一种聚乙二醇单甲醚－聚己内酯－聚磷酸酯三嵌段共聚物及其制备的siRNA药物载体

摘要

本发明公开了一种siRNA的药物载体，它的活性成分是聚合物形成的带正电荷的纳米颗粒，该聚合物具体可为聚乙二醇单甲醚－聚己内酯－聚磷酸酯三嵌段共聚物。本发明还提供了一种聚乙二醇单甲醚－聚己内酯－聚磷酸酯共聚物以及合成该共聚物的方法。本发明提供生物相容性的三嵌段共聚物，在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高。采用聚合物纳米颗粒作为载体能保护siRNA免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应。这种纳米胶束具有良好的生物相容性，同时高分子胶束具有很好的稳定性和方便制备等特点，使得这类生物可降解的纳米胶束在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物及其制备的siRNA药物载体。

背景技术

RNA干扰是一种由大约二十多个核苷酸组成的双链小分子干扰RNA(siRNA)介导的基因沉默技术，它具有序列特异性而且发生在遗传信息的转录之后。由于RNA干扰技术具有特异性抑制致病基因表达的能力以及其高效、多样化的特征，人们正在不断挖掘siRNA在人类疾病治疗中的潜力，到目前为止已经开展了大量针对疾病治疗的动物实验甚至临床实验，这其中包括以表达血管内皮生长因子(VEGF)、P糖蛋白、端粒酶等各种基因为靶基因的癌症治疗，针对HIV-1、乙型和丙型肝炎、流感和SARS等病毒的实验，以及针对一些神经退化性疾病的研究等。最近的研究还表明利用siRNA也可能治疗II型糖尿病和肥胖症，而视网膜退化病变引起的老年黄斑病变的siRNA疗法更是进入了临床试验阶段。美国费城的Acuity制药公司在2006年美国基因治疗学会年会上还宣布以RNAi为基础的Bevasiranib药物能够“关闭”VEGF基因，用来治疗老年性黄斑病变的II期临床试验取得了初步成功。有RNAi专家指出，这项试验的成果是RNA疗法发展的一个里程碑，而且还预言RNAi在不久的将来就可能用于临床治疗。

尽管目前在大多数细胞培养和体外应用研究中，siRNA显示出抑制基因的良好潜质，体外siRNA的传输结果也比较满意，但在以治疗人类疾病为目的的体内siRNA传输方面却面临着巨大挑战。由于siRNA分子本身穿透细胞膜的能力极差，也不具备靶向功能，而且在生理环境中极不稳定，因此siRNA药物开发的一个关键是siRNA的传输体系。如何增强在体内的稳定性和穿透细胞膜的能力，以及增强疾病治疗的细胞和组织靶向性等都是siRNA传输体系急切需要解决的问题。因此除了寻找和筛选高效特异性的siRNA药物分子之外，在生命体系发挥RNAi治疗功效离不开靶向特定组织或靶细胞的传输体系，siRNA的体内传输体系也因此成为发展和实施RNA干扰疗法的另一个关键所在。尽管动物实验中高压大体积的静脉液力注射(hydrodynamic injection)能将siRNA分子输送到肝脏、脾脏、肺、肾、胰腺等血管丰富的组织，而且十分有效，但在实际临床应用中受到限制；一些物理方法如电穿孔(Electroporation)，以及将siRNA直接送到靶部位如眼睛、肺或中枢神经系统，这类局域性输送方法具有一定潜能，仍然需要寻找更方便适合临床应用的新方法，特别是系统给药的方法。载体介导的siRNA表达质粒的体内传输是一个类似于基因治疗的问题，在研究中可以用一些物理方法，以及病毒或非病毒的传输体系。然而，尽管病毒对它的传递具有高效性，但潜在的安全性问题制约着它的广泛临床应用；而非病毒类的阳离子脂质体和阳离子高分子载体的安全性好的特点使它们成为极具潜力的载体。已有的典型非病毒siRNA传输材料包括聚乙烯亚胺(PEI)、去了端肽的精制胶原“atelocollagen”和一些阳离子脂质体，包括最近报道的siRNA-SNALP(stable nucleic-acid-lipid particle)，通过抗体介导的细胞特异性siRNA输送，以及中性脂质体DOPC，还有用基于寡聚核苷酸适配子(Aptamer)的特异性输送siRNA到细胞的报道，但发展高效具有一定靶向性和安全的siRNA体内传输体系仍然面临挑战。

siRNA给药载体的研究和开发一直是困扰各国科学家的关键问题。人们一直在研究合适的载体材料能有效地将siRNA药物分子输送到靶细胞和部位，并在一段合理时间维持其功效。目前所采用的载体体系大多是阳离子脂质体或水溶性的阳离子聚合物，将这些载体分子与siRNA溶液互混得到二者的复合物，从而实现传递siRNA的目的，这类方法的不足就是不容易放大规模并且重复性较差。Alnylam制药公司发展的Direct RNAi^TM技术主要是针对病灶部位的直接给药，用于治疗眼科疾病、中枢神经系统疾病和呼吸道疾病；而该公司的Systemic RNAi^TM技术用于治疗包括肿瘤、消化系统疾病和自身免疫性疾病等众多疾病。Intradigm公司利用TargeTran^TM siRNA技术，该技术利用阳离子型嵌段高分子通过静电相互作用和siRNA形成纳米颗粒的内核，并覆盖一层具有保护和增强血液中siRNA稳定性的外壳，以及靶向基团。

