一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法

摘要

本发明公开了一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，包括辣椒基因组DNA的提取、PCR扩增及特异酶切产物多态性分析，其特征在于根据植物抗病基因序列人工合成一对由一定数量的碱基组成特定序列的核苷酸分子，以此对核苷酸分子为引物，通过PCR反应得到分子标记，利用此标记中的特异酶切产物的大小能鉴别出辣椒抗疫病材料和感疫病材料。这一方法用于辣椒苗期或成株期抗疫病性筛选，能极大地加速辣椒抗疫病育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于辣椒育种领域，具体涉及一种植物分子标记技术，特别涉及一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，该方法适用于抗疫病分子标记辅助育种。

背景技术

辣椒疫病是危害辣椒生产的主要病害之一，在世界上许多国家都有发生，在我国青海、新疆、甘肃、陕西、北京、辽宁、上海、浙江、湖南、四川、云南等辣椒主产区均有大面积发生、流行的报导。随着辣椒产业的发展，辣椒疫病有逐年加重的趋势，造成了严重的经济损失。该病害的病原菌为(Phytophthora capsici Leon)，辣椒的苗期、成株期均可受害，茎、叶和果实都能发病。传播速度快，发病田经常绝产，造成严重的经济损失。目前生产上控制辣椒疫病以化学防治为主，防治效果差，且污染环境；此外，辣椒疫霉菌易发生变异，常导致耐(抗)药菌株的产生。采用土壤消毒虽有较好地防效，但生产上大面积使用则较为困难。

抗疫病品种的应用是防治或减轻辣椒疫病危害的有效途径。目前世界上许多辣椒主产国家均已把选育抗疫病品种作为辣椒育种工作的主要目标之一。但目前对疫病表现出极高抗性的辣椒资源，它们的共同缺点是果形小、品质较差、转育周期长，难以满足辣椒产业化对品种更新换代加速的要求。与传统育种相比，分子标记育种更快、更节省人力、节约时间、提高效率。分子标记技术在植物育种中主要起辅助性作用。它主要寻找与目标基因紧密连锁的分子标记，然后从杂交子代中检测分子标记是否存在。检测到了分子标记的植株，表明含有目的基因，可以进一步优化和筛选。

利用抗病基因产物具有保守结构域的特性，通过人工合成与已知抗病基因产物的保守序列类似的简并引物，以植物总DNA为模板进行PCR扩增，就可得到该种植物的抗病基因同源序列。许多研究证明，一些抗病基因同源序列与抗病基因密切连锁，甚至就是抗病基因的一部分。此外，抗病基因同源序列还具有容易获得、扩增结果稳定和使用费用低廉等优点。因此，分离和克隆植物的抗病基因同源序列成为当前人们比较认同的标记、定位和克隆植物抗病基因的策略之一。

利用抗病基因同源序列获得的基因，往往是一段缺乏5’端与3’端的DNA序列，获得全长基因序列可采用未知侧翼序列扩增——DNA Walking步移法，简称步移法。此法所选择的引物虽与已知DNA序列互补，但两引物3’端是反向的。染色体步移技术主要应用于基因克隆、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补，从而获得完整的基因组序列等方面。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，该方法采用与辣椒抗疫病基因紧密连锁的抗病基因同源序列分子标记，从而实现在育种过程中快速、有效选择抗疫病材料，加速辣椒抗疫病育种进程。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术解决方案：

一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中：

正向引物：5’-AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA-3’

反向引物：5’-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3’

2)提取辣椒基因组的DNA，以引物对辣椒基因组DNA进行PCR扩增，抗疫病材料和感疫病材料均可扩增出长度为590bp的片段；

3)PCR扩增产物在37℃条件下经Bcg I酶切16h后，Bcg I酶的酶切位点为：抗疫病品种克隆的基因序列第324bp处；酶切产物经2％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，抗疫病植株酶切产物有325bp和265bp两条谱带，感疫病植株只有590bp一条谱带。

本发明的鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间抗病性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于抗疫病分子标记辅助育种，能够很好地提高选择效率，加速育种进程。

