预防脊柱椎板切除术后粘连的三七玻璃酸钠凝胶

摘要

本发明公开了一种预防脊柱椎板切除术后粘连的三七玻璃酸钠凝胶。本发明公开的三七玻璃酸钠凝胶，是在0.5g三七按照下述方法制备的三七提取物中加入玻璃酸钠，使玻璃酸钠的浓度为0.015g/ml三七玻璃酸钠凝胶∶用60％(体积百分含量)乙醇回流提取三七，收集提取液，获得三七提取物。所述三七玻璃酸钠凝胶可用来预防脊柱椎板切除术后粘连。使用本发明的三七玻璃酸钠凝胶不但能够减少局部出血及继发血肿的形成，而且又能够促进局部血肿的吸收，有效地预防脊柱术后硬膜外粘连。

说明书

技术领域

本发明涉及预防脊柱椎板切除术后粘连的三七玻璃酸钠凝胶。

背景技术

中药在治疗和预防硬膜外瘢痕粘连等方面有独到之处，它主要通过活血化瘀，益气止血通络等抑制成纤维细胞的活性，释放抗炎症介质，促进正常组织的无瘢痕化修复。三七是临床上常用的止血、活血、软坚散结药之一。现代研究表明三七中既具有钙离子和槲皮甙等止血活性物质，又具有皂甙类和黄酮类等活血化瘀成分，这显示三七具有止血活血物质的协同作用。三七能够使毛细血管通透性增高，对多种致炎剂所致的肉芽组织增生有显著的抑制作用。抑制渗出，减少创伤性炎症。

脊柱椎板切除术后硬膜外粘连是导致术后症状复发的最常见的原因之一，由于再次手术效果不佳，所以临床上如何预防脊柱硬膜外粘连一直是骨科领域亟待解决的难题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防脊柱椎板切除术后粘连的三七玻璃酸钠凝胶。

本发明所提供的预防脊柱椎板切除术后粘连的三七玻璃酸钠凝胶，是在0.5g三七按照下述方法制备的三七提取物中加入玻璃酸钠，使玻璃酸钠的浓度为0.015g/ml三七玻璃酸钠凝胶：

用50％-80％(体积百分含量)乙醇回流提取三七，收集提取液，获得三七提取物。

其中，所述三七与所述乙醇的比为1g∶(4-6)ml。所述回流提取的时间可为1.0-2.0小时。所述提取液还可经过浓缩至50℃时相对密度为1.05～1.10。

当所述三七与所述乙醇的比为1g∶5ml，所述回流提取的时间为2.0小时，所乙醇的浓度为60％(体积百分含量)时，三七提取物中总皂苷的含量较高，且提取工艺简单。

由上述方法制备的三七提取物也属于本发明的保护范围。

其中，所述三七玻璃酸钠凝胶中的玻璃酸钠为生物体内普遍存在的酸性粘多糖，具有良好的生物相容性，并具有预防术后粘连的作用，所述三七玻璃酸钠凝胶中含有15g/100ml玻璃酸钠时，所述三七玻璃酸钠凝胶为稠厚液体，有一定流动性。

所述三七玻璃酸钠凝胶可用来预防脊柱椎板切除术后粘连。

使用本发明的三七玻璃酸钠凝胶不但能够减少局部出血及继发血肿的形成，而且又能够促进局部血肿的吸收，有效地预防脊柱术后硬膜外粘连。三七玻璃酸钠凝胶在局部不但起到三维立体的物理阻挡作用而防止成纤维细胞和炎性细胞与硬膜的接触，而且能够作为三七提取物载体，使三七提取物在局部存留更长时间，以达到三七提取物缓慢吸收，持续发挥药效，使三七提取物在瘢痕修复的不同时期发挥作用。创伤愈合后期局部三七提取物能够起到活血软坚作用促进瘢痕的软化。

本发明的三七玻璃酸钠凝胶是半流体形态，它能被注射到所有手术显露区域而没有损伤神经组织的风险，同时又具有生物相容性，会缓慢被吸收。本发明的三七玻璃酸钠凝胶能够分布到椎板缺损处硬膜外各处，有一定的润滑作用，能够阻隔神经根和硬膜与创面的接触；早期在局部占据一定的空间，并可在创伤愈合过程中降解并被逐渐吸收；同时自身具有一定的抑制创伤性炎性反应，但又不影响纤维环和创面的愈合，生物相容性好等特点。