基于高分子的纳米颗粒已经广泛用于从小分子到生物活性DNA分子的传递的研究，取得了不菲成绩，其中很多成果已经用于临床或临床试验。高分子纳米颗粒的传递体系生物相容性好，具有靶向传递的潜能，具有更好的稳定性，能有效保护生物活性分子对生理环境的耐受性，并增强细胞对被传递分子的吸收。特别值得指出的是高分子自组装的纳米粒具有EPR效应(Enhanced permeability andretention)，可促进药物在肿瘤组织的富集，并能有效地被肿瘤部位细胞吸收，进入细胞质和各种细胞器，因此高分子纳米粒是极具潜能的siRNA传递系统的候选者。而具有良好生物相容性的可降解高分子载体，特别是具有快速去质子化能力的可降解阳离子型高分子载体能有效结合和保护siRNA分子，又能使siRNA在细胞质中迅速释放，实现阻断基因表达的目的，这将使这类载体在小RNA给药中具有更好的优势和应用前景。传统的方式均采用水溶性的阳离子聚合物，将这些载体分子与siRNA互混得到二者的复合物或纳米颗粒，从而实现传递siRNA的目的，这类方法的明显不足在于工艺难以放大，可重复性较差。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种siRNA的药物载体，它的活性成分是聚合物形成的带正电荷的纳米颗粒。

所述纳米颗粒可进行化学修饰或配体修饰。

所述聚合物可为聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物。

上述聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物中，所述聚己内酯为聚ε-己内酯，所述聚磷酸酯由结构式如式(I)的五元环状磷酸酯单体聚合而成：

上述聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述聚己内酯，一个末端嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45，对应的数均分子量为2,000g/mol；所述聚己内酯嵌段的聚合度为45-100，对应的数均分子量为5,130-11,400g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为7-12，对应的数均分子量为1,420-2,430g/mol。

上述三嵌段共聚物，可为mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇或mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂。

所述纳米颗粒的直径可为30-121nm。

本发明还提供了一种聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物。

上述聚己内酯为聚ε-己内酯，上述聚磷酸酯由结构式如式(I)的五元环状磷酸酯单体聚合而成。

上述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述聚己内酯，一个末端嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45，对应的数均分子量为2000g/mol；所述聚己内酯嵌段的聚合度为45-100，对应的数均分子量为5,130-11,400g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为7-12，对应的数均分子量为1,420-2,430g/mol。

本发明还提供了一种合成聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物的方法。

所述合成聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物的方法是以端羟基聚乙二醇单甲醚-聚己内酯为大分子引发剂，以异辛酸亚锡为催化剂，通过环状磷酸酯单体的开环聚合反应得到三嵌段共聚物。

上述端羟基聚乙二醇单甲醚-聚己内酯可以聚乙二醇单甲醚为引发剂，以异辛酸亚锡为催化剂，在本体条件下引发己内酯单体聚合而成。

上述环状磷酸酯单体可通过2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷和N-叔丁氧羰基胺基乙醇反应得到。

上述2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷可通过乙二醇和三氯化磷反应得到。

上述N-叔丁氧羰基胺基乙醇(EABoc)可通过乙醇胺和二碳酸二叔丁酯反应得到。

上述结构式如式(I)的单体聚合后，脱去叔丁氧羰基(Boc)保护基团后便可得到侧基为胺基的聚磷酸酯聚合物。

本发明得到的三嵌段共聚物具有良好的生物相容性和可降解性，其物理、化学性能可通过调节聚合物的组成而调节。本发明提供生物相容性的三嵌段共聚物，在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，作为载体能保护siRNA免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应。该共聚物主要适用于纳米药物载体、基因治疗载体，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。

本发明提供的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯嵌段共聚物可以形成带有正电荷的纳米颗粒，这种纳米颗粒的粒径在100nm左右，表面电荷在40mV左右。在合适的正负电荷比(N/P比)情况下，纳米颗粒能够与siRNA完全结合形成稳定的负载siRNA分子的纳米颗粒。

本发明利用mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒输送针对GFP基因的siRNA，并和Lipofectamine 2000比较沉默GFP在HEK293细胞的表达，证明了纳米颗粒能够将siRNA运输到细胞内并发挥沉默基因表达的作用。本发明利用针对Luciferase蛋白的siRNA进一步定量分析检验了纳米颗粒输送siRNA的能力，mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒转染150pmol siRNA与Lipofectamine 2000转染20pmol siRNA相比，细胞内Luciferase的表达量相当，随着siRNA剂量的增加，细胞中Luciferasede表达量降低，随着N/P比的增加，Luciferase的表达量下降。

本发明通过细胞毒性实验证明这种纳米胶束具有良好的生物相容性，同时高分子胶束具有很好的稳定性和方便制备等特点，使得这类生物可降解的纳米胶束在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为mPEG-PCL-PPEEABoc的合成路线图。

