一种防治植物寄生线虫的生物药剂及其应用

摘要

本发明公开了一种防治植物寄生线虫的生物药剂及其应用。该生物药剂，其活性成分为红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ－9－47 CGMCC № 2878。用本发明的生物药剂进行植物寄生线虫的防治，结果表明，红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ－9－47 CGMCC № 2878及其代谢产物对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的卵及二龄幼虫具有很高的毒杀活性并能明显抑制卵的孵化，并且对根结线虫卵粒及卵囊具有明显的寄生作用；当红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ－9－47 CGMCC № 2878与其代谢产物混合使用时，对根结线虫的杀虫效果可达100％。番茄的温室试验结果证明，红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ－9－47 CGMCC № 2878具有很好的杀线虫功效。本发明的生物药剂在植物根结线虫防治中具有良好的应用开发前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种防治植物寄生线虫的生物药剂及其应用。

背景技术

植物寄生线虫是一类重要的植物病原物，在世界上许多国家和地区发生和为害。植物寄生线虫的种类繁多，全世界已报道的植物寄生线虫达200多属5000余种。其中，根结线虫是农业上为害最大的一类植物寄生线虫，其分布地区广泛、寄主多样，能够寄生油料作物、蔬菜、茶、果树、烟草及中药材等2000余种不同的经济作物。据统计，根结线虫造成世界主要农作物的年损失率约为5％，经济损失超过500亿美元。随着我国农业产业结构不断调整、蔬菜产区规模不断扩大、复种指数不断提高，这些均为根结线虫病害的大规模发生提供了良好的条件。目前，根结线虫病害在我国南方和北方地区的温室均已有报道，且为害严重。据估计，我国仅蔬菜每年因根结线虫危害造成的损失已超过数亿元。以番茄为主的蔬菜作物，植物线虫病害连年增加，发病地块减产20％以上，严重的达75％以上，甚至绝收。由于根结线虫广泛的寄主范围，某个特定的地区内同时发生对同一主栽作物造成严重产量影响的根结线虫时常有几种，这也是根结线虫危害严重的原因之一。同时，根结线虫能使真菌和细菌易于侵染植物，进一步诱发植物病害。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但化学杀线虫剂的品种少，且多为高毒、高残留，严重污染和破坏环境，随着人们环保意识的提高和对安全农产品的需求，符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法日益受到重视，成为根结线虫治理的首选措施。

放线菌在自然环境中的分布非常广泛，其中链霉菌在许多生物环境中都是优势菌群，作为一种控制植物病原传播的重要微生物资源，对病原生物不仅有较强的寄生性还具有较强的拮抗性。放线菌寄生植物寄生线虫的现象是十分普遍，Hay&Skipp在调查寄生三叶草的胞囊线虫胞囊寄生菌时发现，放线菌的出现频率很高，约30％的胞囊被放线菌寄生(Hay，F.S.，Skipp，R.A.，1993.Fungi and actinomycetes associatedwith cysts of Heterodera trifolii Go Vart(nematoda：Tylenchida)in pasture soils in NewZealand.Nematologica 39，376-384.)。刘杏忠等在研究定殖于大豆胞囊线虫(H.glycines)胞囊内的寄生菌时，分离到链霉菌属(Streptomycetes)的很多菌株(Liu，X.Z.，Zhang，D.S.，Wu，X.Y.，Shen，C.Y.，Qiu，W.F.，1991.Preliminary studies on theparasitic fungi from the cyst ofHeterodera glycines.Acta Agric.Univ.Pek.17，87-91.)。在目前已发现的数万种微生物源生物活性物质中，约70％是由放线菌所合成的次生代谢物，放线菌中又以链霉菌的种类最多，占总数的52％。目前，国际上广泛用于防治昆虫、螨类和线虫的阿维菌素就是除虫链霉菌的代谢产物。Tian(2001)报道，S.violaceusniger对大豆胞囊线虫和南方根结线虫有一定的抑制效果(Honglin T，Robert D R.Effect of rhizobacteria on soybean cyst nematode，Heteroderaglycines.Journal of Nematology，2000，32(4)：377-388)；鄢小宁(2004)发现，玫瑰暗黄链霉菌能稳定产生杀根结线虫的活性物质，它的培养滤液可以直接触杀二龄幼虫并干扰其侵入植株体内而达到防治目的(鄢小宁，林茂松，刘亮山.南方根结线虫拮抗链霉菌的筛选和鉴定.中国生物防治2004，20(3)：202-205)；Susan(2005)室内生测结果表明，链霉菌S99-60的发酵液能减少哈密瓜根结线虫卵孵化，同时抑制二龄幼虫的活性(Andrea M.S，Keli A，Susan F.M et al.Effects ofgeldanamycin on hatching and juvenile motility in Caenorhabditis elegans andHeterodera glycines.Journal of Chemical Ecology，2005，31(10)，2481-2491)。放线菌作为一类丰富的生物资源，在抑制病原物的过程中不但具有一定的寄生性，同时与其产生的次生代谢物也有密切的关系，具有很强的开发利用价值。因此放线菌作为线虫的生防因子展现出巨大的潜力及应用前景，为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。

