一种复合微生物抗菌素及其制备方法

摘要

本发明提供一种复合微生物抗菌素及其制备方法。将鼠李糖乳杆菌(A)，嗜酸乳杆菌(B)分别在MRS培养基中37℃培养48小时，发酵液高速离心后取上清液加入固体硫酸铵，将产生的沉淀用蒸馏水溶解，经凝胶层析纯化后进行冷冻干燥，获得乳酸菌细菌素；将黑曲霉菌体按1∶6的比例加水，经胶体磨粉碎匀浆后，加热至55℃，添加1.5％纤维素酶、1.5％果胶酶、2％β－葡聚糖酶、2％酸性蛋白酶，混匀后 55℃保温水解6小时，100℃/10分钟灭酶，冷却后取离心上清液进行冷冻干燥获得菌丝体内溶物酶解冻干粉末(C)。按重量比为A细菌素∶B细菌素∶C＝(15－20)∶(18－25)∶(20－35)的比例充分混匀，制成成品。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种广谱复合微生物抗菌素及其制备方法，属食品微生物技术领域。

(二)背景技术

所谓微生物抗菌素是微生物代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对同种的或亲缘关系较近的种有抑制作用的杀菌蛋白或多肽物质。这些物质可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的其他微生物，所有产生抗菌素的微生物都存在着特异性免疫基因，产生的抗菌素不会对产生菌本身造成伤害。随着研究的进展，已发现了一些对食品腐败微生物和病原微生物具有广谱抑菌活性的抗菌素。

乳酸菌抗菌素在我国的研究始于八十年代末，但是主要是针对于Nisin的研究，新菌株和高产菌株的筛选以及分子生物学的研究，而对其它乳酸菌产生的细菌素无论在理论上还是在应用上的研究都不够成熟。1988年，中科院微生物所开始对Nisin进行理论和应用的基础研究，分离和筛选出能够产生nisin Z的乳酸链球菌菌株；我国在1990年将其列为食品添加剂增补品种。到了20世纪90年代，国内学者才开始研究其他乳酸菌细菌素。除nisin外，我国乳酸菌细菌素的研究主要集中在菌株筛选、分离纯化和一般生物学特性研究，通过优化发酵条件和诱变细菌素产生菌提高细菌素的产量。对细菌素的分子生物学研究较少。乳酸菌在自然界中分布广泛，而且是人类和动物肠道中正常菌群中的优势菌，乳酸菌不仅具有许多对人类和动物健康有益的生理功能，而且能够产生很多具有抑菌作用的物质，如有机酸(如乳酸)、过氧化氢和细菌素等抑菌物质，这些抑菌物质不仅能有效的保持食品的风味和组织状态，还可以抑制食品中存在的腐败菌和病原菌的生长，从而防止食品的腐败，延长食品的保藏期。乳酸菌产生的细菌素是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂，它对动物无毒性，很容易被人体自身消化道中的蛋白酶降解，所以不会在体内蓄积引起不良反应。

乳酸菌细菌素作为食品类抗菌素并非广谱抗菌，对革兰氏阳性菌抑菌效果比较明显，但对革兰氏阴性菌、霉菌、酵母等真菌抑杀效果不明显。本发明专利选用俩株乳酸菌复合发酵产生细菌素，与真菌细胞多糖等内容物按比例复配，制备一种具有广谱抗菌作用的微生物复合抗菌素，主要应用于各类食品保鲜，该抗菌素不受温度、pH值的限制，对霉菌、酵母以及各类食品腐败菌抑制效果明显。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种复合微生物抗菌素及其制备方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明中所涉及的比例除另有注明之外为质量比，本发明的产品采用这样的方法来制备的：

1.制备过程

1.1乳酸菌混合发酵制备细菌素

1.1.1菌种来源

发酵菌株购买于中国工业微生物菌种保藏中心，名称和编号为：鼠李糖乳杆菌CICC6141(A)，嗜酸乳杆菌CICC 6075(B)。

1.1.2发酵过程

1.2.2.1MRS培养基的制备

蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，K₂HPO₄0.2％，柠檬酸二胺0.2％，乙酸钠0.5％，葡萄糖2％，吐温80 0.1％，MgSO₄·7H₂O0.058％，MnSO₄·4H₂O 0.025％，其余为去离子水，pH6.2-6.4，121℃灭菌20分钟。

1.2.2.2发酵菌株的活化

分别量取0.9％的生理盐水10ml于5只试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至30℃，分别将鼠李糖乳杆菌CICC 6141和嗜酸乳杆菌CICC 6075俩株乳酸菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。

1.2.2.3乳酸菌复合发酵

将活化后的乳酸菌按10％的接种量分别接种于1.2.2.1培养基中，37℃厌氧培养48h，结束发酵。

1.1.3细菌素的提取过程

1.1.3.1细菌素粗提液的制备

将培养好的菌株发酵液于10000转/分钟，高速离心15min，取上清液，置于4℃保存备用。

1.1.3.2硫酸铵分级沉淀细菌素

制备好的离心上清液用0.45μm滤菌膜处理后装在锥形瓶中，每瓶装有100mL，然后分别加入固体硫酸铵使其饱和度为70％，振荡过夜。8000转/分钟、4℃离心30min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解。