图2为EABoc和PEEABoc的核磁共振谱。

图3为mPEG-PCL大分子引发剂和mPEG-PCL-PPEEABoc的GPC谱。

图4为mPEG-PCL大分子引发剂的的¹H NMR谱。

图5为mPEG-PCL-PPEEABoc和mPEG-PCL-PPEEA的¹H NMR谱。

图6为芘在不同浓度mPEG-PCL-PPEEA聚合物溶液中的激发光谱。

图7为mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒的表征。

图8为mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒的细胞毒性。

图9为mPEG-PCL-PPEEA-siRNA复合物在不同N/P比条件下的粒径和表面电位的变化。

图10为PKH26染色的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒与FAM标记的siRNA形成的复合物在进入细胞后分布的激光共聚焦显微镜照片。

图11为PKH26染色的mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇纳米颗粒与FAM标记的siRNA形成的复合物在进入细胞后分布的激光共聚焦显微镜照片。

图12为纳米颗粒运输绿色荧光蛋白GFP siRNA进入细胞沉默绿色荧光蛋白GFP表达效果的荧光显微镜照片。

图13为纳米颗粒运输不同剂量萤火虫荧光素酶(Luciferase)siRNA进入细胞沉默Luciferase表达效果的比较。

具体实施方式

本发明提供了一种siRNA的药物载体，它的活性成分是聚合物形成的带正电荷的纳米颗粒。

上述聚合物为ABC型聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物，包括聚乙二醇单甲醚(A嵌段)、聚己内酯(B嵌段)和聚磷酸酯(C嵌段)，所述B嵌段为聚ε-己内酯(PCL)，所述C嵌段由结构式如式(I)的单体聚合而成，该聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯共聚物表示为mPEG-PCL-PPEEA。

使用聚己内酯作为本发明的三嵌段共聚物的中间嵌段结构，具有如下优点和作用：①相对疏水性，因此在聚合物链之间的疏水-疏水相互作用促进共聚物自组装；②可生物降解；③生物相容；④合成方法简单可控；⑤原料较为廉价，节约成本。

使用亲水性聚磷酸酯作为本发明三嵌段共聚物的亲水部分，主要利用聚磷酸酯易官能化的优点得到侧基带有胺基官能团的共聚物，为传输siRNA奠定基础。

下述实施例提供了由异辛酸亚锡催化，大分子聚酯引发的合成两亲性三嵌段共聚物的合成方法。该方法是：合成不同分子量的端羟基聚乙二醇单甲醚-聚己内酯；以端羟基聚乙二醇单甲醚-聚己内酯为大分子引发剂，异辛酸亚锡为催化剂，通过环状磷酸酯单体的开环聚合反应得到三嵌段共聚物。

聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物具有两亲性的特征，在水溶液中自组装形成纳米尺度的颗粒，这类纳米颗粒具有疏水的聚己内酯内核和亲水性的聚乙二醇单甲醚和聚磷酸酯外壳，而且颗粒的尺寸与共聚物的组成相关，可以调控。比较有意义的是，本发明中所合成的两亲性共聚物的聚磷酸酯部分均带有可质子化的胺基，在略酸性环境中形成的纳米颗粒表面带有可观的正电荷，通过静电作用可以结合带有负电的siRNA，起到传输siRNA的作用。采用这种纳米颗粒作为载体实现了载体/siRNA复合物的内吞，并达到基因沉默的效果。

可通过常规方法将三嵌段共聚物在水中制备成纳米颗粒，比如溶剂挥发法和透析法。

溶剂挥发法：将三嵌段共聚物溶于四氢呋喃中，于搅拌下滴入超纯水得到相应的终浓度，搅拌两小时后，于减压下除去有机溶剂，再定容至合适的体积。

透析法：将三嵌段共聚物溶于良溶剂如二甲基亚砜(DMSO)中，于搅拌下滴入超纯水得到相应的终浓度，搅拌两小时后，于透析袋中透析除去有机溶剂。

下述实施例还提供了将制备好的纳米颗粒与siRNA溶液互混制备的纳米颗粒与siRNA复合物。

实施例中所用原料来源及处理方法：

ε-己内酯(CL，Acros)，纯度≥99％，在N₂气氛下用CaH₂回流24h，使用前减压蒸出。

聚乙二醇单甲醚(Mn＝2000g/mol，mPEG₄₅)，购于Aldrich公司，纯度≥99.5％，使用前用甲苯共沸除水。

异辛酸亚锡(国药集团化学试剂有限公司)，先用对二甲苯共沸两次，然后再减压蒸馏，收集152℃(20～40Pa)的馏分用于聚合反应。

三氯化磷、乙二醇，使用前重蒸。

二氯甲烷，用五氧化二磷回流24h，使用前蒸出。

三乙胺，先后用邻苯二甲酸酐，NaOH和CaH₂分别回流24h，使用前蒸出。

四氢呋喃，用钠钾合金回流，使用前蒸出。

乙醚、甲苯用钠砂回流干燥，均在使用前蒸出。

未经说明的其他试剂直接使用。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、mPEG-PCL-PPEEA的合成和表征