发明内容

本发明的目的是提供一株防治植物寄生线虫的红灰链霉菌(Streptomycesrubrogriseus)HDZ-9-47。

本发明所提供的红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47是从大量土壤放线菌中筛选得到的，鉴定为红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)。红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47已于2009年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №2878。

红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878为链霉菌属灰红紫类群，其孢子椭圆形，孢子丝较短，1-3圈紧密螺旋形；该菌可以使明胶液化，还能使牛奶凝固并胨化，能水解淀粉，不能水解纤维素，硝酸盐还原阳性，不产生黑色素；细胞壁氨基酸分析表明，该菌的细胞壁中只含有二氨基庚二酸(DAP)；其16S rDNA的核苷酸序列与红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)的同源性可达98.63％。

以上述红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878为活性成分制备的防治植物寄生线虫的生物药剂也属于本发明的保护范围。

也可以利用发酵培养红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47CGMCC№2878，得到的发酵液与菌体的混合物即为防治植物寄生线虫的生物药剂。

上述生物药剂中，所述发酵培养红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878的发酵培养基的组成为：豆粉4％～15％、淀粉4％～15％、磷酸氢二钾0.2％～1％、氯化钠0.05％～0.8％、碳酸钙0.2％、硫酸亚铁0.1％～1％，其余为水；所述百分含量均为质量百分含量。

所述发酵培养基的pH值为7.0-7.5，具体可为7.3。

所述发酵培养条件为20℃～30℃，160r/m～200r/m，旋转半径200mm～400mm，震荡培养72h～144h。

本发明的第三个目的是提供上述生物药剂的制备方法。

本发明所提供的上述生物药剂的制备方法，是发酵红灰链霉菌(Streptomycesrubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878，所得到的发酵液与发酵红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878的混合物即为防治植物寄生线虫的生物药剂。

本发明的红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878或发酵培养红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878得到的发酵液与菌体的混合物具有毒杀植物寄生线虫的活性，可用于植物寄生线虫的防治，特别是用于根结线虫的防治。

用本发明的生物药剂进行植物寄生线虫的防治，实验结果表明，红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的卵及二龄幼虫具有很高的毒杀活性并能明显抑制卵的孵化，用连续发酵120h后的发酵液处理，线虫的死亡率可达100％，仅用10⁷CFU孢子处理24h后，线虫死亡率可达22.46％；红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878对根结线虫卵粒及卵囊具有明显的寄生作用；当红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878与其发酵液混合使用时，对根结线虫的杀虫效果可达100％，连续发酵144h的发酵液对卵粒孵化的抑制作用可达99.65％，经100℃处理10min后的发酵液对卵粒孵化的抑制作用仍保持在99.16％；番茄的温室盆栽试验证明，红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878具有很好的杀线虫功效，防效可达70％。本发明的生物药剂在植物根结线虫防治中具有良好的应用开发前景。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47的分离、纯化及鉴定

将一定浓度的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)卵(采自中国农业大学线虫学实验室试验温室中被南方根结线虫侵染的番茄的病根。Taylor A L.，Sasser J N.编著.杨宝君，曾大鹏译。植物根结线虫生物学、分类鉴定和防治.北京：科学出版社，1983)的悬浮液涂布于PDA培养基上(约300个/皿)，将孵化出的雌虫进行消毒，将消毒后的雌虫夹碎，并接种于PDA培养基平板上，28℃培养。待长出单菌落后，将单菌落挑至ISP2培养基中(ISP2培养基的组成为：酵母提取物4.0g/L、麦芽膏10.0g/L、葡萄糖4.0g/L、琼脂20.0g/L，其余为水，pH7.2)，采用插片法进行培养和纯化，将筛选得到的菌株命名为HDZ-9-47。

