炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA序列和融合蛋白的氨基酸残基序列，含有所述编码序列的细菌细胞；本发明的融合蛋白包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)，在不改变融合蛋白特性的前提下，该融合蛋白可以进行部分氨基酸的替换、插入或缺失；本发明的融合蛋白的第一区和第二区之间设置通式为(Gly Gly Gly GlySer)

说明书

技术领域

本发明主要涉及生物技术领域，特别涉及一种融合蛋白及其应用，尤其涉及炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)的融合蛋白及其用于炭疽毒素的中和。

背景技术

炭疽毒素包括两种A-B型毒素，每种都有不同的催化部分，既水肿因子(EF，edema faetor)和致死因子(LF，lethal factor)。两个催化部分共享一个结合的B部分，保护性抗原(PA，protective antigen)，结合后的完整毒素称为水肿毒素(ET，edema toxin)和致死毒素(LT，lethal toxin)。炭疽对机体的伤害主要是由于ET和LT的共同作用。ET和LT进入细胞发挥作用的过程如下：首先是PA与细胞表面受体(ATR，anthrax toxin receptor)在细胞表面结合，随后furin蛋白酶就将PA降解成20kD和63kD的两个组分。PA63在细胞膜表面形成七聚体，炭疽致死因子和炭疽水肿因子结合在PA七聚体上，经过受体介导的内吞进入细胞质与底物接触从而发挥其毒性作用。

根据以上的炭疽毒素进入细胞的机理，人们设计了不同的炭疽毒素抑制剂，分别将毒素作用过程中涉及的不同分子作为靶标，从而阻断毒素的作用，保护细胞免受毒素的攻击。

LFn是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域，负责致死因子与炭疽保护性抗原的结合。LFn由炭疽致死因子的1-263位残基组成。EFn是炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域，负责水肿因子与炭疽保护性抗原的结合。EFn由炭疽水肿因子的1-254位残基组成。重组表达的LFn和EFn仍然具有结合炭疽保护性抗原的能力，但对细胞无毒性作用。LFn和EFn能够与炭疽致死因子和炭疽水肿因子竞争结合炭疽保护性抗原，具有作为竞争性毒素抑制剂的潜力。但实验显示，它们的毒素抑制活性非常低。

发明内容

本发明的目的：在LFn和EFn的基础上，提供一种具有更强炭疽毒素抑制(中和)活性的LFn与EFn的融合蛋白。

本发明的LFn与EFn的融合蛋白，包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)或上述二区的功能同等物。

所述的功能同等物是指在不改变融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白部分氨基酸的取代、缺失或添加所得到的多肽。

在本发明所指的融合蛋白中，可以是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)的第一区位于融合蛋白的N-末端，炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)的第二区位于融合蛋白的C-末端。也可以是炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)的第二区位于位于融合蛋白的N-末端，炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)的第一区位于融合蛋白的C-末端。这两种情况对融合蛋白的毒素中和活性没有太大的影响。

为了使融合蛋白的两部分尽可能的减少互相干扰，融合蛋白的两个部分之间设置连接肽，连接肽的通式是(Gly Gly Gly Gly Ser)n，n为1-10的整数。编码本发明融合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。

该序列包括与炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同的第一区和与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同，第二区与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同，中间设有(Gly Gly Gly GlySer)3连接肽的编码序列。携带融合蛋白编码序列的重组表达载体(图1)和工程菌。

本发明的重组表达载体包括pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn等。将上述表达载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到工程菌BL21(DE3)-pET21a-LFnEFn和BL21(DE3)-pET21a-27LFnEFn。

本发明的应用。

本发明将LFn和EFn通过一段(Gly Gly Gly GlySer)₃的柔性Linker序列融合在一起，构建的融合蛋白经过细胞保护实验和毒素攻毒的动物实验检测，结果显示其具有的毒素中和活性较单体有很大的提高(图3)，可以有效中和炭疽毒素的作用。

附图说明

图1.含融合蛋白编码基因的重组质粒pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn的构建示意图；

图2.本发明融合蛋白的表达纯化图.

