血液凝固测试的标准品/参比品/对照品

摘要

通过合并不含血浆、白细胞和血小板的红细胞溶胞产物与不含血小板的人源血浆及抗微生物剂制备可在凝固测定中用作标准品、参比品、对照品、校验品、线性检验品或训练材料的基于全血的替代组合物。

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及人血液测试的材料和试剂领域。

2.现有技术描述

测定血液凝固速度的测试可用于诊断出血异常和监测正经历治疗或服药以防止血液凝块形成的患者的血液凝固行为。凝血酶通过涉及一系列血液凝固因子的连续反应作用于血纤蛋白原(正常血液的一种可溶性组分)形成血纤蛋白，进而导致血液凝固。凝血酶本身通过两种基础途径，外来途径和固有途径由凝血酶原形成，不同凝固检验检测这些途径的一种或两种的活力。通过本领域已知的测定方法，例如凝血酶原时间(PT)检测外来途径的活力，而内在途径的活力通过本领域已知的测定方法，例如活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试。PT和APTT通过它们各自的方法用作发生血液凝固所需时间长度的标志。

凝血酶原时间(PT)测试提供凝血酶原(也称为第II因子)以及四种其它凝固因子-第I、V、VII和X因子存在和活性的标志。当一种或多种这些因子的水平或活性异常地低，或者其活性被对象血液中的异常物质阻断时，PT值(以秒表示)较高。在一些病例中，其是疾病情形的标志，而在其它病例中，高数值是成功治疗的标志。例如，通过给予专门阻止或延迟血液凝块形成的药物，例如肝素和华法林治疗某些医学情形。例如，经历华法林治疗的对象的PT值可以是健康对象获得的结果的约1.5-2.5倍。未经历这种药物治疗的健康对象的PT值通常是约10-约13秒。

通常先进行活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试，再进行外科手术以证实该对象具有正常的血液凝固行为。与PT相似，APTT也用于监测血液稀释药物，例如肝素的给药，一般通过每两小时实施该测试并修正药物剂量直至获得最佳剂量。对于凝固行为正常的对象，APTT值为约25-约39秒。

临床实验室可从商业供应商处获得用于PT和APTT测定的各种分析物和试剂。一种这样的供应商是美国新泽西州帕西帕尼的DS公司(DiagnosticaStago，Inc.，Parsippany，New Jersey，USA)，其产品包括用于APTT测试的STA-PPT[A]试剂，用于PT测试的STA-Neoplastine CI+试剂。STA-PPT[A]试剂用于涉及有标准量的脑磷脂(用作血小板替代品)和特定激活物存在下血浆再钙化的测试。STA-Neoplastine CI+试剂与促凝血酶原激酶钙(calcium thromboplastin)联用。另一供应商是美国加利福尼亚州圣何塞的HS公司(HemoSense，Inc.，San Jose，California，USA)，其INRatio计量仪是检测PT和国际标准化比率(INR)的测试装置，所述比率是患者PT与某群体的正常平均PT之比。INRatio计量仪利用重组人促凝血酶原激酶试剂从一滴手指针刺新鲜毛细血管血获得这些数值并测定血纤蛋白原向血纤蛋白转变后样品阻抗的变化。另一种测试装置是美国新泽西州东温莎的i-STAT公司(i-STAT Corporation，East Windsor，New Jersey，USA)出售的i-STAT分析仪。该i-STAT分析仪是含有人工凝血酶底物的手提式装置，该底物含有类似于血纤蛋白原上位点的连接键，而凝血酶通常切割该连接键以形成血纤蛋白凝块。血液样品中的凝血酶切割底物并释放电流计检测的电活性化合物。还可利用i-STAT分析仪检测活化凝血时间(ACT)，该时间是凝血连锁完全活化所需的时间。可采用ACT测定，通过分析动脉和静脉血液样品来监测中等和高水平肝素治疗。当有活化凝血酶存在时血纤蛋白原转化成血纤蛋白导致大量或局部凝块形成时，表明完全活化。

用作血液样品替代品的组合物通常与这些各种测试联用作为标准品、参比品和对照品。这些组合物可用于监测仪器或装置的精密度和准确性，监测仪器或装置所用任何试剂的状况和将患者样品与其它样品或固定值比较。当将具体装置、仪器或方法介绍给新用户时，样品替代品也可用于培训目的。配制样品替代品(为方便起见，本文称为对照品)的目的之一是获得一种组合物，其对可能遇到的所有分析偏差与实际患者样品一样灵敏并能读取该测定的医学决定点(medical decision point)范围内的数值。最佳组合物也可以是制备或重建后能稳定数小时或数天的组合物。其它所需特征是成本低，易于制备和批次之间有再现性。