1.1.3.3凝胶层析纯化细菌素

将预溶胀的Sephacryl S-100凝胶柱采用乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH5.1)，平衡SephacrylS-100凝胶柱。采用上样量为1mL的细菌素(硫酸铵沉淀后样品)，用乙酸钠缓冲液洗脱蛋白质，洗脱速度为0.3mL/min，并用分部收集器收集洗脱液，每10min收集1管，每管3mL，收集15号试管的组分，该组分为纯化后的细菌素。

1.1.3.4冻干浓缩

纯化后的细菌素，进行冻干浓缩，在真空、低温的条件下排除纯化后的细菌素中95-99％以上的水分，最终得到粉末状的细菌素。

1.2黑曲霉菌丝体内溶物的制备

1.2.1黑曲霉菌体来源

黑曲霉菌丝体来源于柠檬酸发酵厂家的废弃产物——黑曲霉菌体。

1.2.2制备方法

将黑曲霉菌体按1∶6的比例加水，经DSH150型号高剪切胶体磨，粉碎匀浆后，使黑曲霉菌丝体破碎，破碎组织小于5μm，将黑曲霉菌体匀浆液加热至55℃，添加1.5％纤维素酶(2万单位/克)、1.5％果胶酶(2万单位/克)、2％β-葡聚糖酶(3万单位/克)、2％酸性蛋白酶(5万单位/克)，充分混匀后55℃保温水解6小时，然后升温至100℃，保持10分钟灭酶，冷却后经管式离心机在10000转/分钟的转速下高速离心，取离心上清液，真空浓缩至固形物为50-55％，然后参照1.1.3.4步骤进行冷冻干燥，获得黑曲霉菌丝体内溶物酶解冻干粉末(C)。

1.3复合微生物抗菌素的制备

按重量比为A细菌素∶B细菌素∶C＝(15-20)∶(18-25)∶(20-35)的比例充分混匀，制成复合微生物抗菌素成品。

2.应用效果

下面通过具体实验来证明本发明专利的应用效果

2.1试验材料与方法

2.1.1指示菌种

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，用0.9％生理盐水活化2-4小时，等体积混合备用。

2.1.2实验方法

2.0％的素琼脂，冷至50℃左右，按每平皿10mL倾倒在无菌平皿中，洁净工作台中晾干用无菌镊子取预先灭菌的牛津杯放在倒有琼脂的平皿中，无菌刮棒涂布指示菌培养过夜，制备含0.7％琼脂指示菌培养基，冷至50℃左右，每100mL软琼脂培养基接种1mL指示菌在事先放好牛津杯的平板上，倾倒10mL含有指示菌的软琼脂培养基，晾干，在牛津杯的孔中加入100μL浓度为10^-6g/ml微生物复合抗菌素，在洁净工作台中鼓风扩散3小时，置于35℃培养48小时后用游标卡尺测定抑菌圈直径。

2.2结果与分析

琼脂平板中的牛津杯周围透明，没有指示菌的生长，而平板其它部位长满了指示菌，说明本发明专利能够有效抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的生长。

(四)附图说明

图1为微生物复合抗菌素对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述：

实施例一：

1.制备过程

1.1乳酸菌混合发酵制备细菌素

1.1.1菌种来源

发酵菌株购买于中国工业微生物菌种保藏中心，名称和编号为：鼠李糖乳杆菌CICC6141(A)，嗜酸乳杆菌CICC 6075(B)。

1.1.2发酵过程

1.2.2.1MRS培养基的制备

蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，K₂HPO₄0.2％，柠檬酸二胺0.2％，乙酸钠0.5％，葡萄糖2％，吐温800.1％，MgSO₄·7H₂O0.058％，MnSO₄·4H₂O 0.025％，其余为去离子水，pH6.2-6.4，121℃灭菌20分钟。

1.2.2.2发酵菌株的活化

分别量取0.9％的生理盐水10ml于5只试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至30℃，分别将鼠李糖乳杆菌CICC 6141和嗜酸乳杆菌CICC 6075俩株乳酸菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。

1.2.2.3乳酸菌复合发酵

将活化后的乳酸菌按10％的接种量分别接种于1.2.2.1培养基中，37℃厌氧培养48h，结束发酵。

1.1.3细菌素的提取过程

1.1.3.1细菌素粗提液的制备

将培养好的菌株发酵液于10000转/分钟，高速离心15min，取上清液，置于4℃保存备用。

1.1.3.2硫酸铵分级沉淀细菌素

制备好的离心上清液用0.45μm滤菌膜处理后装在锥形瓶中，每瓶装有100mL，然后分别加入固体硫酸铵使其饱和度为70％，振荡过夜。8000转/分钟、4℃离心30min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解。

1.1.3.3凝胶层析纯化细菌素

将预溶胀的Sephacryl S-100凝胶柱采用乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH5.1)，平衡SephacrylS-100凝胶柱。采用上样量为1mL的细菌素(硫酸铵沉淀后样品)，用乙酸钠缓冲液洗脱蛋白质，洗脱速度为0.3mL/min，并用分部收集器收集洗脱液，每10min收集1管，每管3mL，收集15号试管的组分，该组分为纯化后的细菌素。

