM(微摩)；U(单位)；sec(秒)；min(s)(分)；hr(s)(小时)；sd和SD(标准差)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；w/v(重量/体积)；v/v(体积/体积)；CFU(菌落形成单位)；和NCFM(北卡罗来那食品微生物局)；Becton Dickinson(Becton Dickinson诊断系统，Sparks，MD)；(Difco实验室，Detroit，MI)；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；ATCC(美国典型培养物中心，马纳萨斯，VA)。

[65]用于研发本发明的生物是嗜酸乳杆菌NCFM(PTA-4797)和动物双歧杆菌乳酸亚种Bi-07(PTA-4802)。于37℃，在含有0.05％半胱氨酸的MRS培养基(例如，Difco，Becton Dickinson)中生长这些菌株。在含有H₂/CO₂空气(Becton-Dickinson)的BBL GASPAK^TM厌氧罐中孵育培养物48-72h。对于大规模生产，在发酵培养基中生长该菌株，使用本领域已知的方法通过离心收集并cryostabilized。冻干该cryostabilized的溶液。将冻干的培养物标准化以在每种培养物中提供想要的细菌数，使用葡萄糖作为稀释剂用于按照本领域已知所进行的计数方法。

[66]通过向低湿气渗透速率的箔袋封装中加入含有益生菌剂材料和适当的载体赋形剂生产在研发本发明中使用的袋以提供5⁹个细菌/g材料。向乳中加入两袋并以每日1¹⁰个细菌的剂量每日消耗摄入。然而，本发明并不旨在局限于任何具体的剂量水平，如预期的本发明将使用一定的剂量范围。

[67]在检查研发本发明期间获得的数据时，编写来自问卷调查、医生就诊(当适用时)、患病天数、发病率、持续期和特定疾病(例如腹泻)发作的信息来确定用益生菌剂治疗对健康产生了什么影响。益生菌剂测试组1和2每日接受2剂量的益生菌剂，每周七天，其中每周只有5天在日间托儿所发生给药而每周剩下的两天在家进行给药。第3组(安慰剂组)按照与第1和2组相同的时间表，每周7天中每日接受安慰剂两次。

A.研究设计

[68]该研究设计由在6个月期间，随机、双盲、安慰剂作为对照的研究组成。通过双盲随机程序对每间托儿所的受试者分配添加剂制剂(第1和2组)或对照制剂(第3组)，并且受试者在处于托儿所的时间内接受该分配的配方。

[69]该研究的参与者是年龄在3到5岁的学龄前儿童，无性别限制，没有先天疾病或有助于频发疾病的解剖学改变。该研究排除对乳制品有禁忌症(例如乳糖不耐受、或牛蛋白质反应(牛奶变应反应)的学龄前儿童。此外，该研究排除具有下述疾病历史的参与者：炎性疾病、肠病、节段性回肠炎、结肠炎、乳糜泻、呼吸窘迫相关疾病复发而导致的慢性咳嗽、希什斯普隆氏病、囊性纤维化或任何其它代谢的、神经学的、解剖学的改变，例如便秘或胃肠功能窘迫(慢性腹泻)症状。此外，也排除目前服用一些其它形式的益生菌剂添加剂(例如Yakult)的儿童。然而，本发明并不旨在局限于用于仅仅对没有先天性疾病和/或有助于频发病症的解剖学改变的儿童进行疾病预防，如所预期的本发明将在上述这些组中广泛使用并证明对于预防疾病是有价值的。

[70]如上所指出，有3组，每组有85名参与者(即总共255名儿童)。向该3组中的每组分配代替的可变名称而不仅是将它们称作“第一组”、“第二组”和“第三组”。因此，一些情况下，将这些组称作95、94和93，如下所述。第3组每周在日间托儿所接受5天每日两次的安慰剂和每周在家接受2天每日两次的安慰剂。由父母、监护人或指定的家庭成员进行在家给药。由指定的日间托儿所代表在日间托儿所进行给药。第一组和第二组接受益生菌剂产品。第一组和第二组的成员按照与第三组相同的给药时间表接受益生菌剂。益生菌剂的典型每日剂量是1¹⁰至10¹⁰个菌落形成单位/ml的菌株。然而，本发明并不旨在局限于这一特定剂量或剂量方案。一些优选的实施方式中，该剂量约10⁸至约10¹²CFU/天，而其它优选实施方式中，该剂量是约10⁹至约10¹¹CFU/天。此外，一些实施方式中，每日给药一次益生菌剂产品，而替代的实施方式中，每日发生两次或更多次给药。一些具体优选的实施方式中，每日发生两次给药。