附图说明

图1为三七玻璃酸钠凝胶薄层鉴定。

图2为高效液相色谱测定三七玻璃酸钠凝胶中总皂苷。

图3为光镜下组织形态学观察脊柱硬膜外腔瘢痕组织的分布，瘢痕与硬膜囊、神经根的关系。

图4为脊柱硬膜外椎板内缘缺损的最大距离和椎板缺损处硬膜外间隙长度。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、预防脊柱椎板切除术后粘连的三七玻璃酸钠凝胶

一、制备三七玻璃酸钠凝胶

取三七，破碎，称取4份，每份20g。分别加50％、60％、70％和80％乙醇回流提取，1g三七加入5ml乙醇(50％、60％、70％和80％)，每次1.5小时。醇提液滤过，测定醇提液中三七总皂苷的含量。

三七总皂苷含量测定方法参照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱：22％流动相A和78％流动相B 0～5min，22→36％流动相A和78→64％流动相B 5～20min；检测波长为203nm。

以含人参皂苷Rg1(0.567mg/ml)、人参皂苷Rb1(0.394mg/ml)、三七皂苷R1(0.12mg/ml)的甲醇溶液作为对照。

醇提液中三七总皂苷的含量测定结果见表1。

60％乙醇提取液中三七总皂苷含量最高。

表1.醇提液中三七总皂苷的含量

对提取时间、提取次数和加醇量3个因素进行考察，每个因素各选取3个水平(见表2)，按L₉(3⁴)正交表安排试验，各个实验的条件和结果见表3。

表2.醇提条件因素水平表

表3.醇提条件正交试验表

对上述试验结果进行方差分析，结果见表4。

表4.醇提条件方差分析表

*：F_1-0.05(2，2)＝19.0  **F_1-0.01(2，2)＝99.0

结果表明，A、B、C三因素对结果都有显著性影响，最佳条件为A₃B₂C₃，即60％乙醇回流提取4次，1g三七加入5ml 60％乙醇，每次2小时。

取三七，破碎，称取3份，每份15g，分别加60％乙醇回流提取3、4、5次，1g三七加入5ml 60％乙醇，每次2小时，获得三七提取物。参照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定醇提液中三七总皂苷的含量，结果见表5。

表5醇提验证试验表

取三七，破碎，称取15g，共称取3份，分别加60％乙醇回流提取4次，1g三七加入5ml 60％乙醇，每次2小时。药渣再分别加水煎煮0、1、2次，每次1小时，加水150ml。合并醇提液与水煎液，浓缩，减压干燥，得干膏。

按前述方法测定干膏中三七总皂苷的含量，结果见表6。

表6.干膏中三七总皂苷的含量

结果表明，加水煎煮与否三七总皂苷含量基本无差别。

取三七，破碎，称取45g，加60％乙醇回流提取4次，1g三七加入5ml 60％乙醇，每次2小时。醇提液抽滤，滤液回收乙醇，并浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)的清膏，平均分为三份，每份相当于15g三七，分别加水至总体积为生药量的1、2和3倍，溶解，冷藏过夜，冷藏液离心(2500rpm，15分钟)，取上清液，微孔滤膜滤过，以氢氧化钠溶液调节pH至7.0～7.5，冷藏过夜，微孔滤膜滤过。参照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定滤液中三七总皂苷含量，结果见表7。

表7.滤液中三七总皂苷含量

由表7可知，加水量为生药量的2、3倍时，三七总皂苷损失不大。

取三七，破碎，加60％乙醇回流提取4次，1g三七加入5ml 60％乙醇，每次2小时。醇提液抽滤，滤液回收乙醇，并浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)的清膏，加注射用水调节其体积至三七质量的2倍，溶解，冷藏过夜。冷藏液离心(2500rpm，15分钟)，取上清液，微孔滤膜滤过，以氢氧化钠溶液调节pH至7.0～7.5，冷藏过夜，微孔滤膜滤过，得到三七提取物(pH7.37)。取三七提取物(pH7.37)，分别加入适量玻璃酸钠，静置使完全溶胀，搅拌均匀，加注射用水分别调节三七提取物和玻璃酸钠浓度，搅匀，得到如下三七玻璃酸钠凝胶：

