依托泊苷诱导建立的卵巢癌多药耐药细胞株

摘要

本发明涉及一种卵巢癌多药耐药细胞株，特征是选择人卵巢癌SKOV3细胞株作为亲代细胞，从0.1μg/ml逐步增加化疗药物依托泊苷(VP16)的作用浓度至3μg/ml，建立SKOV3/VP16耐药细胞株。SKOV3/VP16细胞能在3μg/mlVP16中稳定生长、传代及复苏，对VP16的耐药指数(RI)为21.548，除对VP16耐药外，对MTX、DOX、DDP、VCR、5－Fu、MMC有交叉耐药。本发明目的是为肿瘤相关研究提供耐药肿瘤细胞模型。

说明书

技术领域

本发明属肿瘤生物学领域，涉及一种人卵巢癌耐药细胞株。具体涉及以人卵巢癌SKOV3为亲代细胞，通过逐步增加化疗药物依托泊苷(VP16)作用浓度，建立了卵巢癌多药耐药细胞株SKOV3/VP16。

背景技术

在女性生殖系统恶性肿瘤中卵巢癌发生率居第三位，由于许多病例首诊时已为晚期，其死亡率居首位。手术及术后化疗是卵巢癌主要治疗手段。与单纯手术相比，卵巢癌术后给予化疗可显著延长患者生存期，因此化疗在卵巢癌治疗中的价值已得到充分肯定。由于卵巢癌对化疗药物产生耐药性，易复发，其5年生存率仍然很低。耐药性的产生不只限于卵巢癌，它也是目前恶性肿瘤治疗遇到的共同难题。肿瘤细胞在化疗中产生的耐药性常表现为多药耐药，即同时对多种结构和作用机制不同的化疗药物产生交叉耐药的现象，它是化疗失败的主要原因。近年来，肿瘤耐药细胞株已成为重要的工具，大量研究利它来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等。建立肿瘤耐药细胞株具有重要应用价值。植物碱类化疗药物依托泊苷是卵巢癌化疗中常用的化疗药物，建立卵巢癌对依托泊苷耐药细胞株能够为肿瘤耐药相关研究提供必要的研究模型，具有实用价值。SKOV3细胞是卵巢腺癌细胞株，来源于卵巢癌患者腹水，由美国G.Trempe于1973年建立，是研究卵巢癌很常用的一种细胞株。国外曾有研究者诱导建立SKOV3对VP16的耐药细胞株，与我们的发明相比，其建立过程和耐药程度有所差别。由于此耐药细胞株为研究机构私有，未进入商业化领域，国际上资源共享仍存在很大障碍，国内难以得到此种细胞株，因此有必要建立我国自己的耐药肿瘤细胞株。

肿瘤耐药细胞株的建立通常有两种方法，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击间断给药法。国内外均有研究对这两种方法进行了比较，认为不同诱导方式可能获得不同耐药机理的耐药细胞株，同时也可能影响肿瘤细胞耐药程度，持续诱导比冲击诱导更易产生耐药性。持续诱导法以肿瘤细胞最终能在特定浓度化疗药物中稳定生长作为诱导成功的判定标准，细胞耐药性稳定、直观，因此本发明主要采用该法来诱导耐药细胞的产生。

肿瘤细胞耐药程度的判定常用耐药指数(resistant index，RI)来表示，RI是耐药细胞半数抑制浓度(50％ inhibitory concentration，IC50)与亲代细胞半数抑制浓度的比值。Snow等按耐药指数的高低将耐药性分为低度(<5)、中度(5-15)、高度(>15)。

发明内容

本发明的目的是建立卵巢癌耐药细胞株SKOV3/VP16，为以下相关研究提供耐药肿瘤细胞模型：研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更有效的肿瘤治疗方法等。

本发明的耐药细胞株建立步骤如下：(1)人卵巢癌SKOV3细胞株，复苏后用DMEM培养液(含10％小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml)于37℃、5％CO₂、95％湿度条件下培养；(2)取对数生长期SKOV3细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使其作用浓度为0.1μg/ml，在37℃、5％CO₂、95％湿度条件下继续培养，适时换液，维持0.1μg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；(3)适当增加VP16的作用浓度，在37℃、5％CO₂、95％湿度条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；(4)重复步骤(3)直到获得能在3μg/mlVP16中稳定生长、传代及复苏的SKOV3/VP16细胞株。在诱导过程中，掌握适当的VP16增加浓度非常重要，理想状况是既通过增加药物浓度筛选出少数耐药细胞又不致于使全部细胞死亡，从而不断获得有更高耐药性的SKOV3细胞。经过探索，在我们的发明中采用每阶段增加0.5μg/mlVP16的方法取得了较好效果，历时9个月建立了SKOV3/VP16耐药细胞株。用光学显微镜观察细胞形态、MTT法绘制细胞生长曲线、检测细胞耐药指数。我们发现，SKOV3/VP16细胞大小、形态不一，生长速度明显减慢，对VP16明显耐药，耐药指数(RI)为21.548。除对VP16耐药外，对MTX、DOX、DDP、VCR、5-Fu、MMC有交叉耐药。

附图说明

图1是倒置相差显微镜下SKOV3活细胞观察图；图2是倒置相差显微镜下SKOV3/VP16活细胞观察图；图3是光学显微镜下SKOV3细胞爬片HE染色观察图；图4是光学显微镜下SKOV3/VP16细胞爬片HE染色观察图；图5是SKOV3及SKOV3/VP16细胞生长曲线。