[71]第一组的85名参与者接受含嗜酸乳杆菌NCFM(益生菌剂产品A)的益生菌剂产品而第二组的85名参与者接受含两种菌株(即嗜酸乳杆菌NCFM和乳双岐杆菌Bi-07(益生菌剂产品B)的益生菌剂产品，其中每一菌株组成一半的每日剂量。

[72]对于第一组和第二组的益生菌剂产品(或袋)的摄取剂量由170-250ml标准1％全脂乳组成。为了便于使用和运输，将益生菌剂产品容纳在箔袋中。按照170-250ml乳中5⁹个细菌的剂量施用，每日总剂量为10¹⁰细菌。箔袋中的内容物在消耗时才分散到乳中。提供含有安慰剂和益生菌剂的箔袋，以便向乳中加入袋的内容物对于所有组是共同的。每日提供总量为170-250ml的剂量两次，持续6个月。这些剂量与食物(由零食和正餐组成)一起摄入。在温度保持在18至20℃的配制室制备添加剂。向乳中加入添加剂粉末，搅拌，并在5分钟内给儿童。儿童在公共指定区域接受该添加剂。

[73]从十一月开始该研究，其中N＝326名儿童(第三组104名，第一组112名而第二组110名)并在五月结束，其中N＝248(第三组92名，第一组77名而第二组79名)。十一月和五月的净差别在于少了78名儿童(第三组12名，第一组35名而第二组31名)。参与者中有144名男性和182名女性，年龄为3-5岁，且全部是华人血统。

[74]儿童每日在早6:40-8:40的时间期限内到达而在下午3:50-4:40的时间期限离开。唯一可获得的饮料(除了该研究添加剂以外)是水。儿童家庭组成为农民、政府雇员和教师。儿童必须获得提供给中国儿童的标准疫苗。

[75]根据地方内科医生研究人员对于当地学龄前儿童中流行病的数据，这一研究允许包括这些疾病的频率以确定这些儿童对该益生菌剂产品中任一种(益生菌剂产品A或益生菌剂产品B)的消费或消耗是否导致这些疾病发生率的降低。事实上，根据170名参与者(第一和二组的组合)，提供了检测中-大效应的t-检验，其效能至少为80％和α水平为0.05。该研究也允许包括由地方儿科医生/内科医生预先确定的其它参数以确定这一产品对学龄前儿童健康的益处。该研究也用于确定在施用益生菌剂产品时是否可以少用抗微生物剂，从而导致减少使用抗微生物剂。

[76]对每位参与者提供问卷调查，以便确定参与者的合格和不合格的因素(或包括和不包括标准)。例如，要求参与者的家庭有足够的针对产品的冷藏空间，且要求每名儿童(每组中)的父母或监护者签署弃权声明，以同意在家提供添加剂并追踪及向日间托儿所代表报道任何疾病迹象/疾病症状。

[77]在每个日间托儿所场所由指定的托儿所代表利用父母或监护人提供的信息完成最初的问卷调查。父母和指定的日间托儿所代表提供最初的信息确认。该研究的临床协调员(即内科医生研究人员)从每间日间托儿所所长(即负责日间托儿所的人，或院长)处收集所有的日间托儿所的完成的表格。日间托儿所代表和每位学龄前儿童的父母/监护人提供对任何疾病症状的症状检查表的每日记录、缺勤日间托儿所以及缺勤的原因，任何医生诊断、抗微生物剂的处方(细节)、和导致缺勤的具体症状(不是导致缺勤的所有症状)。日间托儿所代表确保儿童每次缺勤托儿所时从父母/监护人处的信息的协调。指定的日间托儿所代表每日复查该症状单并在还包括日间托儿所所长的每周例会上向临床协调员(内科医生)提供该症状单。指定的日间托儿所代表、托儿所所长、(和临床协调员(内科医生))都不清楚哪种制剂供给了对照组而那种制剂供给了益生菌组。