一、2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(PEEABoc)环状磷酸酯单体的合成与表征

(一)2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(COP)的合成

COP合成路线如图1(A)所示。合成COP的具体步骤为：在300mL 3.26mol/L三氯化磷的二氯甲烷溶液中，缓慢加入301mL 3.25mol/L乙二醇的二氯甲烷溶液。待滴完后，继续反应0.5小时，减压蒸去溶剂。再连续两次减压蒸出产物后，溶解在苯中，通3天O₂直到反应完全，减压蒸馏(20Pa)，收集72℃的馏分，得到COP。

(二)N-叔丁氧羰基胺基乙醇(EABoc)的合成和表征

合成路线如图1(B)所示。合成EABoc的具体步骤为：在250毫升三口瓶中依次加入6.1克(0.10mol)乙醇胺、100mL四氢呋喃、100mL超纯水，搅拌待其完全溶解后，连续加入8.4g(0.1mol)碳酸氢钠和21.8g(0.1mol)二碳酸二叔丁酯。在0℃下反应30分钟后，自然升至室温反应过夜。反应液用100mL乙醚萃取2次，有机相用无水硫酸钠干燥。减压下除去溶剂，得到EABoc，产率为95％。

对EABoc进行核磁共振氢谱(¹H NMR)分析，¹H NMR谱见图2(A)。

由图2(A)可见，各种质子均得到相应归属，积分比例吻合。

(三)2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(PEEABoc)的合成和表征

合成路线如图1(C)所示。合成PEEABoc的具体步骤为：在-5℃的低温反应浴下，将制得的COP(14.25g，0.1mol)的四氢呋喃(30ml)溶液滴加到EABoc(16.10g，0.1mol)和三乙胺(10.12g，0.1mol)的四氢呋喃(120ml)溶液中，反应过夜。然后在N₂保护下，过滤以上溶液，将滤液浓缩后，用400mL干燥的冷乙醚沉淀，移去上清液，沉淀物用油泵抽干，即为PEEABoc。

对PEEABoc进行核磁共振氢谱(¹H NMR)和核磁共振碳谱(¹³C-NMR)分析，¹H NMR谱见图2(B)，¹³C-NMR谱见图2(C)。

从图2(B)可以观察到，1.43ppm的单峰为叔丁基的9个氢核，3.36ppm和4.12ppm的三重峰分别为-OCH₂CH₂NH-和-OCH₂CH₂NH-片段上的2个氢核，4.36ppm的多重峰为磷酸酯环-OCH₂CH₂O-上的4个氢核。在图2(C)中，各种碳的化学位移已在图中标明。以上的核磁共振谱证明了单体的结构。

二、聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-PCL-PPEEA)的合成和表征

(一)聚乙二醇单甲醚-聚己内酯(mPEG-PCL)大分子引发剂的合成和表征

各种分子量的端羟基聚乙二醇单甲醚-聚己内酯大分子引发剂是以聚乙二醇单甲醚为引发剂，在本体条件下引发己内酯单体聚合而成。通过调节聚乙二醇单甲醚的分子量以及己内酯与聚乙二醇单甲醚的投料比，可以得到不同分子量的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯聚合物。异辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性，是被最广泛应用的内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂，已被美国FDA批准作为食品添加剂。

以mPEG₄₅为引发剂，异辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)为催化剂制备聚合物，聚合反应在手套箱中进行，mPEG-PCL合成的具体实验步骤如下：

1)将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后，放入手套箱。

2)按表1的配比进行投料：向烧瓶中加入mPEG₄₅、CL单体和Sn(Oct)₂，在120℃搅拌下反应。

3)反应24小时后，将产物移出手套箱，用少量的CH₂Cl₂溶解，将溶液沉淀到冷的乙醚中，反复两次，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重为止，即得产物。

不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列mPEG-PCL共聚物，见表1。

表1 不同投料比(摩尔比)合成mPEG-PCL

^a聚合物右下角的数字代表聚合物根据¹H NMR得到的聚合度

对上述mPEG-PCL共聚物进行核磁共振氢谱(¹H NMR)分析，测定其聚合度和数均分子量。用凝胶渗透色谱(GPC)法以聚苯乙烯为标准分析mPEG-PCL共聚物的数均分子量和分子量分布PDI(分子量分布宽度指数)。聚合度、数均分子量和分子量分布PDI见表2。GPC谱见图3(A)和图3(B)。¹H NMR谱见图4。

表2 mPEG-PCL聚合物的表征

^aGPC测定；^b1H NMR测定。

由表2可见，根据¹H NMR计算结果，mPEG₄₅-PCL₄₅的数均分子量为7130g/mol，对应的嵌段PCL₄₅的数均分子量为5130g/mol；mPEG₄₅-PCL₁₀₀的数均分子量为13400g/mol，对应的嵌段PCL₁₀₀的数均分子量为11400g/mol。

图3(A)对应mPEG₄₅-PCL₄₅；图3(B)对应mPEG₄₅-PCL₁₀₀。从图中可以看到两种聚合物呈现的都是规整的单峰，并具有相对较窄的分子量分布。

图4(A)对应mPEG₄₅-PCL₄₅；图4(B)对应mPEG₄₅-PCL₁₀₀。经过对比可以看到mPEG₄₅-PCL₄₅和mPEG₄₅-PCL₁₀₀具有相似的谱，分析如下：字母a到f标记了归属mPEG-PCL的所有质子信号，聚ε-己内酯的聚合度通过4.02ppm的三重峰(归属于聚己内酯的-C(O)OCH₂)与3.63ppm的单峰(归属于聚乙二醇单甲醚的-CH₂CH₂-)的积分面积比计算得到。