目前可用的一种对照品是Stago STA-Coag对照品(DS公司目录号00679)，其是一种两水平冻干对照品，含有分别代表正负水平的柠檬酸化正常和异常人血浆。以商品名LYPHOCHEK凝固对照品出售的三水平对照品可购自美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的生物辐射实验室公司(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，California，USA)(目录号744，745和746)，其用加工的人血浆和防腐剂制备。因为Stago STA-凝固对照品和LYPHOCHEK凝固对照品均不含红细胞材料，这些对照品均不是全血凝固对照品。这是不利的，因为任何全血凝固测试的最佳对照材料，特别是设计用于床边检验(point-of-care testing)的那些材料的构成应类似于检验的实际样品，而由于缺乏红细胞和红细胞组分，基于血浆的对照品缺乏衍生自全血的样品中存在的主要组分类别。分析对照系统公司(AnalyticalControl Systems，Inc.)的Speck，R.E.等在1999年8月17日授权的美国专利号5,939,325中公开了稳定全血凝固对照品的配方。Speck对照品包含非灵长类衍生的凝固因子与灵长类衍生的凝固因子的组合以弥补更不稳定的灵长类衍生因子的活性随时间丧失。

发明概述

现已发现通过溶解从全血分离并经洗涤除去了血小板、白细胞和残留血浆的红细胞并将溶胞产物与人源无血小板缓冲血浆及抗微生物剂混合可制备凝固试验的稳定全血对照品。如果将得到的组合物冻干并用盐水重建，重建的对照品在打开小瓶及封闭小瓶的保存条件下可保留其凝固活性几小时，在许多情形中可保留几天。可通过各种方式，包括利用消除了凝固因子的血浆或这种血浆与选择比例的含天然水平凝固因子的血浆的组合，或通过调节红细胞溶胞产物与血浆之比将给定对照品的凝固活性调节至所需水平。

发明详述与优选实施方式

用于制备本发明对照品的红细胞可以是各种来源，例如人、猪、牛、马、鸟、山羊或绵羊，但优选灵长类来源，最优选人来源。可通过常规方法，例如离心从全血收集红细胞，可用等渗缓冲洗涤溶液洗涤使收集的红细胞不含白细胞、血小板(包括血小板膜组分)和残留的血浆。一旦分离，可通过常规溶解技术溶解红细胞。虽然可通过冷冻红细胞然后融化实现溶胞，但该过程不是必需的，优选方法不是冻融。这些方法包括超声处理、渗透压休克和溶解细胞膜的化学处理。将红细胞悬浮在低渗溶液，例如去离子水中充足时间以使细胞膜破裂来实施渗透压休克。化学处理通常包括将红细胞与导致膜破裂的洗涤剂或表面活性剂接触。适合溶胞的洗涤剂和表面活性剂的例子是NP-40和其它乙氧基壬基酚(nonylphenol ethoxylates)(陶氏化学品公司(Dow ChemicalCompany)，米德兰，密歇根州，美国)，烷基芳基聚醚醇，例如TRITONX-100、BRIJ 58(聚氧乙烯十六烷基醚)、CHAPS(磺基甜菜碱型两性离子洗涤剂)和十二烷基硫酸钠。当利用洗涤剂或表面活性剂时，本领域技术人员不难知道合适浓度。例如，NP-40的合适浓度是约0.1重量％-约3.0重量％。一旦溶胞发生，可通过常规技术，例如过滤或离心除去溶胞产物的细胞碎片和任何其它固体物质。

在本发明的某些实施方式中，为进一步控制组合物和最终对照组合物的特性，将溶胞产物调节至选择的血红蛋白浓度。在一些情形中，调节包括降低血红蛋白浓度，在其它情形中，调节包括提高血红蛋白浓度。用缓冲盐水稀释可降低浓度，通过过滤或透析可提高浓度。在大多数情形中，目标血红蛋白浓度是约1g/dL-约25g/dL，优选约1g/dL-约15g/dL，最优选约10g/dL-约15g/dL。

用于实施本发明的血浆是人源的，当需要消除或缺乏凝固因子的血浆时，可通过常规技术从正常血浆制备这种血浆。一种这样的技术是用二乙基氨基乙基阴离子交换树脂进行离子交换。本领域技术人员知道其它合适的离子交换树脂。可根据血浆的PT值表示凝固因子的消除程度。因此，虽然正常血浆的PT值为约13-约18秒，凝固因子水平降低的血浆的PT值可以是约200秒或更高。