B.日间托儿所场所的确认

[78]内科医生研究人员(或内科医生认命的护士)检查12至15个托儿所，最终选择是在亚洲西部区域选择了8家托儿所。所有的益生菌产品和所有的安慰剂产品放在亚洲指定位置的冷藏区域储存直到递送至该场所。

[79]确认日间托儿所场所以保证彼此间可相互比较该研究设置。因此，定位的托儿所使每间托儿所通常提供相似的注册学龄前儿童数、可到职员工、日间托儿所服务价格、以及制冷设备。使用问卷调查将关于托儿所的信息汇总，包括关于学龄前儿童数、雇员数、顾客分类(收入)、每位学龄前儿童的成本、学龄前儿童是否在托儿所就餐或自带食物，学龄前儿童通常接送的时间等问题。通过邮政服务由托儿所所长将完成的调查问卷返回。选择之前，内科医生研究人员或内科医生认命的护士评估每间托儿所的清洁卫生。开始研究之前，内科医生研究人员与托儿所的拥有者以及员工见面以确认问题是否显著并引起反馈及评估追踪方法和工具，例如与父母关于缺勤进行随后的接触。为了进一步保证该调查问卷提供适当的数据，内科医生研究人员确保统计人员贯穿研究进行统计分析，以便鉴定出该研究涉及的任何问题并补救它们来满足研究的需要。

C.出勤表格文件

[80]每天日间托儿所代表完成出勤单。每单列出地点、代表(即收集信息的人)、班或组的大小、以及参与者姓名。核对环节询问参与者是否出勤(是/否)、参与者是否表现为生病(是/否)、参与者是否展现类似流感症状或其它疾病相关的症状(是/否)、参与者是否有腹泻事件(是/否)。如果有腹泻事件，还有参与者在一天内是否有超过2次的腹泻事件的问题(是/否)、是否服用了第一剂量的产品(是/否)和是否服用了第二剂量的产品(是/否)。如果儿童缺勤，在他们回来时，填写关于儿童是否就医(是/否)、是否接受任何抗微生物剂(是/否)和儿童是否接受任何其它疾病相关的治疗(是/否)的部分。为了确证数据收集，内科医生(或内科医生任命的护士)对日间托儿所进行随机访问以便复查记录并确保每日完成记录。每间日间托儿所所长确保该日间托儿所代表为内科医生研究人员收集所有的调查问卷以及任何其它有关的研究表格，并且日间托儿所所长确保将该信息提供给内科医生研究人员。参与者的父母使用症状的检查单来记载疾病症状以及该疾病是否关系到缺勤。

[81]认为缺勤是与症状相关的测量因子。因此，评估缺勤对儿童所遇症状的影响。以系统和综合的形式收集缺勤数据，其不依赖于父母或教师的回忆能力，相反仅仅依赖官方学校记录信息。对于因类似流感的症状、其它疾病和个人的或未知的原因中每一个都追踪引起的缺勤的实际日期。

D.结果测量

[82]测量包括患疾病相关或类似流感症状的天数、由于疾病或发烧而缺勤日间托儿所的天数、由医生诊断为“流感”、疾病或“类似流感”症状和任何预诊断因素，例如开出抗微生物剂的疗程。其它记录的症状包括腹泻的频率和持续期以及任何其它疾病相关的症状。例如，记录其它症状如耳感染或头痛或者导致参与者缺勤的原因。对于每位参与者确定大体的健康分数。为了确保该结果不因抗微生物剂给药而曲解，服用微生物剂和益生菌的参与者的数据分开使得分别追踪那些参与者中仅服用益生菌的参与者。此外，记录由于“类似流感”症状而向对照组中的参与者施用抗微生物剂，因为抗微生物剂可能减少由于疾病而缺席的天数。此外，如上所指出，在研究前和完成研究时测量参与者的体重。