(二)聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-PCL-PPEEA)的合成和表征

以mPEG-PCL为引发剂，异辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)为催化剂制备聚合物，聚合反应在手套箱中进行。在反应前，mPEG-PCL大分子引发剂用干燥的甲苯共沸两次，减压抽干。合成路线如图1(D)。合成mPEG-b-PCL-b-PPEEABoc的具体步骤如下：

1)将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后，放入手套箱。

2)按表2的比例进行投料：往25mL烧瓶中加入mPEG-PCL、PEEABoc和THF，保证PEEABoc的起始浓度为1mol/L。在30℃下搅拌30分钟后，加入Sn(Oct)₂。

3)反应3小时后，将反应液浓缩，在0℃下沉淀到10:1(v/v)的乙醚/甲醇混合溶剂中，过滤，将固体抽干，即得到mPEG-b-PCL-b-PPEEABoc。

4)取1g上述聚合物溶于10mL无水THF，加入20mL的6M HCl/THF溶液使得HCl最终的浓度为4M。在0℃下搅拌反应2小时后，将反应液浓缩，用冷的乙醚沉淀，过滤，抽干固体，即得到mPEG-b-PCL-b-PPEEA聚合物。

表3 不同投料比(摩尔比)合成mPEG-PCL-PPEEABoc聚合物

^a聚合物右下角的数字代表聚合物根据¹H NMR得到的聚合度

用凝胶渗透色谱(GPC)法以聚苯乙烯为标准分析mPEG-PCL-PPEEABoc共聚物的数均分子量和分子量分布PDI(分子量分布宽度指数)。需要指出，由于脱保护后的mPEG-PCL-PPEEA很难用GPC表征，所以所列的分子量及分子量分布都是指脱保护前的mPEG-PCL-PPEEABoc。对mPEG-PCL-PPEEABoc和mPEG-PCL-PPEEA进行核磁共振氢谱(¹H NMR)分析，测定其聚合度和数均分子量。mPEG-PCL-PPEEABoc的聚合度、数均分子量和分子量分布PDI见表4。mPEG-PCL-PPEEABoc的GPC谱见图3(C)和图3(D)。mPEG₄₅-b-PCL-b-PPEEABoc和mPEG₄₅-b-PCL-b-PPEEA的¹H NMR谱见图5。

表4 聚合物的表征

^aGPC测定；^b1H NMR测定。

由表4可见，根据¹H NMR计算结果，mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEABoc₇的数均分子量为9000g/mol，对应的嵌段PPEEABoc₇的数均分子量为1870g/mol；脱保护后对应的mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇的数均分子量为6550g/mol，对应的嵌段PPEEA₇的数均分子量为1,420g/mol；mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEABoc₁₂的数均分子量为16600g/mol，对应的嵌段PPEEABoc₁₂的数均分子量为3200g/mol；脱保护后对应的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂的数均分子量为15840g/mol，对应的嵌段PPEEA₁₂的数均分子量为2430g/mol。

图3(C)对应mPEG₄₅-b-PCL₄₅-b-PPEEABoc₇；图3(D)对应mPEG₄₅-b-PCL₁₀₀-b-PPEEABoc₁₂。从图中可以看到聚合物呈现的都是规整的单峰，并具有相对较窄的分子量分布。与mPEG-PCL大分子引发剂(图3(A)和图3(B))比较可以看到mPEG-PCL-PPEEABoc聚合物的分子量向高分子量方向移动。

图5(A)对应脱保护前的mPEG₄₅-b-PCL₄₅-b-PPEEABoc₇；图5(B)对应脱保护后的mPEG₄₅-b-PCL₄₅-b-PPEEA₇；图5(C)对应脱保护前的mPEG₄₅-b-PCL₁₀₀-b-PPEEABoc₁₂；图5(D)对应脱保护后的mPEG₄₅-b-PCL₁₀₀-b-PPEEA₁₂。与图4(A)相比较，图5(A)和图5(C)出现了几个新的信号，如在1.40～1.48ppm处的多峰对应的除PCL链段上的e处的亚甲基的质子信号外，明显多出了聚磷酸酯侧基Boc保护基团上甲基的9个氢核(j)的质子信号，在4.35ppm处出现的信号对应于聚磷酸酯主链段上-O-CH₂-CH₂-O-的4个氢核(g)的峰，在4.20ppm和3.41ppm出现的质子峰则归属于聚磷酸酯链段侧基上的-O-CH₂(h)-CH₂(i)-NH-的信号。聚磷酸酯链段的聚合度是根据HNMR图中在4.35ppm处的聚磷酸酯主链上的质子(g)积分面积与在3.63ppm处的聚乙二醇主链上的质子(b)积分面积之比计算的。这些聚磷酸酯链段上特征信号峰的出现证明了嵌段聚合物的生成。将mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEABoc₁₂三嵌段聚合物在无水的HCl/THF溶液中反应脱去Boc的保护基团，图5(B)和图5(D)给出了脱保护后¹H-NMR谱图的变化。从中可以发现，Boc基团上的1.48ppm处的强峰消失，而在8.42ppm处出现了一个钝峰，对应于侧链胺基的活泼氢，从而证明了脱保护的成功进行，并且从图中相应峰的积分面积计算己内酯和磷酸酯链段保持完整，没有发生降解等副反应，相应链段的聚合物均没有变化。

