一种具备多个功能层的纳米人工硬脑膜及其制备方法

摘要

本发明提供了一种具备多个功能层的纳米人工硬脑膜，包含至少两层结构，面向大脑的一层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的一层为亲水性的纳米细胞支架层。本发明还提供了所述纳米人工硬脑膜的制备方法，包括以下步骤：制备疏水性聚合物的电纺溶液；制备亲水性聚合物的电纺溶液；用制得的疏水性聚合物的电纺溶液通过静电纺制成疏水性的防粘连电纺层；用制得的亲水性聚合物的电纺溶液在所述防粘连电纺层上通过静电纺制备疏水性的细胞支架层，接收为膜状结构得到纳米仿生人工硬脑膜。本发明人工硬脑膜机械特性能满足适应症对抗拉伸强度及柔韧性的要求，而且可根据需要任意裁剪，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具备多个功能层的纳米人工硬脑膜及其制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

硬脑膜缺损在神经外科临床工作中常见，开放性颅脑损伤(工业、交通、战争等)、肿瘤的侵蚀、先天性脑膜缺损及其它颅脑疾患原因均可引发硬脑膜缺损。硬脑膜缺损需及时修补以防脑脊液外溢，防止脑的膨出和大气压的压迫，否则将危及人体生命。硬脑膜缺损还能引发颅内感染、脑粘连、皮下积液等并发症，经常会引起如癫痛、头痛、脑功能障碍等疾病。

目前硬脑膜的代用品虽有很多，修复硬脑膜的材料可分为：自体筋膜、同种异体材料、天然及人工合成材料、异种材料4类。目前市场上产品各有其优缺点。已有技术的缺点如下：

①目前自身筋膜重建硬脑膜仍然是临床应用的标准，但术后早期脑脊液漏及皮下积液的发生率仍然较高，易导致粘连等并发症，可能引起供区不愈或功能障碍。

②同种异体和异种材料无法完全避免免疫排斥，残留的抗原会导致不同程度的炎症反应，造成纤维变性和脑粘连。易对脑组织产生瘫痕，刺激。同种异体材料来源受限，难以形成商业化生产。同时由于异体或异种来源，无法安全避免带来病毒传播的危险。例如来源于牛的材料的人工脑膜，因欧洲疯牛病发生后，其来源大打折扣，而安全性也大受怀疑。

③合成的天然材料基本为天然胶原蛋白。但蛋白来源使其无法完全避免免疫排斥。行修补时所用胶原蛋白容易被吸收，无法起着充分隔离头皮软组织与脑组织作用而不利于之后的颅骨修补手术等问题，不利于术后处理。

④不可吸收材料/部分吸收材料的不可吸收部分对受体永远是异物，可能导致慢性炎症反应、术区感染、延期出血，在颅脑敏感区，会产生对中枢的压迫并引起其它并发症。

⑤不可吸收/部分吸收材料长期存在于体内，还会会产生不同程度的结缔组织增生包裹，更严重的是溶胀碎裂和植入后周围组织愈着形成纤维性包，即所谓“膜片致癌”。

⑥不同的不可吸收材料还各有不足：如金属类还不利于CT、核磁及放射检查和治疗；硅橡胶生有凝血、吸收类脂物后会溶胀碎裂，抗张强度差等问题，涤纶布类外面可形成较厚的瘫痕，其下方易与脑粘连等缺点；碳纤维本身机械性能有限。

⑦已有的可吸收人工脑膜产品在降解速度、降解性能上在有一定缺陷，临床应用范围有限。

总之，目前人工脑膜在临床应用上存在着不足，不利于大规模产业化生产及临床推广。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的不足，提供一种具备多个功能层的纳米人工硬脑膜，所述纳米仿生人工硬脑膜可被完全吸收、且具有良好的柔韧性、弹性及生物组织相容性，具有防止脑粘连、可完全降解吸收且降解速度适中、能促进硬膜化过程、不带病毒、无免疫排斥的、可根据需要任意裁剪、成本较低、生产周期短、保存、运输容易、临床应用操作简单、应用范围广泛的纳米仿生人工硬脑膜。

本发明的另一目的是提供上述纳米人工硬脑膜的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种具备多个功能层的纳米人工硬脑膜，包含至少两层结构，面向大脑的一层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的一层为亲水性的纳米细胞支架层；两层之间还可以有过渡层；任意两个相邻层之间的连接方式优选通过电纺连接。

所述亲水性的纳米细胞支架层由静电纺制成，即背向大脑面的电纺层为细胞支架层，是为了有效诱导干细胞及成纤维细胞的迁入，该层则采用采用生物相容性好的亲水性材料，再者，通过静电纺丝参数调整，设计上将平均孔径达到20～100μM。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