[83]研究过程中，按照下面的症状表，评估确定为“类似”流感症状的8种症状，其包括恶心、呕吐/腹泻、体痛、头痛、咽痛(喉咙痛)、流涕、头痛、和发烧。将呕吐和腹泻当作一类但是追踪单独的呕吐记录，并且整个研究过程中只有6名儿童经历呕吐。在研究过程中没有记载第二症状。

[84]上医院(看医生的通常场所)的儿童除了传统医学，通常按照西医方法接受治疗。这些看病过程通常包括记录儿童体温和在适当的时候开出抗微生物剂。注意到在安慰剂组中，发现抗微生物剂的使用更加普遍。

[85]在症状评分单上列出消耗的益生菌剂量与患有症状的天数之间的关系。此外，记录由于发烧缺勤的天数、和感冒症状、腹泻事件(发病和持续)的天数、以及抗微生物剂处方(药物类型和剂量)的记载，以及由于疾病相关症状而需服用的其它药物的摄取。每日记录益生菌剂摄入量的记录表，和为临床协调员标记每天少于200ml的摄取。在每第二次测量后，使用症状评分单来确定疾病症状的程度。

E.统计分析

[86]分析计划包括确定三个研究组之间关于年龄、性别和体重的平衡；通过包括年龄和研究组的影响因子计算的症状率；和各组之间就症状率和持续期而言的幅度和显著性差异的单变量和多变量确定以及针对其的检验。在各组之间对于象年龄和体重的连续变量的显著性差异的单变量检验(以检验他们的平衡)使用方差分析(ANOVA)技术。关于缺勤，对于三个研究组提供概要统计学(summary statistics)，且包括平均数、标准差、25％、50％(中值)和75％截点，以及最大和最小值(即离群值)。使用ANOVA技术调查研究组之间的缺勤差异的初始分析。使用用于多重比较的Dunnett氏检验进行一种和两种菌株组与安慰剂组间的比较。

[87]对于人口统计学变量(例如年龄、性别、和初始体重)、生存环境、益生菌剂消耗量、症状频率等使用叙述性统计。通过t检验连续测量疾病、“类似流感”症状或其它疾病相关症状的天数，或者因疾病的总缺勤天数以允许不同组间的多重比较。完成ANOVA检验后进行这些分析。进行Cox氏或类似回归分析法来调整混杂因子(例如年龄)。用Fisher氏精确或类似检验来二分化(无/一或多)和分析“类似流感”症状数和益生菌摄取。计算乳(或指定产品)消耗和疾病天数之间的部分相关性。ANOVA。

[88]使用针对主要结果变量的t检验对不同组进行多重比较。一旦确定数据和统计差异，那么使用t检验来确定哪组不同并调整α以避免I型误差膨胀。由于有3组，而对组的检验在一段时间内(6个月)发生，因此不期望出现I型误差。研究最后，当存在终点时，根据经历或没有经历类似流感或疾病相关症状的参与者数，使用独立性卡方检验来观察对于经治疗的和未经治疗的参与者比较的结果。对于这些分析，需要总计105名参与者以保证效能为90％和α水平为.05。然而，其它实施方式预期，将使用不同的效能和/或α水平(例如0.05α水平)。用SPSS或其它计算统计包进行统计分析。

[89]使用卡方和/或Fisher精确法在组间对于二分变量，包括结果测量(症状存在)和性别进行检验。出于调整关于结果测量的影响因子(例如“混杂因子”)，例如年龄和体重的目的，使用逻辑回归分析来将症状存在的机会的对数作为年龄、研究组重量和性别的线性函数设计模型。具有症状的机会等于有症状的概率除以无症状的概率。