实施例2、用mPEG-PCL-PPEEA共聚物制备纳米颗粒

1、纳米颗粒的制备

两亲性嵌段共聚物在水溶液中存在疏水嵌段的疏水相互作用，只要共聚物浓度高于临界聚集浓度即可形成纳米颗粒。

制备纳米颗粒的方法有多种，最简单常见的就是溶剂挥发法，具体方法为：将10mg mPEG-PCL-PPEEA三嵌段共聚物溶于1mL四氢呋喃中，室温下搅拌1小时，然后在搅拌下以60mL/h的速度滴入10mL超纯水，再搅拌两小时后，于减压下抽掉有机溶剂，定容到10mL，得到1mg/mL的纳米颗粒溶液。

通过上述方法分别制备1mg/mL的mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇纳米颗粒溶液和1mg/mL的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒溶液。

2、临界聚集浓度(CAC)的测定

以芘为荧光探针表征两亲性聚合物的聚集体的临界聚集浓度是最为常见和有效的方法。

将上述配制的1mg/mL的纳米颗粒溶液稀释成一系列浓度，同时保证每一浓度下芘的浓度保持6×10^-7mol/L不变。固定最大发射波长在390nm，扫描芘的激发光谱。见图6(A)和(B)。

图6为芘在不同浓度mPEG-PCL-PPEEA聚合物溶液中的激发光谱。图6(A)为mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEABoc₇；图6(B)为mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEABoc₁₂。由图可见，两图的变化趋势一致。随着聚合物浓度的增加，芘探针的荧光光谱发生了显著的变化，首先是峰的强度逐渐增强，其次是其(0，0)吸收谱带从336nm红移到339nm，这些变化是由于芘由水环境转移至疏水环境，意味着核壳结构的纳米颗粒的形成。

结合上述的激发光谱，计算每个聚合物浓度下339nm和336nm时峰的强度比，即I₃₃₉/I₃₃₆，将一系列的I₃₃₉/I₃₃₆对相应的浓度的对数作图，见图6(C)，图中的Log特指Log₁₀。

由图6(C)可见，两条曲线均呈S型，在低浓度下，聚合物的荧光强度基本稳定，当达到一定浓度后，其比值开始迅速增大，表明芘选择性的由水环境进入疏水核中，此时纳米颗粒形成。继续增大聚合物浓度时，荧光强度到达一个平台，不再增大，这表明共聚物在水中已完全自组装形成了以聚己内酯为疏水核的纳米颗粒。CAC值可由水平线与斜线切线的交点确定。

利用上述方法求得mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇和mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂的CAC值分别为3.57×10^-3和2.68×10^-3mg/mL。可以发现，随着疏水链段聚己内酯的增加，聚合物的CMC值减小，表明随疏水相互作用的增强，聚合物胶束更易形成。CAC的大小直接反应了聚合物颗粒在水溶液中的稳定性，其值愈小表明组装颗粒的稳定性愈高。本发明中的聚合物的CAC值与一般的小分子表面活性剂相比，低了近两个数量级，表明此聚合物较好的稳定性。

3、纳米颗粒的形态

利用透射电子显微镜观察mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒的形态。如图7(A)和图7(B)所示，图7(A)对应mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇；图7(B)对应mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂。

由图可见，两种mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的纳米颗粒都呈现规整的球形结构，粒径约为20nm和60nm且大小分布均一。

4、纳米颗粒的粒径和zeta电势

通过型号为Malvern Zetasizer Nanao ZS90的动态光散射仪检测浓度为0.1mg/mL的mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒的粒径与粒径分布。图7(C)和图7(D)分别是聚合物mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇的粒径和zeta电势的结果，图7(E)和图7(F)分别是聚合物mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂的粒径和zeta电势的结果。

mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇纳米颗粒的平均直径为27.7nm，粒径分散度(PDI)为0.20，zeta电势为32.3mV。mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂颗粒的平均直径在121nm，粒径分散度(PDI)为0.09，zeta电势为45mV。需要指明的是，利用动态光散射测量的粒径比透射电子显微镜的结果偏大，这主要是因为动态光散射测量的是纳米颗粒在水溶液中的流体动力学半径，而透射电镜测量的是纳米颗粒在脱水状态的粒径。但是不管哪种测量方法均显示上述三嵌段聚合物的纳米颗粒都具有均匀的粒径分布。这些正电荷除了可以稳定纳米颗粒外，更主要的作用是可以结合siRNA，起到传输siRNA的作用。