用于实施本发明的血浆不含血小板，最终的组合物缺乏血小板膜组分。本文用术语“不含血小板”和“缺乏”包括绝对缺乏这些物质的血浆和组合物以及含有非常少量血小板物质的那些血浆和组合物，其含量非常少以致于存在这些物质的作用不比它们完全不存在时高。通过适当过滤，采用本领域技术人员已知的过滤方式不难获得不含血小板的血浆。此外，可先将红细胞洗涤足够次数以除去血小板物质再溶胞，当通过离心分离红细胞与全血时，可先从压实的红细胞中除去血沉棕黄层再重悬和溶胞以进一步确保除去血小板物质。以红细胞为例，不含白细胞、血小板和残留血浆的红细胞的限定作相同解释。

通过向血浆中加入缓冲液，优选将本发明对照品的pH维持在约6.5-约7.5的范围内。可利用能调节至该范围的常规缓冲剂。例子是：HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、二甲砷酸盐、柠檬酸盐、MES(2-吗啉代乙磺酸)、柠檬酸盐、马来酸盐、组氨酸、二-三(2-二(2-羟乙基)氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇)、磷酸盐、乙醇胺、ADA(N-(氨甲酰基甲基)亚氨基双乙酸)、碳酸盐、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N，N’-二(乙磺酸))、MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙磺酸)、咪唑、BES(N，N-二(2-羟乙基)牛磺酸)、MOPS(3-吗啉代丙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、DIPSO(3-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、三乙醇胺、焦磷酸盐、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸))和POPSO(哌嗪-N，N′-二(2-羟基丙磺酸))。

可利用各种常规抗微生物剂作为本发明组合物的抗微生物组分。例子是环丙沙星、两性霉素B、阿米卡星、氯霉素、叠氮钠和苯甲酸钠。抗微生物剂的最佳含量可以是具有抗微生物作用并且不干扰组合物中诸组分活性的任何量。在大多数情形中，约3mg/L(每升总组合物中抗微生物剂的毫克数)-约100mg/L，优选约10mg/L-约50mg/L的含量可获得最佳结果。合适含量通常随抗微生物剂而变，对于任何具体的抗微生物剂，熟知这些试剂及其用途的技术人员不难知道合适含量。

通过改变溶胞产物与血浆之比，改变血浆的组成(特别是根据各种凝固因子的水平)，或该两种方法可获得在各种凝固测试中产生具体数值的组合物。以产生所需浓度的比例混合含有天然水平的凝固因子的血浆与缺乏或除去了凝固因子的血浆，血浆中凝固因子的水平可调节至任何所需水平。在许多情形中，在具体的凝固测试中制备一组两种或更多种组合物以涵盖凝固速度范围是有用的。当制备一组两种组合物时，一种宜在给定测试的正常范围内，而另一种在代表异常缓慢凝固速度的升高范围内。例如，对于制备成用于凝血酶原时间凝固测试的对照品的组合物，一种组合物宜显示凝固时间在约9秒到约18秒的范围内，而另一种宜显示凝固时间大于24秒。例如，对于制备成用于活化部分促凝血酶原激酶时间凝固测试的对照品的组合物，一种组合物宜显示凝固时间在约20秒到约40秒的范围内，而另一种宜显示凝固时间大于60秒。通常，用作凝血酶原时间凝固测试的对照品的组合物宜显示凝血酶原时间测试值为约9秒到约100秒，而用作活化部分促凝血酶原激酶时间凝固测试的对照品的组合物宜显示凝血酶原时间测试值为约25秒到约120秒。

出于保存好运输的目的，通常将本发明组合物冻干，一旦要使用，通过溶解于合适的重建液体中重建。在冻干状态下，组合物优选是密封的并维持在冷冻环境中。优选通过溶解于去离子水或蒸馏水中重建。在某些情形中，特别是对于床边分析，例如i-STAT分析仪，当重建液体是氯化钙水溶液时可获得最佳结果。在这种溶液中，优选的CaCl₂浓度是约8mM-约16mM。

提供以下实施例只是出于说明目的。

实施例1

A.制备溶血产物

2-8℃以3000RPM离心人全血15分钟获得压实的人红细胞(RBC)。离心后，吸出残留的血浆以及之前加入全血中的抗凝剂，除去压实细胞上的血沉棕黄层。然后将细胞重悬在等体积等渗盐溶液中，再于2-8℃以3000RPM离心15分钟。离心后，抽出悬浮液体，将细胞重悬在等渗盐溶液中至RBC计数为4-5×10⁶RBC/μL。

