用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用

摘要

本发明涉及生物降解烟叶烟碱的技术，尤其涉及一种用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用。假单胞菌ZCJ菌株，该假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)已经于2009年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO.M209064。本发明还公开了上述的菌株的筛选和应用。本发明从烟叶原料中筛选出的烟碱降解菌株，该菌株具有较高生物活性，适用于固态的烟叶烟碱的降解，达到降低烟叶烟碱的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及生物降解烟叶烟碱的技术，尤其涉及一种用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

受天气、气候以及栽培等因素的影响，烟叶的烟碱(尼古丁)含量存在一定的波动性，易导致卷烟内在质量的不稳定性。同时，相对于降低焦油和烟气有害成分而言，烟草中烟碱(尼古丁)的降低尚未取得突破性的进展。

相对于农业田间管理降低烟碱方法而言，微生物易于培养，降解烟碱的见效快，而且有选择性和可控制性，对香烟品质还会产生其他有益的作用；但是迄今已发现的微生物降解菌的烟碱降解能力不是很强，耐受烟碱浓度较低，影响了其在生产中应用。因而筛选较高活性尼古丁降解菌种，选择合适的生物反应工艺，来实现烟碱的有效降解，控制其含量，是烟草行业的一个热门研究课题和研究方向。

中国发明和专利申请(申请号为：200710013068.3)公开了一种可以代谢尼古丁的恶臭假单胞菌，该菌株已于2005年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为：CCTCC NO.M 205038。中国发明和专利申请(申请号为：200710013069.8)公开了一种可以代谢尼古丁的根癌土壤杆菌，该菌株已于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为：CCTCC NO.M 206131。上述的两款菌株具有较强的尼古丁代谢能力和尼古丁毒性抗性能力，可以利用菌株的完整细胞为生物催化剂，可将烟草加工废水中的尼古丁彻底生物降解。

中国发明和专利申请(申请号为：200710070805.3)公开了一株新的尼古丁降解菌-假单胞菌ZUTSKD及其应用。假单胞菌ZUTSKD(Pseudomonassp.ZUTSKD)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年6月18日，保藏编号CCTCC NO：M 207083。该菌可将尼古丁降解，能耐受的最高尼古丁浓度为5.5g/L，能够降解废弃烟末中的尼古丁，在工业上有一定的应用前景。

上述的三个专利涉及的菌株对尼古丁具有有效的降解性能，适用于废弃尼古丁的处理，唯一的缺点是都是涉及液体状态下的尼古丁降解，对于固态的烟叶是否具有作用还未经实验证实。

发明内容

为了解决上述的问题，本发明的一个目的是提供一种假单胞菌ZCJ菌株，该菌株具有较高生物活性，适用于固态的烟叶烟碱的降解。本发明的第二个目的是提供上述的假单胞菌ZCJ菌株的筛选方法。本发明的第三个目的是提供上述的假单胞菌ZCJ菌株的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

假单胞菌ZCJ菌株，该假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)已经于2009年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCNO.M209064。

上述的菌株形态鉴定：该菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢。电镜观察发现，该菌鞭毛端生，鞭毛数1-3根。在BSM琼脂培养基上菌落为白色，光滑，边缘成齿状。生理生化鉴定：该菌株好氧，能以尼古丁为唯一碳、氮源生长。吲哚实验、甲基红实验、V.P.实验、淀粉水解实验均成阴性，氧化乳糖不产酸不产气。该菌株16S rDNA序列全长1417bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为了实现上述的第二个目的，本发明的假单胞菌ZCJ菌株的筛选方法，该方法包括以下的步骤：

1、在100mL生理盐水中，加入10g烟叶(由杭州利群卷烟厂提供)，24～37℃，150～200rpm振荡20～40min；

2、取1mL振荡液加入至100mL富集培养基中，24～37℃，150～200rpm振荡40～50h；

3、取适量富集培养液，涂布在BSM琼脂培养基上，25～37℃下培养35～50h；

4、挑取单菌落，划线在新鲜的BSM琼脂培养基上，获得纯化的菌。

作为优选，上述的富集培养基的配方如下：Na₂HPO₄ 5.57g·L^-1，KH₂PO₄ 2.44g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 1g·L^-1，MgCl₂·6H₂O 0.2g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.0004g·L^-1，FeCl₃·6H₂O 0.001g·L^-1，CaCl₂ 0.001g·L^-1，尼古丁10g·L^-1，pH＝7.0。

作为优选，上述的步骤③的BSM琼脂培养基尼古丁含量为2g/L。

为了实现上述的第三个目的，本发明的假单胞菌ZCJ菌株用于烟叶烟碱的降解。特别是用于自然陈化1～2年的烟叶。具体的方法是：将所述的假单胞菌ZCJ菌株制成悬液，喷洒于烟叶。