5、mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒的生物相容性

将上述配制的1mg/mL的纳米颗粒溶液稀释为1.95-500μg/mL。通过MTT方法测定不同浓度mPEG-PCL-PPEEA共聚物纳米颗粒的细胞毒性。具体试验为：将不同浓度的mPEG₄₅-PCL₄₅-PEEP₇纳米颗粒溶液和不同浓度的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PEEP₁₂纳米颗粒溶液分别与HEK293细胞共培养24小时后，分别测细胞存活率，以PEI作为对照实验。不同处理下细胞的存活率见图8。

由图可见，当聚合物浓度从1.95μg/mL增大到500μg/mL，两种纳米颗粒对细胞活力都没有明显的影响，细胞活力一直维持在100％左右，表明上述纳米颗粒具有良好的生物相容性。

实施例3、mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒作为siRNA载体的应用

siRNA是一种由二十多个核苷酸组成的双链小分子RNA，带有负电荷，可与带正电的mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒通过正负电荷作用形成稳定的复合物。

N/P指的是纳米颗粒的胺基正电荷与siRNA磷酸基团的负电荷的比值。

1、纳米颗粒与siRNA复合物的表征

按照实施例2的方法制备浓度为5mg/mL的mPEG₄₅-PCL₄₅-PEEP₇纳米颗粒溶液。绿色荧光蛋白GFP siRNA，序列为GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT，购自上海吉玛制药技术有限公司，将10D GFP siRNA溶解在150μLDEPC处理的水中，得到浓度为20μMsiRNA溶液。上述纳米颗粒与上述siRNA溶液分别按不同N/P比混合，制备不同的mPEG₄₅-PCL₄₅-PEEP₇纳米颗粒与siRNA复合物。

通过动态光散射测量以上纳米颗粒或纳米颗粒与siRNA复合物的粒径和粒径分布。通过Zeta电势测量以上纳米颗粒或纳米颗粒与siRNA复合物的表面的电势。图9(A)为在N/P比分别为1:0、1:1、5:1时，mPEG₄₅-PCL₄₅-PEEP₇纳米颗粒与siRNA复合物的粒径变化。图9(B)为N/P比分别为1:0和1:1时mPEG₄₅-PCL₄₅-PEEP₇纳米颗粒纳米颗粒与siRNA复合物的表面电位变化。

从图9(A)图可见，当N/P比为1:0，即只有纳米颗粒时，复合物粒径最大为121nm，当N/P比为1:1时，复合物粒径最小，为98±1.4nm。而随着N/P比的增加，复合物粒径增大，并接近N/P比为1:0时的粒径。从图9(B)图可见，在N/P为1:0时，复合物的表面电位最大，为45mV，当N/P比为1:1时，复合物表面电位降低到-10.7±0.76mV，表明mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒通过电荷相互作用与siRNA结合形成复合物。

不同N/P比形成的mPEG₄₅-PCL₄₅-PEEP₇纳米颗粒与siRNA复合物的粒径和表面电位见表5。

表5 不同N/P比形成的复合物的粒径和表面电位

2、纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬

1)mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬

将0.5μL PKH26染料加入到1mL浓度为5mg/mL的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒溶液中，室温放置过夜，然后用超纯水透析除去没有进入纳米颗粒疏水性核的PKH26染料。荧光染料FAM标记的绿色荧光蛋白GFP siRNA，序列为GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT，购自上海吉玛制药技术有限公司，将10D GFP siRNA溶解在150μL DEPC处理过的水中，得到浓度为20μM GFP siRNA溶液。上述纳米颗粒与上述siRNA溶液按N/P＝50混合，制备mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒与siRNA复合物。

将上面制备好的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒与siRNA复合物与HEK293细胞在37℃共同培养2小时后，用Hoechst 33342对细胞核染色，最后用4％甲醛溶液室温下固定细胞30分钟，用激光共聚焦显微镜观察细胞吞噬纳米颗粒的结果，见图10。

图10给出了HEK293细胞吞噬mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒激光共聚焦显微镜观察的结果，细胞内绿色的部分是FAM标记的siRNA，细胞内红色的部分是PKH26标记的纳米颗粒，细胞内蓝色的部分是细胞核。通过三种颜色叠加的结果可以看出纳米颗粒与siRNA在细胞内分离，而且纳米颗粒并没有进入细胞核，siRNA主要分布在细胞胞浆中。

图10中，图10(A)为在488nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是FAM标记的siRNA；图10(B)为在551nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是PKH26标记的纳米颗粒；图10(C)为在346nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是细胞核；图10(D)为图10(A)、图10(B)和10(C)的叠加结果。由图可以看出纳米颗粒与siRNA在细胞内分离，而且纳米颗粒并没有进入细胞核，siRNA主要分布在细胞胞浆中。表明mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒能够有效的将siRNA运输到细胞内，并能够与siRNA分离，使siRNA发挥基因沉默的作用。

2)mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇纳米颗粒与siRNA复合物的细胞吞噬

同步骤1)，结果见图11。

图11中，图11(A)为在488nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是FAM标记的siRNA；图11(B)为在551nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是PKH26标记的纳米颗粒；图11(C)为在346nm激发光下的激光共聚焦显微镜照片，显示的是细胞核；图11(D)为图11(A)、图11(B)和11(C)的叠加结果。