[90]例如，如果100名个体中有10名患有发烧，那么症状概率是0.10而症状的机会是1/9(0.10/0.90)。多变量分析的描述使用机会比率的概念。例如，评估对于分配给一组(例如组合菌株)的儿童相比于分配给另一组(例如，安慰剂)的儿童有特定症状的风险。如果机会比率是一致的(1.0)或接近1.0，那么所分析的两组对于该症状的风险可能相似。如果机会比率大于1，那么存在风险的潜在增加，而如果小于1，那么存在风险的潜在减小。使用对于95％置信限的机会比率的估算来表示结果。例如，如果组合菌株组相比于安慰剂组对于发烧的机会比率是0.33且相应的置信限不包括值“1”；例如(0.15，0.70)，由此得出结论组合菌株组的发烧风险是安慰剂组的发烧风险的约1/3。换言之，由于属于组合菌株组，发烧的风险降低了67％。

[91]在逻辑回归模型方面也调查了年龄与各研究组的相互作用。如分析所指出，年龄是可能的相互作用因子，即使当对菌株组(和安慰剂组)根据年龄的亚组检测症状的存在时，有时由于样本尺寸变小而使其发挥相互作用因子的能力不会达到统计学的显著性。因此，整体上(不考虑年龄作为相互作用因子)表示结果，尽管逻辑回归模型结果以年龄表示，认识到其作为相互作用因子的影响。此外，两两相互的组比较还接受多重比较规则和罚分。综上，使用多线性回归分析进行研究组间对于症状持续期差异的评估，以将持续期设计作为研究组、年龄、性别和重量的函数的模型。

F.结果

[92]表1提供了三个研究组间的年龄、体重和性别分布。很明显该组对于性别以及在一定程度上对于体重是平衡的。然而，分配给安慰剂组的儿童似乎比分配给单个菌株组或菌株组合组的儿童平均年长约4-5个月。认为这一发现使得对所有后续分析考虑(调整)年龄成为必需。

[93]尽管以性别和重量评估症状率，但没有发现任一项对患症状(发烧、咳嗽、流涕或任何症状)的概率有显著影响。然而，年龄似乎对症状的存在的概率以及症状持续有显著影响(与研究组无关)(对于所有月份，p值一致地＜0.05)。

[94]对于发生发烧、咳嗽和流涕，菌株组观察到统计上显著的保护效应。表2提供了示出通过随机分组，在六个月的研究期的症状持续期分布。其也评估了研究组之间经年龄调整后的差异。根据这一表格，显然，相比于组合菌株组(p＜0.001)和单菌株组(p＝0.0023)，安慰剂组经历了分别为平均3.2和2.2天的更长的症状持续期。出于表示这些数据的便利性，这一表格中，用数“93”表示安慰剂组(第3组)，用数“94”表示单菌株组(第1组)和用数“95”表示组合菌株组(第2组)。

[95]对于组间经年龄调整后的差异，使用线性回归将症状的累积持续设计作为研究组和年龄的函数模型。当考虑年龄效应时，这些差异反映了该模型的回归系数。

[96]该结果还表明在六个月的研究期间，单菌株(第1组)和组合菌株(第2组)组显示了参与者经历发烧、咳嗽或流涕的类似流感症状的时间百分数的显著降低。下面表格(表3)提供了比较组间观察的症状以及抗微生物剂给药的数据。这一表格中，提供机会比率，95％置信水平和P值。这一表格中，机会比率小于1表明保护效应。例如，在组94和组93的比较中，机会比率为0.52表明组94的儿童患该症状的风险约是组93的儿童的一半。这一表格中，粗体的值表示尤其显著的结果。

[97]对于给予抗微生物剂的84名参与者，多数(67.9％)属于安慰剂组(第3组)。相反，对于单菌株组，该百分数为21.4％而对于组合菌株组，该百分数为10.7％。

[98]除去在研究开始以及可能在三月份以外，抗微生物剂的使用和看内科医生在安慰剂组都更加普遍。这一倾向的一种可能解释是必须看内科医生是类似流感症状(或其它症状)更加流行的结果。此外，腹泻病例在研究的开始更流行，这与研究组没有明确关联。

[99]如表1所指出，贯穿整个研究的月份，安慰剂组相比于两个其它菌株组具有明显更高的年长儿童的百分数。因此一定程度上期望安慰剂组应显示更加抗类似流感症状。然而，在十一月至一月，年长儿童比年幼儿童显示对该症状更敏感。此外，在剩下的月份，二月至五月，该效应或者逆转或者显著变弱。