三七玻璃酸钠凝胶1：每毫升三七玻璃酸钠凝胶1中含有0.01g玻璃酸钠和由0.5g三七按照上述方法制备的三七提取物。

三七玻璃酸钠凝胶2：每毫升三七玻璃酸钠凝胶2中含有0.015g玻璃酸钠和由0.5g三七按照上述方法的三七提取物。

三七玻璃酸钠凝胶3：每毫升三七玻璃酸钠凝胶3中含有0.02g玻璃酸钠和由0.5g三七按照上述方法的三七提取物。

测定三七玻璃酸钠凝胶的pH值和性状，结果见表8。

表8.三七玻璃酸钠凝胶的pH值和性状

结果表明，1.5％的玻璃酸钠作为基质，既便于注射，又有一定延展性和粘附性。三七玻璃酸钠凝胶，分装，密塞，流通蒸汽灭菌30分钟。

性状：三七玻璃酸钠凝胶为淡棕黄色澄明稠厚液体，有一定流动性。

鉴别：取三七玻璃酸钠凝胶2ml，加水至20ml，摇匀，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨洗液(40％的氨水)洗涤2次，每次15ml，弃去氨洗液，再用水洗2次，每次15ml，弃去水洗液，蒸干正丁醇液，残渣加甲醇溶解至2ml，作为供试品。

用含有0.5mg/mL人参皂苷Rb1对照品、0.5mg/mL人参皂苷Re对照品及0.5mg/mL三七皂苷R1对照品的甲醇溶液，作为对照品。

参照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)，吸取供试品溶液与对照品溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板(Merk)上，以氯仿—甲醇—水(65∶35∶10)(体积比)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开9cm，取出，晾干，喷以10％(质量百分含量)硫酸乙醇溶液，100℃(或电吹风)加热至斑点显色清晰。

薄层色谱法结果如图1，从左至右分别三七玻璃酸钠凝胶1、2和3，4为对照品。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

含量测定：吸取三七玻璃酸钠凝胶1ml，置50ml容量瓶中，加甲醇约35ml，超声处理30分钟，放置至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45m)滤过，取滤液，参照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定滤液中的总皂苷。

色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱：22％流动相A和78％流动相B 0～5min，22→36％流动相A和78→64％流动相B 5～20min；检测波长为203nm。理论塔板数按三七皂苷R1峰计不低于4000。

以含人参皂苷Rg1(0.4mg/ml)、人参皂苷Rb1(0.4mg/ml)、三七皂苷R1(0.1mg/ml)的甲醇溶液作为对照。

高效液相色谱结果如图2，三七玻璃酸钠凝胶2中含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1三者的总量为39.12mg/ml。

二、三七玻璃酸钠凝胶用于预防脊柱椎板切除术后粘连

动物模型制作：

成年雄性SD大鼠84只，体重280～300g，1％戊巴比妥钠40mg/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，以俯卧位固定，剃光背部鼠毛，无菌消毒条件下取背部正中切口，切除L1-L2右侧椎板，保留棘突，剔除硬膜外脂肪暴露硬膜囊及L2神经根。按单纯随机方法分为以下4组，三七玻璃酸钠凝胶组(NG)、单纯三七组(N)、空白对照组(C)、纤维蛋白胶组(FG)，每组21只：