在显微镜下观察筛选到的菌株HDZ-9-47的形态，肉眼观察培养特征，记录气丝、基丝和色素情况；采用薄层层析法测定菌体细胞壁中二氨基庚二酸(DAP)的含量；提取菌体的总DNA，采用通用保守引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，扩增16S rDNA序列，将扩增得到的16S rDNA序列与GenBank Accession No.FJ532437的序列进行BLAST比对，确定筛选得到的菌株的分类地位。

结果表明，菌株HDZ-9-47属于链霉菌属灰红紫类群，其孢子椭圆形，孢子丝较短，1-3圈紧密螺旋形；该菌可以使明胶液化，还能使牛奶凝固并胨化，能水解淀粉，不能水解纤维素，硝酸盐还原阳性，不产生黑色素；细胞壁氨基酸分析表明，其细胞壁中只含有二氨基庚二酸(DAP)；其16S rDNA序列与GenBank Accession No.FJ532437的红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)的同源性可达98.63％。

基于以上特征，将HDZ-9-47鉴定为红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)，并于2009年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №2878。

实施例2、利用红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其代谢产物进行植物寄生线虫的防治

1、平板菌种的培养

培养基配方为高氏合成一号琼脂培养基(GA)，其具体组成为：KNO₃ 1g/L、K₂HPO₄ 0.5g/L、MgSO₄ 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO₄ 0.01g/L、可溶性淀粉20g/L、琼脂20g/L，其余为水；pH值为7.2-7.4。

将上述实施例1筛选得到的红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47CGMCC№2878接种到上述高氏合成一号琼脂培养基平板上，28℃培养7天，挑取单菌落，获得平板菌种。

2、液体发酵培养

发酵培养基的组成为：豆粉4％、淀粉4％、磷酸氢二钾0.2％、氯化钠0.05％、碳酸钙0.2％、硫酸亚铁0.1％，其余为水；pH值为7.3。所述百分含量均为质量百分含量。

将上述步骤1获得的平板菌种接种到装有30mL上述发酵培养基的100mL三角瓶中，25℃-28℃条件下，摇床转速以150r/min-200r/min，旋转半径200mm～400mm，分别发酵培养72h、96h、120h和144h，获得含有红灰链霉菌(Streptomycesrubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其代谢产物的发酵液。

3、利用红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液进行植物寄生线虫的防治

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(Taylor A L.，Sasser J N.编著.杨宝君，曾大鹏译。植物根结线虫生物学、分类鉴定和防治.北京：科学出版社，1983)(中国农业大学)采自中国农业大学线虫学实验室试验温室中被南方根结线虫(Meloidogyne incognita)侵染的番茄的病根。将番茄病根用清水洗净，用小镊子挑出病根上新鲜、饱满、成熟的卵块。将卵块在1％质量百分含量的NaOCl溶液中消毒1min，无菌水反复冲洗，以除去残留的次氯酸钠；将一部分卵块制成线虫卵粒悬浮液备用；一部分卵粒放在装有少量无菌水的培养皿里，25℃恒温箱中培养，每隔24小时收集一次新孵化的南方根结线虫二龄幼虫。

将上述步骤2的发酵72h、96h、120h和144h的发酵液分别于60℃、100℃加热处理10min，分别对南方根结线虫二龄幼虫进行杀线虫活性试验和南方根结线虫孵化抑制试验。

1)红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液对根结线虫二龄幼虫的杀线虫活性试验

在无菌的12孔细胞培养板中分别加入发酵时间不同的发酵液各1mL。同时将发酵72h、96h、120h和144h的发酵液分别离心，得到孢子沉淀，将一部分孢子用无菌水冲洗得到冲洗后孢子，将10⁷CFU的未冲洗孢子和冲洗后孢子分别加入到无菌的12孔细胞培养板中，然后在上述12孔细胞培养板中再加入100μL上述制备的南方根结线虫二龄幼虫的悬浮液(约含100条线虫)，放入25℃培养箱中，24h后按照下述公式计算线虫死亡率和校正死亡率(即杀线虫药效)；同时以1mL无菌水作为对照。实验设三次重复。结果如表1所示。