[100]这一趋势的一种可能的解释是在冬季的最冷月份(十一月至一月)，所有儿童(年幼或年长)都对类似流感症状高度敏感。然而，这些月份里，菌株效应对该症状有显著保护。令人感兴趣是注意到这一情况之后，研究组间的年龄失衡可能对该菌株的潜在益处存在负作用。

[101]总体上，该结果表明在十一月、十二月、一月、二月、三月、四月和五月期间，菌株组比安慰剂组在预防发烧、咳嗽和流涕的类似流感症状(任何症状)上具有显著的保护效应。在四月至五月期间观察的保护效应有下降。然而，在这些月份提供一定的保护。事实上，整体上，相比于分配到安慰剂组的儿童，单菌株或组合菌株组中罹患发烧、咳嗽或流涕的类似流感症状的儿童明显更少。此外，安慰剂组由于类似流感症状而开出抗微生物剂处方的儿童是单菌株组儿童的三倍。另外，安慰剂组由于类似流感症状而开出抗微生物剂处方的儿童是组合菌株组儿童的五倍。另外，相比于安慰剂组，单菌株和组合菌株组的参与者表现症状的天数明显更少。嗜酸乳杆菌NCFM和乳双歧杆菌Bi-07的组合在预防症状上比单独菌株(嗜酸乳杆菌NCFM)提供一些优势，尽管对于单个菌株而言也观察到益处。

[102]此外，发现本发明在单菌株和两菌株组都提供减少50％生病天数的益处。从表4显而易见，分配到安慰剂组的儿童比分配到单菌株或两菌株组的儿童平均有37％-44％更高的总缺勤日。

[103]事实上，该数据表明，相比于安慰剂组，单菌株和两菌株组都证明了缺勤天数的显著减少。

[104]表5表示使用ANOVA技术使用Dunnet方法调整的多重比较，检验组间在总缺勤日上的差异的统计学显著性结果。单菌株或两菌株组对安慰剂之间的差异是统计学上显著的(p值＝0.01)。此外，如已被构成性调整用于多重比较的同时95％置信区间所示，比较单菌株或两菌株组对安慰剂的差异是统计学上显著的。这一在总缺勤天数上的差异可以小到0.1或0.24天，但也可以大至2.7或3.0天。

[105]综上，总缺勤日的分析表明单个或两种菌株益生菌剂明显减少缺勤学前班或幼儿园的天数。

[106]本说明书中提及的所有专利和出版物表明本发明所属领域的熟练技术人员的水平。所有专利和出版物在此通过引用作为参考，就如同与其每个出版物特别地及单独地通过引用作为参考一样的程度。

[107]本发明描述了优选的实施方式，对于本领域熟练技术人员而言显然可对公开的实施方式进行多种修改，且该修改旨在落入本发明的范围内。

[108]本领域技术人员理解本发明非常适于实施该目的并获得提及的、以及其中固有的目标和优点。本文所述的组合物和方法表示优选的实施方式，其是示例性的，且不旨在局限本发明的范围。很显然本领域技术人员可对本文公开的发明进行改变替代和修改而不悖离本发明的范围和精神。

[109]本文说明性地描述的发明可适于在没有本文具体公开的任何因素或多个因素，限制或多个限制下实践。已经使用的术语和表述被用作说明书的术语且不被限制，并且该术语和表述的使用并不旨在排除所示及所述特征的任何等效物或其部分，但应理解，在主张的发明范围内的多种修改是可能的。因此，应理解尽管通过优选的实施方式和可选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可寻求本文公开概念的修改和改变，并且认为该修改和改变在所附权利要求所限定的本发明的范围内。

[110]本发明广义地且概括性地描述了本发明。落在一般性的公开内容中的每个较窄种类和亚属分类也形成本发明的一部分。这包括具有附带条件的或从该属中除去任何主题的负面限制的本发明一般性说明，而不管是否本文具体引用了被删除的材料。