图2-1：融合蛋白LFn/EFn的表达纯化。1，未诱导全菌；2、诱导全菌；3、离子交换纯化产物；4、Ni柱和凝胶过滤产物。5、蛋白Marker(kDa)

图2-2：融合蛋白27LFn/EFn的表达纯化。1，未诱导全菌；2、诱导全菌；3、离子交换纯化产物；4、Ni柱和凝胶过滤产物。5、蛋白Marker(kDa)

图3.本发明融合蛋白的细胞保护活性图；

具体实施方式

实施例1：LFn编码序列的扩增

使用PCR方法从质粒pAS22-LF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物LF5和LFn3-Linker使用DNA合成仪合成，引物LFn5的5’端添加了Nde I的酶切位点，引物LFn3-Linker的5’端添加了BamH I的酶切位点和编码(Gly Gly Gly Gly Ser)₃连接肽的编码序列。LF5：5’-aaccatatggcgggcggtcatggtgatgta-3’

LFn3-Linker：

5’-aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccaccagagcccccgccacccc--gttgatctttaagttcttc-3’

100μl的PCR反应体系中加入1μl的Vent DNA聚合酶(NEB)，20μM的LF5和LFn3-Linker各2μl，2.5mM的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl.PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。

实施例2：27LFn编码序列的扩增

27LFn是指去除了N端27个氨基酸残基的LFn。使用PCR方法从质粒pAS22-LF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物25LFn5和LFn3-Linker使用DNA合成仪合成，引物LFn5的5’端添加了Nde I的酶切位点，引物LFn3-Linker的5’端添加了BamH I的酶切位点和编码(Gly Gly Gly GlySer)₃连接肽的编码序列。

27LFn5：5’-aaccatatgcgaaataaaacacaggaagagc-3’

LFn3-Linker：

5’-aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccaccagagcccccgccacccc--gttgatctttaagttcttc-3’

100μl的PCR反应体系中加入1μl的Vent DNA聚合酶(NEB)，20μM的LF5和LFn3-Linker各2μl，2.5mM的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl.PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。

实施例3：EFn编码序列的扩增

使用PCR方法从质粒pAS22-EF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物LF5和LFn3-Linker使用DNA合成仪合成，引物LFn5的5’端添加了Nde I的酶切位点，引物LFn3-Linker的5’端添加了Xho I的酶切位点。

EF5：5’-aacggatccatgaatgaacattacactgagagtgatattaaaag-3’

LFn3-Linker：5’-aacctcgagaccttctttcttcaaactttcacttattttc-3’

100μl的PCR反应体系中加入1μl的Vent DNA聚合酶(NEB)，20μM的LF5和LFn3-Linker各2μl，2.5mM的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl.PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。实施例4：连接肽为(Gly Gly Gly GlySer)₃时LFn/EFn融合蛋白表达载体的构建。

取2μg的LFn的使用实施例1中引物扩增得到的LFn编码序列，设置50μl的双酶切体系，具体如下：2μg的LFn编码序列，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Nde I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用凝胶回收试剂盒(BBI)纯化LFn编码序列的双酶切产物。

取800ng的pET21a(Novagen公司)载体，设置50μl的双酶切体系，具体如下：800ng的pET21a载体，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Nde I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a的双酶切产物。

连接反应：取3μl经过纯化的pET21a的Nde I和BamH I双酶切产物，加入5μl经过纯化的LFn的Nde I和BamH I双酶切产物，1μl的T4DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.

连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pET21a-LFnLinker。

取2μg的使用实施例3中引物扩增得到的EFn编码序列，设置50μl的双酶切体系，具体如下：2μg的EFn编码序列，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Xho I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化EFn编码序列的双酶切产物。

取800ng的pET21a-LFnLinker载体，设置50μl的双酶切体系，具体如下：800ng的pET21a-LFnLinker载体，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的XhoI和2μl的BamHI，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a-LFnLinker的双酶切产物。

连接反应：取3μl经过纯化的pET21a-LFnLinker的XhoI和BamHI双酶切产物，加入5μl经过纯化的EFn的Xho I和BamH I双酶切产物，1μl的T4DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.

连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pET21a-LFnEFn。

实施例5：连接肽为(Gly Gly Gly GlySer)₃时27LFn/EFn融合蛋白表达载体的构建。

取2μg的27LFn的使用实施例2中引物扩增得到的LFn编码序列，设置50μl的双酶切体系，具体如下：2μg的27LFn编码序列，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Nde I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用凝胶回收试剂盒(BBI)纯化LFn编码序列的双酶切产物。

连接反应：取3μl经过纯化的pET21a的Nde I和BamH I双酶切产物(实施例4)，加入5μl经过纯化的27LFn的Nde I和BamH I双酶切产物，1μl的T4DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.

连接产物转化大肠杆菌Top10，然后挑取克隆送公司测序(感受态Top10的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pET21a-27LFnLinker。

取800ng的pET21a-27LFnLinker载体，设置50μl的双酶切体系，具体如下：800ng的pET21a-27LFnLinker载体，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Xho I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a-LFnLinker的双酶切产物。

连接反应：取3μl经过纯化的pET21a-LFnLinker的Xho I和BamH I双酶切产物，加入5μl经过纯化的EFn的Xho I和BamH I双酶切产物(实施例4)，1μl的T4DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.