表1  不同处理发酵液对南方根结线虫二龄幼虫的杀线虫效果

表1中，a-f为统计分析中多重比较显著性(p＝0.05)差异的表示，平均数从大到小排列，平均数最大的值用字母a表示，与其他处理的平均数相比，凡差异不显著的都标字母a，直至某一个与之相差显著的平均数则标b，以此类推。

结果表明，红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液对南方根结线虫二龄幼虫具有良好的杀线虫活性，连续发酵120h后，线虫死亡率可达100％，仅用10⁷个孢子处理24h后，线虫死亡率可达22.46％。

2)红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液对南方根结线虫卵粒孵化的影响

在无菌的24孔细胞培养板中加入不同温度处理的发酵液各1mL。同时将发酵72h、96h、120h和144h的发酵液分别离心，得到孢子沉淀，将一部分孢子用无菌水冲洗得到冲洗后孢子，将10⁷CFU未冲洗孢子和冲洗后孢子分别加入到无菌的24孔细胞培养板中，然后在上述24孔细胞培养板中再加入100μL上述制备的线虫卵粒悬浮液(约含300粒卵)，放入25℃培养箱中进行孵化，7天后观察并计算孵化出的二龄幼虫的数量，按照下述公式计算孵化率、孵化抑制率和校正死亡率；同时以1mL无菌水作为对照。实验设三次重复。结果如表2所示。

孵化率(％)＝孵化出的幼虫数/(孵化出的幼虫数+未孵化的卵粒数)×100％，

表2  不同处理发酵液及孢子悬浮液对南方根结线虫卵粒孵化的作用

表2中，a-f为统计分析中多重比较显著性(p＝0.05)差异的表示，平均数从大到小排列，平均数最大的值用字母a表示，与其他处理的平均数相比，凡差异不显著的都标字母a，直至某一个与之相差显著的平均数则标b，以此类推。

结果表明，红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液对南方根结线虫卵的孵化具有强烈的抑制作用，连续发酵144h的发酵液对卵粒孵化的抑制作用可达99.65％，经100℃处理10min后的发酵液对卵粒孵化的抑制作用仍保持在99.16％。

3)红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液的温室防效试验

将出苗两周的番茄苗移栽入装有高温灭菌沙土的花盆中(直径约28cm)，一周后在每株番茄苗的根际接种上述制备的根结线虫卵粒悬浮液，每株番茄苗接种根结线虫卵约6000粒，实验设以下四个处理：处理一：穴施含10¹⁰CFU红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC № 2878的发酵液、处理二：穴施含10¹²CFU红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878的发酵液、处理三：穴施含10¹⁰CFU红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47CGMCC №2878的发酵液30天后再浇灌含10¹⁰CFU红灰链霉菌的发酵液，处理四：用含10¹²CFU红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878的发酵液蘸根后移栽番茄苗，分别在施加发酵液60天和90天后调查根结线虫为害番茄根部的病情指数和防治效果，按照下述公式计算防效；同时以为福气多(施用量为1.8kg/亩，经换算为0.122g/盆)作为化学药剂对照，以为淡紫拟青霉(施用量为2.5kg/亩，经换算为0.17g/盆)作为生物药剂对照，以清水作为空白对照。实验设八次重复。结果如表3所示。

根结线虫危害的程度以根结着生情况表示，根据根结着生的多少将病情分为五级：

0级：无根结；

1级：根结占全根系的1％～25％；

2级：根结占全根系的26％～50％；

3级：根结占全根系的51％～75％；

4级：根结占全根系的76％～100％。

病情指数＝(4A+3B+2C+1D+0E)/4N×100％，

其中，A～E分别表示对应级别的植株数量，N表示总植株数；

表3  接种90天后调查结果

结果表明，红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)HDZ-9-47 CGMCC №2878及其发酵液共同作用对南方根结线虫具有一定的防治效果，但不同施用方法的防治效果有所不同，其中每穴施10¹²CFU孢子的处理方式防治效果最佳，防效达到70％，优于淡紫拟青霉的防治效果。