1.1.3.4冻干浓缩

纯化后的细菌素，进行冻干浓缩，在真空、低温的条件下排除纯化后的细菌素中95-99％以上的水分，最终得到粉末状的细菌素。

1.2黑曲霉菌丝体内溶物的制备

1.2.1黑曲霉菌体来源

黑曲霉菌丝体来源于柠檬酸发酵厂家的废弃产物——黑曲霉菌体。

1.2.2制备方法

将黑曲霉菌体按1∶6的比例加水，经DSH150型号高剪切胶体磨，粉碎匀浆后，使黑曲霉菌丝体破碎，破碎组织小于5μm，将黑曲霉菌体匀浆液加热至55℃，添加1.5％纤维素酶(2万单位/克)、1.5％果胶酶(2万单位/克)、2％β-葡聚糖酶(3万单位/克)、2％酸性蛋白酶(5万单位/克)，充分混匀后55℃保温水解6小时，然后升温至100℃，保持10分钟灭酶，冷却后经管式离心机在10000转/分钟的转速下高速离心，取离心上清液，真空浓缩至固形物为50-55％，然后参照1.1.3.4步骤进行冷冻干燥，获得黑曲霉菌丝体内溶物酶解冻干粉末(C)。

1.3复合微生物抗菌素的制备

按重量比为A细菌素∶B细菌素∶C＝15∶18∶20的比例充分混匀，制成复合微生物抗菌素成品。

实施例二：

1.制备过程

1.1乳酸菌混合发酵制备细菌素

1.1.1菌种来源

发酵菌株购买于中国工业微生物菌种保藏中心，名称和编号为：鼠李糖乳杆菌CICC6141(A)，嗜酸乳杆菌CICC 6075(B)。

1.1.2发酵过程

1.2.2.1MRS培养基的制备

蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，K₂HPO₄0.2％，柠檬酸二胺0.2％，乙酸钠0.5％，葡萄糖2％，吐温800.1％，MgSO₄·7H₂O0.058％，MnSO₄·4H₂O 0.025％，其余为去离子水，pH6.2-6.4，121℃灭菌20分钟。

1.2.2.2发酵菌株的活化

分别量取0.9％的生理盐水10ml于5只试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至30℃，分别将鼠李糖乳杆菌CICC 6141和嗜酸乳杆菌CICC 6075俩株乳酸菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。

1.2.2.3乳酸菌复合发酵

将活化后的乳酸菌按10％的接种量分别接种于1.2.2.1培养基中，37℃厌氧培养48h，结束发酵。

1.1.3细菌素的提取过程

1.1.3.1细菌素粗提液的制备

将培养好的菌株发酵液于10000转/分钟，高速离心15min，取上清液，置于4℃保存备用。

1.1.3.2硫酸铵分级沉淀细菌素

制备好的离心上清液用0.45μm滤菌膜处理后装在锥形瓶中，每瓶装有100mL，然后分别加入固体硫酸铵使其饱和度为70％，振荡过夜。8000转/分钟、4℃离心30min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解。

1.1.3.3凝胶层析纯化细菌素

将预溶胀的Sephacryl S-100凝胶柱采用乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH5.1)，平衡SephacrylS-100凝胶柱。采用上样量为1mL的细菌素(硫酸铵沉淀后样品)，用乙酸钠缓冲液洗脱蛋白质，洗脱速度为0.3mL/min，并用分部收集器收集洗脱液，每10min收集1管，每管3mL，收集15号试管的组分，该组分为纯化后的细菌素。

1.1.3.4冻干浓缩

纯化后的细菌素，进行冻干浓缩，在真空、低温的条件下排除纯化后的细菌素中95-99％以上的水分，最终得到粉末状的细菌素。

1.2黑曲霉菌丝体内溶物的制备

1.2.1黑曲霉菌体来源

黑曲霉菌丝体来源于柠檬酸发酵厂家的废弃产物——黑曲霉菌体。

1.2.2制备方法

将黑曲霉菌体按1∶6的比例加水，经DSH150型号高剪切胶体磨，粉碎匀浆后，使黑曲霉菌丝体破碎，破碎组织小于5μm，将黑曲霉菌体匀浆液加热至55℃，添加1.5％纤维素酶(2万单位/克)、1.5％果胶酶(2万单位/克)、2％β-葡聚糖酶(3万单位/克)、2％酸性蛋白酶(5万单位/克)，充分混匀后55℃保温水解6小时，然后升温至100℃，保持10分钟灭酶，冷却后经管式离心机在10000转/分钟的转速下高速离心，取离心上清液，真空浓缩至固形物为50-55％，然后参照1.1.3.4步骤进行冷冻干燥，获得黑曲霉菌丝体内溶物酶解冻干粉末(C)。

1.3复合微生物抗菌素的制备

按重量比为A细菌素∶B细菌素∶C＝20∶25∶35的比例充分混匀，制成复合微生物抗菌素成品。