附图说明

图1为7个辣椒自交系PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNAMarker；1：A5；2：A11；3：B17；4：B23；5：B2；6：B32；7：B19

图2为7个辣椒自交系PCR扩增产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNA Marker；1：A5；2：A11；3：B17；4：B23；5：B2；6：B32；7：B19

图3为7个辣椒自交系PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNAMarker；1：B3；2：P11；3：B4；4：P30；5：B12；6：P97；7：P45

图4为7个辣椒自交系PCR扩增产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNAMarker；1：B3；2：P11；3：B4；4：P30；5：B12；6：P97；7：P45。

以下结合附图和实施例对本发明作更详细的说明。

具体实施方式

以下相关参考文献在本发明中被得以应用：

辣椒LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析，马维等，西北农林科技大学学报(自然科学版)，第1期，2008。

A PCR-based approach for isolating pathogen resistance gene from potatowith potential for application in plants.Leister D，Ballvora A，Salamini F，Gebhardt C.Nature Genet，14，1996。

以PCR鉴定转基因植株的微量DNA提取方法，巩振辉等，西北农业大学学报，第1期，1997。

辣椒疫病三种接种方法的比较，易图永等，中国蔬菜，第2期，2003。

本发明的鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，首次以辣椒抗、感疫病材料为试材，根据植物抗性基因保守区域设计引物(马维等，辣椒LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2008，36(1)：143～148)，以辣椒基因组DNA为模板扩增，得到抗疫病基因同源序列片段，再利用DNA Walking步移法(Leister D，Ballvora A，Salamini F，Gebhardt C.A PCR-based approach for isolating pathogen resistancegene from potato with potential for application in plants[J].Nature Genet，1996，14：421～429。)获得了辣椒疫病抗性基因CanRB。通过对CanRB基因序列限制性酶切位点分析，筛选适宜的限制性酶切位点，结合PCR扩增与酶切产物多态性分析，创建和优化辣椒疫病抗性基因的分子标记体系，开发出与辣椒抗疫病基因连锁的分子标记，以期加快辣椒抗疫病分子育种进程。

具体包括如下步骤：

1、一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中：

正向引物：5’-AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA-3’

反向引物：5’-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3’

2、辣椒基因组DNA的提取：采用改良SDS方法提取辣椒基因组DNA(巩振辉等，以PCR鉴定转基因植株的微量DNA提取方法[J].西北农业大学学报，1997，25(1)：45-47)。

3、以步骤1所述核苷酸分子为引物，对步骤2辣椒基因组DNA进行PCR扩增，抗疫病材料和感疫病材料均可扩增出长度为590bp的片段。PCR扩增体系如下：

(1)反应液体积为25μL，所用物品的组成及含量为：

10倍PCR buffer 2.5μL，25mmol·L^-1MgCl₂ 2.0μL，5U·μL^-1Taq DNA聚合酶0.2μL，5mmol·L^-1 dNTPs1.0μL，20μmol·L^-1正向引物1.0μL，20μmol·L^-1下游引物1.0μL，基因组DNA1.0μL(50ng·μL^-1)，ddH₂O 16.3μL。

(2)PCR扩增反应条件为：

PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，随后于4℃保存备用。

4、PCR扩增产物在37℃条件下经Bcg I酶切16h后，酶切产物经2％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录。抗疫病植株酶切产物有325bp和265bp两条谱带，感疫病植株只有590bp一条谱带。

以下是发明人给出的实施例，这些实施例仅是用于理解本发明，本发明不限于这些实施例。

实施例1：

1、人工设计合成的核苷酸序列作为引物：

正向引物：5’-AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA-3’

反向引物：5’-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3’

2、辣椒基因组DNA的提取：采用改良SDS方法分别提取7个辣椒自交系A5、A11、B17、B23、B2、B32及B19基因组DNA(巩振辉等，以PCR鉴定转基因植株的微量DNA提取方法[J].西北农业大学学报，1997，25(1)：45-47)。