所述防粘连层是采用疏水性材料，不利于细胞的迁入，从而达到防粘连的目的；制备该层材料的静电纺丝参数进行调整，其孔隙孔径在纳米以下，比细胞小一到二个数量级，从而阻止细胞进入，防止脑粘连产生。因为人体细胞直径平均在10～20μM，一般成纤维细胞直径在20～30μM之间。脑膜主要分布成纤维细胞及其分泌的胶原纤维。平均孔径在3μM以下，已经可以有效的防止脑粘连的产生。静电纺纤维得到的孔隙大小分布很大程度上依赖于纤维直径，已知纤维直径减小时，孔径也在同时减小。据已发表的文献，纤维直径在4～10μM时，孔径从20～45μM。文献报道，静电纺再生丝素纤维非织造织物的平均孔径可达到2μM。

本发明同时提供了一种上述具备多个功能层的纳米人工硬脑膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备疏水性聚合物的电纺溶液；制备亲水性聚合物的电纺溶液；

(2)用制得的疏水性聚合物的电纺溶液通过静电纺制成疏水性的防粘连电纺层；

(3)用制得的亲水性聚合物的电纺溶液在所述防粘连电纺层上通过静电纺制备疏水性的细胞支架层，接收为膜状结构得到纳米仿生人工硬脑膜。

制得的人工硬脑膜经清洗、灭菌、包装后贮存。

上述步骤(1)中所述制备亲水性聚合物的电纺溶液也可以在步骤(2)和步骤(3)之间进行；所述步骤(2)、(3)可以重复若干次，达到合适的厚度。

所述防粘连层的静电纺的工艺参数为：

微量注射泵的速率为0.1～5.0毫升/小时，高压发生器的电压为5～40KV，接收距离为5.0～30.0厘米。细胞支架层的静电纺的工艺参数为：0.5～20.0毫升/小时，调节高压发生器的电压为10～45KV，调节接收装置的接收距离为5.0～30.0厘米。

所述疏水性的电纺溶液可选择疏水性的L～聚乳酸和ε-己内酯，两者重量比为50:50或30:70或70:30，作为共聚高分子材料，数均分子量是150000～500000，溶于六氟异丙醇或二氯甲烷；可用溶液总重量8～14％的聚己内酯的氯仿/甲醇混合溶液；或者其他合适的聚合物及溶剂。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.1～10毫升/小时，调节高压发生器的电压为10～45KV，调节接收装置的接收距离为10～40厘米，并将纤维接收为膜状结构。

此处通过静电纺制备得到纤维直径平均孔径在3μM或以下，纤维直径在50～1000nM之间。

所述亲水性的电纺溶液选择的亲水性材料作制备细胞支架层，可以选用亲水性聚氨酯或者天然明胶、纤维素、壳聚糖、硫酸软骨素等亲水性材料；优选的方案：亲水性聚氨酯，与/或天然明胶，硫酸软骨素、聚乙二醇，重量比20～80:80～20，纺丝液为溶液总重量的3～15％；或者用亲水性聚氨酯与天然明胶，或硫酸软骨素，重量比20～80:80～20，纺丝液为溶液总重量的3～15％；也可选用其他合适聚合物及溶剂。

上述亲水性聚合物电纺溶液的静电纺丝参数为：接收距离从15～25cm，电压15～45KV，亲水性的纳米细胞支架层孔径为20～200μM。纳米细胞支架层纤维直径介于5-200μM，开启静电纺丝，在已纺好的防粘连层上继续纺细胞支架层。

所述电纺溶液是一种或两种以上聚合物混合的电纺溶液，亲水性聚合物材料选自硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸、改性纤维素、海藻酸、淀粉、纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、亲水性聚氨酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚乙烯醇或聚丙交酯；疏水性聚合物材料选自疏水性聚氨酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚已内酯、聚乙交酯或聚对苯二甲酸乙二酯。由于目前高分子材料改性研究在不断发展，原本亲水性材料改性为疏水或疏水材料改性为亲水都越来越常见，范围也越来越广。

将上述材料溶于一定的溶剂，形成电纺液，就可以通过静电纺丝技术制得纳米仿生支架。

所述电纺溶液的溶剂可以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们的任意混合物。上文所述的高分子材料和溶剂用于静电纺丝，这类报道在已有的文献中有相当多的数量。

制得的产品经清洗、灭菌，包装后贮存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明人工硬脑膜机械特性能满足适应症对抗拉伸强度及柔韧性的要求，具有可靠的强度和良好的柔韧性、弹性；能够支持缝针，不透水，在外科修补时和修补后能承受一定的力并产生变形而不破损，使脑脊液不至于渗漏，起到保护脑组织的作用，而且可根据需要任意裁剪；

(2)本发明人工硬脑膜的内侧面(即面向大脑的一面)光滑，能防粘连，能起着很好地隔离头皮软组织与脑组织的作用，外侧面(即背向大脑的一面)和侧边则为多孔结构，允许细胞长入；可促使尽早自体成纤维细胞以及某些未分化的细胞向胶原内部沁润生长浸润，促使脑膜早日修复。利于日后进行颅骨修复手术；

(3)本发明的硬脑膜采用的材料是被证实能够在新生组织生成后被完全吸收的，避免了膜片致癌；

(4)本发明的纳米仿生人工脑膜本身不含活细胞成分，不使用外源细胞和蛋白，免除了因此而带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险；能杜绝疾病传播；

