植物耐逆性相关转录因子GmNAC20及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种植物耐逆性相关的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种与植物耐逆性相关转录因子GmNAC20及其编码基因与应用。所述植物耐逆性相关蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因能显著提高植物的耐盐性和耐低温性。本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐盐和/或耐低温植物品种，从而对提高农作物产量具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种与植物耐逆性相关转录因子GmNAC20及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB，WRKY等等。

NAC(NAM/ATAF1/2/CUC2)家族是植物中特有的转录因子家族，已经研究的NAC基因在不同的生命过程中起到非常重要的作用。例如对病原菌的防卫、植物衰亡、形态发生以及对非生物胁迫的应答等。

大豆是世界上提供可食性植物油的主要来源，并且为畜牧业提供高蛋白饲料和为人类提供高品质蛋白，它们的生长和产量时常受到非生物环境胁迫的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的耐逆性相关蛋白，名称为GmNAC20，来源于大豆，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的序列2由268个氨基酸残基组成，是大豆中的NAC类转录因子。其编码基因的读码框包含807个核苷酸。

上述(b)中的GmNAC20可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的GmNAC20的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至807位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物耐逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

与植物耐逆性相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端的第1-807位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与序列表中序列1的自5′末端的第1-807位脱氧核糖核苷酸杂交且编码所述蛋白的DNA分子。

序列表中的序列1由807个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第1至807位脱氧核糖核苷酸为GmNAC20的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第1至3位脱氧核糖核苷酸为GmNAC20的起始密码子ATG，自5’端的第805至807位脱氧核糖核苷酸为GmNAC20的终止密码子TAG。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。

含有上述与植物耐逆性相关蛋白编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有GmNAC20基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmNAC20构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在pBin438的多克隆位点(如BamHI和KpnI位点)间插入自序列表中序列1的自5’末端的第1-807位脱氧核苷酸得到的pBin438-GmNAC20。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述GmNAC20基因导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的大豆NAC家族转录因子GmNAC20的编码基因导入植物细胞，可获得对低温和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对盐和/或低温胁迫的耐逆性。

携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

将本发明的GmNAC20基因导入野生型哥伦比亚生态型拟南芥的实验可以证明：T₃代的3个转GmNAC20基因植株(20-a，20-b和20-c)，在盐胁迫和耐低温实验中，存活率和生长状态都要明显好于转空载体的对照植株。说明本发明提供的GmNAC20基因与其编码的蛋白能够显著提高植物的耐盐性和耐低温性。对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐和/或耐低温)的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为Northern分析GmNAC20在干旱、盐和低温胁迫处理下的表达特征。

图2为植物表达载体pBin438-GmNAC20的图谱。

图3为Northern杂交检测GmNAC20基因在转GmNAC20基因植株中的表达量。

图4为转空载体对照植株(Col-0)和转GmNAC20基因植株在耐盐性实验中的生长形态比较照片。

图5为耐盐性实验中，转GmNAC20基因株系和转空载体对照植株(Col-0)的莲座直径和存活率比较。

图中的数据为三次重复实验的平均值±标准差。

图6为转空载体对照植株(Col-0)和转GmNAC20基因植株在耐低温实验中的生长状态和存活率对比。

图7为转空载体对照植株(Col-0)和转GmNAC20基因植株在适应化处理抗冻实验中的生长状态和存活率对比。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，20-a与20a表示同一株系，20-b与20b表示同一株系，20-c与20c表示同一株系。

实施例1、大豆耐逆性相关蛋白GmNAC20编码基因GmNAC20的筛选及其cDNA克隆。

在大豆EST数据库中进行BLAST检索，聚类到54个NAC类基因片段。根据54个NAC基因片段的序列设计54对引物，用常规方法从分别以250mM NaCl、干旱、-4℃处理及未处理的3周大豆南农1138-2幼苗中提取总RNA，经RT-RCR方法分别测定了54个NAC基因在上述处理时的表达特征，其中有15个GmNAC基因至少对低温、干旱和高盐中的一种胁迫有应答反应。GmNAC20基因的表达明显受干旱、低温或盐胁迫诱导。因此对该基因作进一步研究。

首先确认其对非生物胁迫的应答。提取经100mM NaCl处理的大豆南农1138-2(由南京农业大学国家大豆改良中心提供)幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据上述检索获得的基因序列设计引物如下：

5’-TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACAACTCC-3’和

5’-GCGTGGGTACCTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC-3’。

以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为800bp的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的GmNAC20基因由807个脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5′末端第1至807位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。将含有序列表中序列1的自5′末端第1-807位脱氧核糖核苷酸的GmNAC20基因的重组载体命名为pTE-GmNAC20。

实施例2、逆境胁迫处理下大豆GmNAC20基因的表达特征

将大豆南农1138-2种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗进行如下胁迫处理：

1)盐胁迫处理：将大豆幼苗移入200mM NaCl溶液中；

2)渗透胁迫处理：将豆苗根部小心的吸去水分，置于滤纸上暴露于室温空气中；

3)低温胁迫处理：将豆苗浸入预冷的水中，置于4℃冰箱；

4)脱落酸(ABA)处理，将豆苗根浸入100μM ABA溶液中。

每种处理在0、1、3、6、12、24小时分别收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀得到总RNA。以上述扩增的GmNAC20片段(核苷酸序列是序列表中的序列1)为探针，进行Northern分析。