空白对照组(C)：在椎板缺损处暴露的硬膜囊表面及右侧神经根均匀涂抹生理盐水后彻底止血逐层缝合；

三七玻璃酸钠凝胶组(NG)：在椎板缺损处暴露的硬膜囊表面及右侧神经根均匀涂抹三七玻璃酸钠凝胶2后彻底止血逐层缝合；

三七药提取物组(N)：在椎板缺损处暴露的硬膜囊表面及右侧神经根均匀涂抹三七药液后彻底止血逐层缝合；

纤维蛋白胶组(FG)：在椎板缺损处暴露的硬膜囊表面及右侧神经根均匀涂抹纤维蛋白胶(云南兰茂生物医药有限公司)后彻底止血逐层缝合。

术后24h各个大鼠分笼饲养，术后常规应用青霉素肌肉注射预防切口感染，手术麻醉反应消失后自由活动、进食、摄水。

每组分别按术后处死时间2、4、8周分为3个时间段，每组在每个时间段各处死7只，其中1只作为大体标本观察，其余6只作为镜下组织形态学观察。

大体观察：从原手术入路逐层解剖，观察瘢痕的量、范围、致密程度以及解剖过程中硬膜囊的完整性，按Lawson标准行粘连程度评定。

0度，硬膜与瘢痕无明显粘连；

1度，硬膜外有薄而散在的膜性粘连，但牵扯瘢痕组织粘连易与硬膜分离；

2度，硬膜与瘢痕粘连较广泛和致密，但仍可钝性分离，分离后硬膜仍完整；

3度，粘连致密，硬膜与瘢痕需锐性分离，分离后的硬膜难以保持完整。

三七玻璃酸钠凝胶组术后2周硬膜外有薄而散在的膜性粘连，但牵扯瘢痕组织粘连易与硬膜分离，术后4、8周硬膜与瘢痕无明显粘连。

空白组术后2周硬膜外有薄而散在的膜性粘连，但牵扯瘢痕组织粘连易与硬膜分离，术后4、8周粘连致密，硬膜与瘢痕需锐性分离，分离后的硬膜难以保持完整。

三七提取物组术后2、4、8周均发现硬膜外有薄而散在的膜性粘连，但牵扯瘢痕组织粘连易与硬膜分离。

纤维蛋白胶组术后2周硬膜外有薄而散在的膜性粘连，但牵扯瘢痕组织粘连易与硬膜分离，术后4、8周硬膜与瘢痕粘连较广泛和致密，但仍可钝性分离，分离后硬膜仍完整。

不同时间各组大体观察粘连程度见表1。

表1.不同时间大体观察粘连程度(单位：度)

  组别  2周  4周  8周  NG组  1  0  0  C组  1  3  3  N组  1  1  1  FG组  1  2  2

光镜下组织形态学观察：HE染色，观察、比较各组动物在各时间段硬膜外腔瘢痕组织的分布，瘢痕与硬膜囊、神经根的关系。

2周时间段各组硬膜外腔均被瘢痕组织或肉芽组织填充，空白组不但在硬膜外裸露的地方出现瘢痕组织，而且在椎板缺损相邻的非椎板切除处亦有瘢痕组织。三七玻璃酸钠凝胶组和三七提取物组在非椎板切除处没有瘢痕组织。纤维蛋白胶组瘢痕致密程度较其他3组稍低(图3A)。

4周时间段三七玻璃酸钠凝胶组和三七提取物组在硬膜外腔出现不同程度的硬膜外间隙，空白组和纤维蛋白胶组均见硬膜外瘢痕仍与硬膜囊粘连，空白组在椎板缺损相邻的非椎板切除处仍有瘢痕组织粘连(图3B和C)。

8周时间段三七玻璃酸钠凝胶组和三七提取物组的硬膜外腔间隙明显，空白组硬膜外粘连广泛，瘢痕组织出现透明变性，空白组硬膜外的胶原纤维量较其他3组均多，而且纤维排列紊乱，广泛与硬膜囊粘连，纤维蛋白胶组硬膜外瘢痕组织致密程度较其他3组低(图3D)。4周时三七玻璃酸钠凝胶组和三七提取物组硬膜外脂肪重新出现硬膜外腔间隙，而空白组和纤维蛋白胶组直至8周时也没有出现。

椎管内预防粘连百分率(c)的计算：根据每个标本椎板缺损处硬膜外间隙的长度(b)和相应椎板切除的长度(a)之比计算椎管内预防粘连百分率(c＝b/a)。

72个组织学标本，从每个标本的HE染色中取3张进行计算机图像分析。分别测量硬膜外椎板内缘缺损的最大距离(a)和椎板缺损处硬膜外间隙长度(b)(图4)。

椎管内预防粘连百分率各组数据以X±s表示。应用SPSS11.0统计软件包分析，三七玻璃酸钠凝胶组同其他3组间两两比较。

椎管内预防粘连百分率(c)的计算结果见表2。

表2.不同时间各组椎管内预防粘连百分率(X±s，％)

  组别  鼠数  2周  4周  8周  NG组  6  0.43±0.20  0.85±0.13  0.86±0.09  C组  6  0.16±0.15*  0.07±0.03**  0.22±0.16**  N组  6  0.27±0.25*  0.64±0.12*  0.65±0.25*  FG组  6  0.08±0.01**  0.11±0.08**  0.21±0.14**

注：三七玻璃酸钠凝胶组与其他3组相比*P＜0.05，**P＜0.01。

上述结果说明，三七玻璃酸钠凝胶对对来自椎管前方和后方的粘连均可起到三维立体的防粘连效果。三七玻璃酸钠凝胶为稠厚液体，有一定流动性可以渗透到椎管前方纤维环处，即使手术时破坏了椎管前方的椎间盘和纤维环，三七玻璃酸钠凝胶对椎管前后方的纤维化粘连也可以预防。