(5)本发明所使用的材料是目前已经证实对人体无毒无害的安全生物材料，具有良好的生物组织相容性，无异物排斥反应，无毒性反应，无致癌、致畸作用。不会带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险，也不会带来其它毒害作用；

(6)本发明的人工脑膜材料来源充分，成本较低，避免了天然材料来源不足，成本高，改性复杂的缺点，贮存运输简单；

(7)本发明的人工脑膜的制备方法工艺步骤简化，生产时间短，能有效避免加工过程中产品受到污染，产品质量易于控制，产品标准容易实现，产品可实现低成本、高效率的产业化生产。

(8)根据本发明制备的人工脑膜临床应用简单，由于在处理中没有引入戊二醛等毒性物质，在临床应用时不需要再进行严格的浸泡和清洗，也因此避免了由于提前浸泡造成的预选尺寸不够而使产品报废的情况。

附图说明

图1为实施例1制得的人工脑膜结构示意图，其中1为细胞支架层，2为防粘连层。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

(1)制备防粘连层：选择疏水性的L～聚乳酸和ε-己内酯，两者比值为50:50，作为共聚高分子材料，数均分子量是260000，溶于六氟异丙醇。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时，调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，并将纤维接收为膜状结构。

此处通过静电纺制备得到纤维直径平均300nm。。

关闭静电装置。

(2)制备细胞支架层：本实施例选用以下方案：聚乙二醇与硫酸软骨素质量比为70:30，纺丝液质量分数为9％。

开启静电纺丝，在已纺好的防粘连层上继续纺细胞支架层。

接收距离从11cm，电压20KV，纤维平均直径在10μm。制得的人工硬脑膜结构见图1所示，其中1为细胞支架层，2为防粘连层。

将制得的人工脑膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。

实施例2

(1)制备防粘连层：选择疏水性的L～聚乳酸和ε-己内酯，两者比值为50:50，作为共聚高分子材料，数均分子量是260000，溶于六氟异丙醇。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时，调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，并将纤维接收为膜状结构。

此处通过静电纺制备得到纤维直径平均300nm。。

关闭静电装置。

(2)制备过渡层：本实施例选用以下方案：聚氨酯与透明质酸的质量比为70:30，纺丝液质量分数为10％。

开启静电纺丝，在已纺好的防粘连层上继续纺过渡层。

接收距离从11cm，电压20KV，纤维平均直径在5μm。

关闭静电纺。

(3)制备细胞支架层：本实施例选用以下方案：聚乙二醇与硫酸软骨素质量比为70:30，纺丝液质量分数为9％。

开启静电纺丝，在已纺好的过渡层上继续纺细胞支架层。

接收距离从11cm，电压20KV，纤维平均直径在10μm。

清洗、保存方式同实施例1。

实施例3

用实施例1制得的硬脑膜进行犬动物实验：

实验犬体重15～20KG，年龄1.5～2岁，雌雄不拘，共5只。以氯胺酮肌肉注射全麻，麻醉剃毛后，将动物置于专用手术台上，腹卧位。用2％碘酒和75％酒精消毒。动物头顶正中，纵向切开。用剥离器分离骨膜，暴露双顶部颅骨板，用高速磨钻磨开颅骨，双顶部形成骨窗。用小剪刀剪掉双侧顶部3cm×3cm大小的矩形硬脑膜，制造出顶部的硬脑膜缺损。在暴露的脑表面电灼，造成6个1mm×1mm大小的损伤点。将用本发明实施例1所制备的人工脑膜修剪成相应形状及尺寸的修补材料，防粘连层向脑表面，用4/0无损伤丝间断缝合，针距4mm，修补于犬顶部的缺损。用圆针4号丝线缝合肌肉。术后对动物进行常规的喂养及观察。术后动物恢复良好，切口愈合良好，无脑脊液漏，无癫痫发生。术后进食进水正常，动物的户外活动正常，没有发现运动障碍，存活至预定期限。

术后18个月，动物以手术部位为中心，在大于手术部位1cm范围切取标本，使其包括人工脑膜及周边硬脑膜及内面的脑组织。切取出标本后，可见人工脑膜与硬脑膜的连接处对合平整，无分界，已完全愈合，仅见缝合的丝线。原生硬脑膜之间未见明显充血，出血等排异反应。

实施例4

用实施例2制得的硬脑膜进行新西兰兔动物实验：

实验的动物施行顶部开颅，人为制造部分硬脑膜缺损及脑组织损伤，然后以人工脑膜分别实施硬脑膜修补术。术后对动物进行常规的喂养及观察。术后动物恢复良好。术后18个月，动物以手术部位为中心，在大于手术部位1cm范围切取标本，使其包括人工脑膜及周边硬脑膜及内面的脑组织。切取出标本后，可见内侧表面可见上皮细胞覆盖，上皮下可见纤维组织增生，纤维母细胞增生，胶原纤维增多，致使材料内带血运的新生组织增生，宿主新生组织侵入，材料降解，总量明显减少，内部可见毛细血管。新老组织界面无中性粒细胞，淋巴细胞等炎症细胞反应，界面处无囊壁形成。蛛网膜及脑组织正常。