3、以步骤1所述核苷酸分子为引物，分别对上述7个辣椒自交系基因组DNA进行PCR扩增，7个辣椒自交系均可扩增出长度为590bp的片段(图1为7个辣椒自交系PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNA Marker；1：A5；2：A11；3：B17；4：B23；5：B2；6：B32；7：B19)。PCR扩增体系如下：

(1)反应液体积为25μL，所用物品的组成及含量为：

10倍PCR buffer 2.5μL，25mmol·L^-1MgCl₂ 2.0μL，5U·μL^-1Taq DNA聚合酶0.2μL，5mmol·L^-1 dNTPs1.0μL，20μmol·L^-1正向引物1.0μL，20μmol·L^-1下游引物1.0μL，基因组DNA1.0μL(50ng·μL^-1)，ddH₂O 16.3μL。

(2)PCR扩增反应条件为：

PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。随后于4℃保存备用。

4、PCR扩增产物在37℃条件下经Bcg I酶切16h后，酶切产物经2％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录(图2为7个辣椒自交系PCR扩增产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNAMarker；1：A5；2：A11；3：B17；4：B23；5：B2；6：B32；7：B19)。结果表明，辣椒自交系A5、A11、B17、B23、B32及B19酶切产物均有325bp和265bp两条谱带，鉴别为抗疫病材料；而辣椒自交系B2只有590bp一条谱带，鉴别为感疫病材料。

采用灌根接种法(易图永等，辣椒疫病三种接种方法的比较[J].中国蔬菜，2003(2)：16～18)对辣椒自交系对疫病抗病性鉴定结果表明：辣椒自交系A5、A11、B17、B23、B32及B19为抗疫病自交系，辣椒自交系B2为感疫病自交系。因此，利用本发明创制的鉴别辣椒抗疫病特性的分子标记与植株真实抗性相一致，适用于抗疫病分子标记辅助育种。

实施例2：

1、人工设计合成的核苷酸序列作为引物：

正向引物：5’-AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA-3’

反向引物：5’-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3’

2、辣椒基因组DNA的提取：采用改良SDS方法分别提取7个辣椒自交系B3、P11、B4、P30、B12、P97和P45基因组DNA。

3、以步骤1所述核苷酸分子为引物，分别对上述7个辣椒自交系基因组DNA进行PCR扩增，7个辣椒自交系均可扩增出长度为590bp的片段(图3为7个辣椒自交系PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNA Marker；1：B3；2：P11；3：B4；4：P30；5：B12；6：P97；7：P45)。PCR扩增体系如下：

(1)反应液的体积为25μL，所用物品的组成及含量为：

10倍PCR buffer 2.5μL，25mmol·L^-1MgCl₂ 2.0μL，5U·μL^-1Taq DNA聚合酶0.2μL，5mmol·L^-1 dNTPs 1.0μL，20μmol·L^-1正向引物1.0μL，20μmol·L^-1下游引物1.0μL，基因组DNA 1.0μL(50ng·μL^-1)，ddH₂O 16.3μL。

(2)PCR扩增反应条件为：

PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。随后于4℃保存备用。

4、PCR扩增产物在37℃条件下经Bcg I酶切16h后，酶切产物经2％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录(图4为7个辣椒自交系PCR扩增产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNAMarker；1：B3；2：P11；3：B4；4：P30；5：B12；6：P97；7：P45。)。结果表明，辣椒自交系P11、P30、P97及P45酶切产物均有325bp和265bp两条谱带，鉴别为抗疫病材料；而辣椒自交系B3、B4和B12只有590bp一条谱带，鉴别为感疫病材料。

采用灌根接种法(易图永等，辣椒疫病三种接种方法的比较[J].中国蔬菜，2003(2)：16～18)对辣椒自交系对疫病抗病性鉴定结果表明：辣椒自交系P11、P30、P97及P45为抗疫病自交系，辣椒自交系B3、B4和B12为感疫病自交系。因此，利用本发明创制的鉴别辣椒抗疫病特性的分子标记与植株真实抗性相一致，适用于抗疫病分子标记辅助育种。