结果如图1所示，GmNAC20基因的表达明显受干旱、200mM NaCl和低温(4℃)胁迫的诱导。

实施例3、转GmNAC20基因培育耐盐和耐干旱胁迫植物

1)GmNAC20表达载体pBin438-GmNAC20的构建以经100mM NaCl处理的大豆南农1138-2(由南京农业大学国家大豆改良中心提供)幼苗的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有BamHI和KpnI接头序列的特异引物5’-TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACAACTCC-3’和5’-GCGTGGGTACCTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC-3’PCR扩增GmNAC20(序列表中的序列1)；然后BamHI和KpnI双酶切PCR产物，回收，将GmNAC20正向插入植物双元表达载体pBin438(李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑)，1994，24(3)：276-282.)的CaMV35S启动子之后的BamHI和KpnI酶切位点之间，得到重组载体pBin438-GmNAC20，如图2所示。

2)转GmNAC20基因植株的获得和鉴定

将pBin438-GmNAC20用电击法导入根癌农杆菌AGL1。PCR鉴定后，通过用抽真空法将农杆菌转入野生型哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16：6，735-743)，种子收获后，播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上。待T1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长。将T1代单株收获后，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得稳定的转GmNAC20株系。

按照上述方法制备转pBin438的T₀代转空载体对照植株，获得12个转pBin438的T₀代转空载体对照植株，

提取野生型植株、T₀代转空载体对照植株、转GmNAC20基因T₀代植株的总RNA进行RT-PCR鉴定分析，引物如下：

5’-TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACAACTCC-3’和

5’-GCGTGGGTACCTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC-3’。

结果表明，在23株转GmNAC20基因的T₀代植株中，有14株检测出GmNAC20基因的表达，而12株野生型和12株转空载体的对照植株均没有检测出目的基因的表达。将分子鉴定阳性的植株单株收种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T₁代的分离情况，如此重复直至T₃代获得遗传稳定的转基因株系。共获得14个稳定遗传的转GmNAC20株系。

T₀代表示转基因当代植株，T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

选择稳定遗传的转GmNAC20株系中GmNAC20表达高的3个株系，进行Northern杂交验证。Northern杂交所用的探针为GmNAC20基因(序列表中的序列1)，结果表明，该3株转GmNAC20基因的T₃代植株20-a，20-b和20-c中，GmNAC20基因有不同程度的表达，而空载体对照植株则未能检出表达，如图3所示。

3)转GmNAC20基因株系的耐逆性鉴定

在正常条件下，从幼苗期开始观察转GmNAC20植株与转空载体对照植株之间的差别，地上部分不论叶片形状、叶片大小、抽苔时期和抽苔高度方面，转GmNAC20植株与转空载体对照植株并没有明显差别。

a)耐盐性试验：

T₃代的转空载体Col-0和T₃代的转GmNAC20的3个转基因株系(20-a，20-b和20-c)同时播种在MS平板上，将萌发后5天的幼苗分别移栽到含有0、50、100、150和175mM NaCl的1/2MS培养基上生长10天，转GmNAC20苗与转空载体Col-0差别不显著。将150mM NaCl处理后的幼苗移栽到蛭石中继续培养3、7、12直至15天进行恢复实验。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。结果表明转GmNAC20基因植株苗的生长状态和莲座直径，均明显好于转空载体对照植株(图4)。并且转GmNAC20基因植株的存活率也明显好于对照：在150mM NaCl处理时，移苗恢复生长15天的情况有明显差异，转空载体对照植株的存活率为42±7％，而转GmNAC20基因植株的存活率与GmNAC20的表达水平相关，在3个转基因株系中，20-a中的表达量最低，20-b中次之，20-c中最高，20-c株系植株的存活率为82±10％，20-b株系植株的存活率为73±10％，他们的存活率显著高于转空载体对照，而20-a的存活率为59±13％，高于对照但不显著。上述结果与图3所示Northern分析的结果相符，20-c中GmNAC20的表达最高，20-b次之，而20-a最低，说明转GmNAC20基因植株的耐盐性明显优于转空载体对照植株(图5)，同时其耐盐性与GmNAC20的表达量相关。

b)耐低温胁迫实验：

将3个转GmNAC20基因株系(20-a，20-b和20-c)的T₃代植株和转空载体对照植株的T₃代植株种在蛭石中，一周后均匀移载至花盆，再生长两周左右，分别以-2℃、-4℃、-6℃、-8℃处理12小时，恢复生长后统计存活率(图6)。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。结果表明：-2℃，所有植株包括的转空载体对照植株和转GmNAC20植株的存活率基本相同，均为98％，-8℃处理下，转空载体对照植株与转GmNAC20植物均死亡。-4℃和-6℃处理下，3个转GmNAC20株系的存活率明显高于转空载体对照植株：-4℃处理下转GmNAC20株系中，20-a株系的存活率为78±13％、20-b株系的存活率为78±8％、20-c株系的存活率为90±7％，而转空载体对照植株的存活率为42±5％；-6℃处理下转GmNAC20株系中，20-a株系的存活率为45±12％、20-b株系的存活率为53±10％、20-c株系的存活率为47±8％，而转空载体对照植株的存活率为24±5％。说明转GmNAC20基因植株的耐低温性明显优于转空载体对照植株(图6)。

适应化处理抗冻实验(图7)，先将上述的三周龄苗置于4℃处理4-5天，再置于-7℃处理12小时，恢复生长后统计存活率(存活率中分母表示实验株数，分子表示存活株数)。3个转GmNAC20株系的存活率明显高于转空载体对照植株，转GmNAC20株系中，20-a株系的存活率为18.5％、20-b株系的存活率为25.9％和20-c株系的存活率35.2％，而转空载体对照植株的存活率为8％。说明了转GmNAC20基因植株的抗冻性明显优于转空载体对照植株。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>植物耐逆性相关转录因子GmNAC20及其编码基因与应用

<160>2

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>1

<210>2

<211>268

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>2