一种弱毒荧光假单胞菌及其应用

摘要

本发明涉及免疫学领域，具体地说是一种弱毒荧光假单胞菌及其免疫应用方法。具体为所述弱毒荧光假单胞菌对嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌以及荧光假单胞菌感染具有交叉免疫保护效应；其免疫应用方法包括注射法和浸泡法；其中注射法为将在LB培养基中培养的弱毒荧光假单胞菌直接腹腔注射鱼类，浸泡法为将鱼类于含有弱毒荧光假单胞菌的疫苗浸泡液中浸泡一定时间。本发明所得疫苗不但同时对三种不同的病原菌有高效交叉保护效应，而且制备及免疫操作简单，不需要任何纯化过程。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种弱毒荧光假单胞菌及其在病害免疫防治中的应用。

背景技术

微生物病害为阻碍我国及世界水产养殖业发展的主要因素。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)以及荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)为常见的养殖水产生物病原菌。其中嗜水气单胞菌能够感染人类、动物(两栖类、哺乳类等)、鸟类以及鱼类，是一种典型人/畜/鱼共患性病原菌。鲁氏耶尔森氏菌主要危害鲑鱼、鳟鱼以及鲢鱼和镛鱼，造成肠炎红嘴病(Enteric Redmouth disease)。荧光假单胞菌能够感染多种淡水鱼类，包括草鱼、鲫鱼、青鱼、鲤鱼等，造成赤皮病。另外，该菌亦能感染虾类，引起荧光病(Fluorescent disease)。目前对于这些细菌病的免疫防治主要是运用单一性的灭活疫苗，即每种疫苗针对一种病原，而同时针对这三种病原的交叉保护疫苗尚未有报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种弱毒荧光假单胞菌及其免疫应用方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种弱毒荧光假单胞菌：所述弱毒荧光假单胞菌为荧光假单胞菌TSSM1，其于2008年12月25日，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：2828。

所述所述弱毒荧光假单胞菌荧光假单胞菌TSSM1，具有对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)以及荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)感染具有交叉保护效应。

将所述荧光假单胞菌TSSM1，于28℃在LB培养基中培养至OD₆₀₀为1-1.2后，离心收集菌体，在经PBS洗涤后直接注射鱼类。

将所述荧光假单胞菌TSSM1于28℃在LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.8-1后离心收集菌体，悬浮于海水中至终浓度为1 x 10⁸cfu/ml；而后将所要免疫的鱼类置于该含有荧光假单胞菌TSSM1的海水中浸泡15小时。

本发明具有如下优点：

1.交叉免疫保护性。本发明的弱毒荧光假单胞菌疫苗对鲆鲽类具有一定的短期感染能力，但不能诱发产生疾病症状，因而可以作为活疫苗使用，达到同时保护鱼类抵御嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌以及荧光假单胞菌三种菌的感染。

2.高保护率。本发明的弱毒荧光假单胞菌疫苗对上述三种病原菌侵染的免疫保护效率为：注射法，100％；  浸泡法，83-89％。

3.应用简单。本发明的疫苗制备过程简单，只需简单、常规的细菌培养，不涉及蛋白质提取、纯化等。

4.省时省力。本发明的疫苗只需一次免疫，不需加强免疫(boost)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1

疫苗的免疫应用-注射法

步骤1)疫苗制备。将弱毒荧光假单胞菌TSSM1在LB液体培养基中过夜培养；取0.1ml过夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的LB液体培养基中，于28℃下转速160rpm摇动培养至0D₆₀₀为1-1.2，而后将细菌培养液离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4 x 10⁸cfu/ml，即为疫苗制备液。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na₂HPO₄.12H₂O，0.024％NaH₂PO₄；所述弱毒荧光假单胞菌TSSM1其于2008年12月25日，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：2828，分类命名：荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。

步骤2)疫苗的免疫注射。将132条牙鲆(每条重约14g)随机分为6组，每组22条。将这4组分别命名为A，B，C，D，E和F。将A、B和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)疫苗制备液。将D、E和F组的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS。

步骤3)嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌和荧光假单胞菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养嗜水气单胞菌AH1.927、鲁氏耶尔森氏菌YR29473和荧光假单胞菌TSS1至OD₆₀₀为0.6，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度分别为5 x 10⁷cfu/ml(AH1.927)、3 x 10⁷cfu/ml(YR29473)和1 x 10⁸cfu/ml(TSS1)，即为嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌和荧光假单胞菌悬液。

所述嗜水气单胞菌AH1.927购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(编号1.927)；荧光假单胞菌TSS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2329；鲁氏耶尔森氏菌YR29473购于美国标准生物品收藏中心(编号ATCC29473)。

步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌和荧光假单胞菌悬液分别腹腔注射步骤2)的A和D、B和E、C和F组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，0条；B组，0条；C组，0条，D组，14条，  E组，18条，F组，18条。故TSSM1疫苗通过注射法传递时，其针对嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌和荧光假单胞菌感染的免疫保护效率为100％。

实施例2

疫苗的免疫应用-浸泡法

步骤1)疫苗浸泡液的制备。在LB培养基中于28℃培养TSSM1至OD₆₀₀为0.8-1，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于普通海水中至终浓度为1 x 10⁸cfu/ml，即为疫苗浸泡液。

步骤2)疫苗的免疫浸泡。将132条牙鲆(同实施例1)随机分为6组，每组22条。将这4组分别命名为A，B，C，D，E和F。将A、B和C组的鱼在步骤1)疫苗浸泡液中浸泡15小时；将D、E和F组鱼于普通海水中浸泡15小时。

步骤3)嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌和荧光假单胞菌悬液的制备。

同上述实施例1步骤3)。

步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫浸泡后的第30天，用上述步骤3)的嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌和荧光假单胞菌悬液分别腹腔注射步骤2)的A和D、B和E、C和F组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，2条；B组，3条；C组，2条，D组，14条，E组，18条，F组，18条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：

RPS＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)

由此得出TSSM1疫苗通过浸泡法传递时，其针对嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌和荧光假单胞菌的免疫保护效率为分别为85.7％，83.3％和88.9％。