本发明由于采用了上述的技术方案，从烟叶原料中筛选出的烟碱降解菌株，该菌株具有较高生物活性，适用于固态的烟叶烟碱的降解，特别是应用于经过自然陈化1-2年后的库存烟叶(特别是烟碱含量仍偏高的片烟)，以达到降低烟叶烟碱的目的。本发明不仅在提高库存烟叶的可用性、维护品牌形象等方面，具有重要意义，而且也为将来进一步开展烟叶陈化方面的研究，缩短烟叶陈化周期和减少企业原料烟叶库存占用资金，以及在生产工艺环节上的工业应用，提高卷烟产品的品质，打下应用基础。

附图说明

图1为本发明菌株ZCJ的电镜照片(10000×)。

图2为本发明菌株ZCJ的系统进化树。

图3为本发明菌株ZCJ在液体培养基中的生长效果图。

图4为本发明菌株ZCJ在液体培养基中对尼古丁的降解效果图。

图5本发明菌株ZCJ固态发酵降解烟叶烟碱(尼古丁)效果降解效果图。

具体实施方式

实施例1假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)的分离、纯化及鉴定

一、烟叶烟碱(尼古丁)降解菌的分离纯化

在100mL生理盐水中，加入10g陈化烟叶(由浙江中烟工业有限责任公司提供)，30℃，180rpm振荡30min。取1mL振荡液加入至100mL富集培养基(富集培养基：Na₂HPO₄ 5.57g·L^-1，KH₂PO₄ 2.44g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 1g·L^-1，MgCl₂·6H₂O0.2g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.0004g·L^-1，FeCl₃·6H₂O 0.001g·L^-1，CaCl₂ 0.001g·L^-1，尼古丁10g·L^-1，pH＝7.0)中，30℃，180rpm振荡48h。取适量富集培养液，涂布在BSM琼脂培养基上(尼古丁含量2g/L)，28℃下培养48h。挑取单菌落，划线在新鲜的BSM琼脂培养基上，获得一株纯化的菌。

二、菌株ZCJ形态结构观察及生理生化实验

1、形态鉴定：

该菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢。电镜观察发现，该菌鞭毛端生，鞭毛数1-3根(图1)。在BSM琼脂培养基上菌落为白色，光滑，边缘成齿状。

2、生理生化鉴定：

该菌株好氧，能以尼古丁为唯一碳、氮源生长。吲哚实验、甲基红实验、V.P.实验、淀粉水解实验均成阴性，氧化乳糖不产酸不产气。

三、假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)的16s r DNA的PCR扩增和序列测定

用试剂盒提取纯化后菌株的总DNA。采用细菌16s rDNA的通用引物(上海英骏生物技术有限公司合成，其正向引物序列：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，反向引物序列为：5’-cggctaccttgttacgacttc-3’)进行16s rDNA的PCR扩增。PCR反应程序如下：①94℃ 5min；②94℃ 1min；③52℃ 1min；④72℃ 1min；⑤循环第2步到第4步34次；⑥72℃ 10min；⑦-20℃保存。

PCR产物的纯化和测序由上海英骏公司完成。该菌16S rDNA序列全长1417bp，序列见SEQ ID NO.1。

菌株ZCJ的Gene bank登录号为FJ815158，利用Clustalx和Treeview软件，绘制进化树(如图2)。根据其形态\生理生化和16s r DNA序列比对结果，参照伯杰氏细菌鉴定手册，可以判定菌株ZCJ属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.ZCJ。

实施例2假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)的尼古丁降解特性

一、假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)在液体培养基中的生长和对尼古丁的降解效果

将1mL菌悬液(细胞干重约为0.3125mg)接种到100mL含尼古丁2g/L的BSM培养基中，180rpm，不同温度(25、28、37℃)下培养。4d后测量菌体干重及尼古丁降解情况。

取30mL菌悬液，4000rpm离心15min，去上清，烘箱中低温烘干至恒重。发现，随着培养温度的升高，菌体生长量增大(如图3所示)。利用HPLC检测尼古丁含量，发现当培养温度为37℃时，尼古丁降解最多(如图4所示)。

二、假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)固态发酵降解烟叶烟碱(尼古丁)效果

将烟叶处理成大拇指指甲盖大小，称取10g置于三角瓶中。添加5mL用0.05M，pH为7的磷酸缓冲液悬浮的降解菌ZCJ悬液，对照组加入不含降解菌的等量磷酸缓冲液。28℃静置培养7d后，往三角瓶中添加200mL蒸馏水，摇床振荡30min，过滤提取浸出液。经HPLC检测尼古丁含量，发现尼古丁含量与对照组相比，均有一定幅度的降低(如图5所示)，表明添加一定浓度的ZCJ菌悬液能降解烟叶中的尼古丁。

序列表

<110>浙江中烟工业有限责任公司、浙江工业大学

<120>用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用

<160>1

<210>1

<211>1417

<212>DNA

<213>假单胞菌ZCJ菌株

<400>1

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