连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pET21a-27LFnEFn。

实施例6：LFn/EFn和27LFn/EFn融合蛋白融合蛋白的表达纯化。

将所获得的pET21a-LFnEFn和pET21a-27LFnEFn质粒转化E.coliBL21(DE3)(Novagen公司)感受态细胞(感受态制备方法同DH5α)。工程菌的诱导表达：挑取克隆于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃250rpm培养，培养至OD₆₀₀ 0.5~0.7，加入IPTG至终浓度1mmol/L，在28℃250r/m进行诱导表达6h，1000rpm离心5min离心收集菌体沉淀超声(方法及参数依照超声仪制造商的说明)。超声所得菌液12000g，室温离心2min，取上清进行SDS-PAGE分析，以确定重组蛋白是否表达，SDS-PAGE电泳的样品制备方法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著。

取20ml种子液接种入装有1L LB-Amp培养基的3L锥形瓶，37℃培养至OD600为0.6左右，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG，将温度降为28℃诱导8h后，8000g离心获得菌体，加入1/10体积的20mmol/L Tris(pH8.0)重悬菌体，然后超声破碎菌体，4℃，12000g离心10min，收集上清。在上清液中添加咪唑和NaCl至终浓度为50mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl。在AKTA-explorer上将上述超声溶液上Ni柱。平衡缓冲液为20mmol/L Tris 0.5mol/L NaCl 50mmol/L咪唑pH8.0。上样后使用洗脱液(20mmol/L Tris 0.5mol/L NaCl 0.5mol/L咪唑pH8.0)洗脱，收集洗脱峰。纯化蛋白经超滤浓缩，再通过Superdex 75凝胶过滤柱进一步纯化，收集蛋白洗脱峰，得到目的蛋白。BCA法测定蛋白浓度。

实施例7：融合蛋白的细胞保护性检测

小鼠巨噬细胞J774A.1以10⁴个/ml接种于96孔细胞培养板，培养约24小时，长至90％满。用含有100ng/ml PA和LF的新鲜培养液对各样品进行2倍系列稀释，然后按顺序加入洁净96孔细胞培养板，每样品2复孔，每孔120μl；后于细胞培养箱中37℃孵育1h。小心地将J774A.1细胞培养上清吸去，将孵育1h的样品转加于含有J774A.1细胞的培养板中，于细胞培养箱中37℃孵育3h后，吸出96孔细胞培养板中的培养液，按100μl/孔加入MTT溶液(终浓度1mg/ml，用培养液配制而成)，37℃孵育30min，吸出MTT溶液，每孔加入100μl盐酸-异丙醇，作用10min，用酶联仪测吸光度OD₅₇₀，结果取平行的3个孔的平均值。结果表明融合蛋白的体外毒素中和能力较LFn和EFn单体有较大的提高。

实施例8：融合蛋白保护F344雄性大鼠免受炭疽致死毒素的攻击。

F344雄性大鼠购自维通利华；PA、LF由本室制备，PA、LF和27LE均使用注射用水进行稀释，每只大鼠注射40μg的PA和10μg的LF。注射体积为500μl。试剂经由尾静脉注入，大鼠连续观察48小时以上。结果显示炭疽致死毒素与重组蛋白27LE以一定的摩尔比同时注入有保护效果，大鼠全部存活(连续观察48小时以上。)，当摩尔比低于一定值时，大鼠的生存时间得到延长，但出现了严重的肺部损伤，最终死亡。高摩尔比时，与对照相比大鼠没有出现可见的中毒症状。

表1：同时注射毒素和融合蛋白27LFn/EFn

 

组别存活数/总数存活时间PA+LF(40ug+10ug)0/365±3minPA+LF+8倍摩尔比27LFn/EFn0/3272±45minPA+LF+16倍摩尔比27LFn/EFn3/348h以上

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)

的融合蛋白及其应用

<130>

<160>8

<210>1

<211>789

<212>DNA

<213>LFn

<400>1

<210>2

<211>263

<212>PRT

<213>LFn

<400>2

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>Linker

<400>1

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>Linker

<400>2

<210>5

<211>762

<212>DNA

<213>EFn

<400>1

<210>6

<211>254

<212>PRT

<213>EFn

<400>2

<210>7

<211>1626

<212>DNA

<213>LFn/EFn FUSION PROTEIN

<400>1

<210>8

<211>542

<212>PRT

<213>LFn/EFn FUSION PROTEIN

<400>2