图11显示的结果与图10显示的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒的细胞吞噬结果相似。

3、纳米颗粒与siRNA复合物沉默基因表达

1)纳米颗粒与siRNA复合物对绿色荧光蛋白基因的沉默

绿色荧光蛋白GFP siRNA，序列为GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT，购自上海吉玛制药技术有限公司。

将300ng pEGFP-N2质粒(Clontech)用Lipofectamine2000转染入HEK293细胞，称为HEK293-pEGFP-N2。实验共设以下几种处理：

将100pmol绿色荧光蛋白GFP siRNA溶解在50μLOpti-MEM中，然后向其中加入60μl的5mg/mL的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂，得到N/P＝50的mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒与siRNA复合物溶液。将溶液在室温下静置20分钟后，加入到已经转染了pEGFP-N2质粒(Clontech)6小时的HEK293细胞中。

将100pmol绿色荧光蛋白GFP siRNA溶解在50μL Opti-MEM中，然后向其中加入60μl的5mg/mL的mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇，得到N/P＝50的mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇纳米颗粒与siRNA复合物溶液。将溶液在室温下静置20分钟后，加入到已经转染了pEGFP-N2质粒(Clontech)6小时的HEK293细胞中。

以HEK293-pEGFP-N2细胞作为对照1；用Lipofectamine 2000转染LuciferasesiRNA的复合物转染HEK293-pEGFP-N2细胞，作为阳性对照(Luciferase siRNA的终浓度为20pmol/孔)；用游离的Luciferase siRNA转染HEK293-pEGFP-N2细胞，作为对照2(Luciferase siRNA的终浓度为20pmol/孔)。用荧光倒置显微镜对处理48小时后的HEK293细胞拍照，照片见图12。

图12(A)为对照1；图12(B)为阳性对照；图12(C)为对照2；图12(D)对应mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂；图12(E)对应mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇。

由图可见，单独的siRNA对细胞中的基因表达没有明显影响，Lipofectamine2000转染的siRNA明显降低了GFP在细胞中的表达水平，mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒在100pmol/孔的浓度下显著降低细胞中GFP的表达。以转染了pEGFP-N2质粒(Clontech)的HEK293细胞中GFP的表达水平计作100％，转染了pEGFP-N2质粒和单独的siRNA的细胞中GFP表达水平为99.3％，利用Lipofectamine 2000转染GFP siRNA的细胞内GFP表达水平为54.5％，利用mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂转染GFP siRNA的细胞内GFP表达水平为51.5％，利用mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇转染GFP siRNA的细胞内GFP表达水平为72.3％。

2)纳米颗粒与siRNA复合物对萤火虫荧光素酶基因的沉默

Luciferase是萤火虫荧光素酶，能够催化反应底物发出可见光，根据酶的反应均一性，可以定量的测定Luciferase基因的表达水平。

Luciferase siRNA，对应序列为：CTTACGCTGAGTACTTCGA，购自上海吉玛制药技术有限公司。

将300ng pGL3质粒(Promega)用Lipofectamine2000转染入HEK293细胞，称为HEK293-pGL3。将100pmol Luciferase siRNA溶解在50μl Opti-MEM中，然后向其中加入60μl的5mg/mL的mPEG-PCL-PPEEA，得到N/P＝50的mPEG-PCL-PPEEA纳米颗粒与siRNA复合物溶液。将溶液在室温下静置20分钟后，加不同体积到已经转染了pGL3质粒6小时的HEK293细胞中，使Luciferase siRNA的终浓度分别为20pmol/孔、50pmol/孔、100pmol/孔、150pmol/孔、200pmol/孔。

以HEK293-pGL3细胞作为对照1(MOCK)；用Lipofectamine 2000转染Luciferase siRNA的复合物转染HEK293-pGL3细胞，作为阳性对照(LuciferasesiRNA的终浓度为20pmol/孔)；用游离的Luciferase siRNA转染HEK293-pGL3细胞，作为对照2(Luciferase siRNA的终浓度为20pmol/孔)。用Veritas MicroplateLuminometer检测处理48小时后荧光素酶的相对表达量，见图13。图13(A)为mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂；图13(B)为mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇。

由图13(A)可见，结果显示当N/P＝50时，随着siRNA剂量的增加，Luciferase表达量降低。mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒转染150pmol siRNA与Lipofectamine2000转染20pmol siRNA相比，细胞内Luciferase的表达量相当。

由图13(B)可见，结果显示当N/P＝50时，mPEG₄₅-PCL₄₅-PPEEA₇纳米颗粒具有与mPEG₄₅-PCL₁₀₀-PPEEA₁₂纳米颗粒相似的转染siRNA的能力，随着siRNA剂量的增加，细胞中Luciferasede表达量降低。

在相同siRNA剂量(pmol/孔)的情况下，用不同N/P比(N/P为50、75、100)制备纳米颗粒与siRNA的复合物，用上述复合物转染HEK293-pGL3细胞，分别以HEK293-pGL3细胞(MOCK)、转染游离的Luciferase siRNA的HEK293-pGL3细胞和用Lipofectamine 2000转染Luciferase siRNA的HEK293-pGL3细胞作为对照，用Veritas Microplate Luminometer分别检测上述不同复合物处理48小时后Luciferase的相对表达量，见图13(C)。

由图可见，随着N/P比的增加，Luciferase的表达量下降。