利用美国康涅狄格州丹伯里布兰森超声公司(Branson UltrasonicsCorporation，Danbury，Connecticut，USA)的布兰森超声仪150超声细胞破碎机或匀浆器以20瓦超声处理1分钟得到的RBC悬液(100mL)。超声处理后，2-8℃以10,000RPM离心30分钟以除去细胞碎片。然后利用分子量截断值为10,000道尔顿的透析过滤设备将溶血产物浓缩至血红蛋白浓度为15g/dL。

B.制备缺乏凝固因子的血浆

在设置于30-35℃的水浴中融化不含血小板的正常人血浆单位。融化后，合并诸单位，将11.9g/L HEPES和30mg/L环丙沙星加入合并的血浆中。搅拌得到的组合30分钟，将pH调节至6.8。然后将111mL二乙基氨基乙基阴离子交换树脂(DEAE琼脂糖凝胶，阿姆山姆法玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州，美国)加入1000mL该混合物使双方接触，从而消除了凝固因子混合物。然后在2-8℃继续搅拌，利用DS压实凝固分析仪(Diagnostica Stago Compact coagulationanalyzer)每15分钟测试样品的PT直至测得PT值为200秒以上。然后将血浆与阴离子交换树脂的悬液经0.8-μm非玻璃滤器过滤以除去树脂。

C.制备正常血浆

在设置于30-35℃的水浴中融化不含血小板的正常人血浆单位。融化后，合并诸单位，将11.9g/L HEPES和30mg/L环丙沙星加入合并血浆。将添加物混合30分钟后，将合并血浆的pH调节至6.8。然后得到的混合物经0.8-μm非玻璃滤器过滤。

D.制备产物

混合不同比例的过滤溶血产物、缺乏因子的血浆和正常血浆以制备各种组合物，依据PT和APTT这些组合物具有不同凝固时间。混合各组合物，然后采用42小时的冻干周期(在34小时内从-40℃逐渐升温至30℃)冻干。然后给各小瓶加盖，作标记并于2-8℃保存。

然后在去离子水中重建冻干的组合物，对于从冻干前1.00mL组合物得到的固体体积用1mL水。第一组4种组合物和它们在Stago STA压实分析仪上的PT及APTT测量值见下表I。

表I

Stago STA压实分析仪上测得的凝固速度值，以PT和APTT表示

然后在i-STAT分析仪上测试组合物1和2的PT、ACT(活化凝血时间)和INR(PT与平均正常PT之比)，结果见下表II。

表II

i-STAT分析仪上测得的凝固速度值，以PT、ACT和INR表示

 

组合物编号  溶血产物(mL)    消除了因子的血浆(mL)正常血浆(mL)    PT(秒)ACT(秒)INR1100010017.35931.5267010016.94921.4

表I和II所示结果表明可用不同测试方案的各种方式设定对照品的反应水平。

E.稳定性测试结果

采用加速稳定性模型进行非重建组合物的封闭小瓶稳定性测试来预测产物储存期。与2-8℃的推荐保存温度相反，该过程包括在升温(25℃)下保存产物小瓶预定时期。然后重建小瓶中的样品并测定PT和APTT以检查分解或降解。当外推至保存温度2-8℃时，结果表明产物在该温度范围内保存在封闭小瓶中可稳定至少1年。

通过模拟实际使用条件测定开瓶稳定性。通过以下步骤测定：将含有重建形式的组合物1和2的小瓶置于2-8℃冰箱中，每8小时从冰箱中取出小瓶，将小瓶在室温平衡15分钟，打开小瓶并将它们的内含物接触实验室环境15分钟，然后取样小瓶内含物，重新盖上小瓶并将小瓶放回冰箱。在Stago STA压实分析仪上测定小瓶样品的PT和APTT，结果分别见表III和IV。结果表明产物在2-8℃重建、打开和保存时能稳定至少8小时。

表III

Stago STA压实分析仪上测得的开瓶稳定性测试结果，以2-8℃的PT表示

表IV

Stago STA压实分析仪上测得的开瓶稳定性测试结果，以2-8℃的APTT表示

表III和IV证明重建形式的两种组合物在正常使用条件下能稳定24小时以上。

提供以上描述主要是为了说明目的。虽然本文未述及，但本领域技术人员应明白利用本发明基本概念的其它改变和改进属于随附权利要求书表达的本发明范围内。