具体实施方式

实施例1

SKOV3/VP16多药耐药细胞株按以下步骤建立：(1)人卵巢癌SKOV3细胞株，复苏后用DMEM培养液(含10％小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml)于37℃、5％CO₂、95％湿度条件下培养；(2)取对数生长期SKOV3细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使其作用浓度为0.1μg/ml，在37℃、5％CO₂、95％湿度条件下继续培养，适时换液，维持0.1μg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；(3)适当增加VP16的作用浓度，在37℃、5％CO₂、95％湿度条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；(4)重复步骤(3)直到获得能在3μg/mlVP16中稳定生长、传代及复苏的SKOV3/VP16细胞株。每阶段增加VP16量为0.5μg/ml。历时9个月建立SKOV3/VP16细胞株。

当细胞依次对0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml VP16稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由20％小牛血清、5％DMSO、75％DMEM培养液组成，冻存过程应逐步降温，采取4℃30分钟→-20℃1小时→-70℃过夜→液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程序进行：在一个25cm²的细胞培养瓶中加入至少10ml含10％小牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动使冻存物在1分钟内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的细胞悬液移入已加了培养液的培养瓶中，稍加摇动混匀，拧松瓶盖，平放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO₂、95％湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液3～5ml继续培养。

实施例2

对本方法建立的SKOV3/VP16细胞株进行形态学观察及生物学特性鉴定：

1.形态学观察

(1)倒置相差显微镜观察活细胞形态

取对数生长期SKOV3、SKOV3/VP16细胞各一瓶，换液后在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并照像。可见SKOV3细胞呈多角形，形态较一致，细胞内结构均匀(如图1所示)；SKOV3/VP16细胞大小、形态不一，细胞内尤其是近胞膜处有较多深色物质聚集(如图2所示)。

(2)HE染色观察细胞形态

取对数生长期SKOV3、SKOV3/VP16细胞，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，调整密度约1×10⁵/ml，接种于铺盖玻片的培养皿，放CO₂培养箱常规培养，待细胞基本长成单层，取出盖玻片，弃培养液，0.01M PBS浸洗3次，常规HE染色，于光学显微镜下观察。可见SKOV3细胞排列规则，形态均一(如图3所示)；SKOV3/VP16细胞大小、形态不等，胞体及胞核体积较大(如图4所示)。

2.测定细胞生长曲线和群体倍增时间(MTT法)

取对数生长期SKOV3、SKOV3/VP16细胞，用胰酶消化制单细胞悬液，调整细胞密度。每种细胞均以2000/孔种于96孔板，设5个复孔。同时接种8块96孔板。于实验的1～8天每天取出一块板，用MTT法检测595nm波长处OD值，通过OD值一细胞数直线回归方程将OD值换算成细胞数。将8次的实验数据进行分析，绘制生长曲线(如图5所示)。按Patterson公式Td＝ΔT×lg2/lg(Nt/No)计算细胞倍增时间，Td为倍增时间，Nt为终末细胞数，No为初始细胞数(此处用OD值代替)，ΔT为Nt～No的时间，算得SKOV3和SKOV3/VP16细胞群体倍增时间分别为36.36±1.28h和44.47±2.53h，耐药细胞生长速度减慢(P<0.001)

3.耐药谱分析(MTT法)

取对数生长期的SKOV3、SKOV3/VP16细胞，用0.25％胰酶消化，制单细胞悬液，以4×10⁴/ml的密度接种于96孔板，每孔180μl(7200个细胞/孔)。常规培养24h。每孔加20μl用培养液配制的化疗药物，使八种药物(依托泊苷、顺铂、紫杉醇、长春新碱、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、多柔比星、丝裂霉素C)分别以7～8个梯度浓度作用于细胞(梯度浓度根据预实验所得，务必使半数抑制浓度在此梯度范围中间位置)。每一浓度设3复孔，同时设仅接种细胞的无药对照孔和仅加培养液的调零孔。于37℃、5％CO₂、95％湿度培养72h。每孔加5mg/mlMTT液20μl，继续培养4h。吸弃上清液，每孔加DMSO150μl，震荡仪震荡10min，用酶标仪检测595nm波长OD值，每三个复孔取其平均值。根据OD值计算细胞抑制率，计算公式：细胞抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。根据每种药物不同浓度抑制率，利用SPSS15.0软件Regression中的Probit过程计算该药半数抑制浓度(IC50)，从而计算每种药物的耐药指数RI，RT＝耐药细胞IC50/亲代细胞IC50，比较耐药细胞和亲代细胞的差异。分析表明，SKOV3/VP16细胞对VP16的耐药指数(RI)为21.548，属高度耐药，除对VP16耐药外，对MTX、DOX为中度耐药，对DDP、VCR、5-Fu、MMC呈低度耐药，对TAX无耐药性。详细数据如表1所示。

 

化疗药物IC₅₀(SKOV3)(μg/ml)IC₅₀(SKOV3/VP16)(μg/ml)RI依托泊苷(VP16)8.119174.94621.548顺铂(cDDP)2.3075.4342.355紫杉醇(TAX)0.0220.0170.773长春新碱(VCR)0.0150.0604.0005-氟尿嘧啶(5-Fu)1.3435.2713.925氨甲喋呤(MTX)0.2042.74513.456多柔比星(DOX)0.1330.9056.805丝裂霉素C(MMC)0.0490.0571.163

表1

保藏该生物材料样品的单位：中国典型培养物保藏中心

地址：湖北省武汉市武昌珞珈山

培养物名称：人卵巢癌多药耐药细胞株SKOV3/VP16

保藏日期：2009年1月20日

保藏编号：CCTCC—C200905