猪总产仔数性状相关基因MMP3的分离核酸序列

摘要

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的猪总产仔数性状相关基因MMP3的分离核酸序列，所分离核酸序列具有SEQ ID №：1所示的序列，长为1346bp。在所述的核酸序列显示了长度为20bp 1对等位基因特异性的核酸引物，且特异性地杂交，并扩增出含有猪MMP3基因第八外显子、第九外显子和第八内含子的SEQ ID №：1所示序列。本发明的实施应用可以用以检测判断猪总产仔数性状的优劣，并在猪的育种中应用该分子标记进行标记辅助选择，从而弥补猪繁殖性状常规选育的不足，具有重要的实际意义。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的猪的核酸序列，特别是一种猪总产仔数性状相关基因MMP3的分离核酸序列。

背景技术

母猪的总产仔数性状是重要的经济性状，提高母猪的猪总产仔数能给现代养猪生产带来巨大的经济效益。由于猪总产仔数等繁殖性状属于低遗传力的数量性状，常规选择的选育效果不很理想。随着猪分子遗传标记(molecule genetic marker)研究的深入与一些分子实验技术的应用，使某些控制数量性状的主效基因基因型之间的差异清晰地展现在研究者眼前，为选种、选配开创了新的途径。1994年，Rothschild等发现ESR基因是产仔数性状的主效基因或与产仔数主基因紧密连锁的基因，在PvuI酶切位点上将该基因分为AA、BB和AB三种基因型，分析发现BB基因型为产仔数有利基因型，比AA型母猪总胎产仔数和产活仔数分别高出1.40～3.37头和0.63～3.58头。催乳素受体(prolactin receptor，PRLR)基因是一个窝产仔数的候选基因，该基因在维持妊娠中发挥着一定作用，其双等位基因多态性与窝产仔数的差异有关(Vincent等，1998；Southwood等，1999；Drogemuller等，2001)，促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor，EPOR)可调控胎儿红细胞的终端分化和数量(Moritz等，1997)。因此，对促红细胞生成素受体基因中的单核苷酸多态性进行了研究，以确定其同窝产仔数和子宫容量是否有关。分析结果表明，胎儿基因型与窝产仔数显著相关，而母猪的基因型与子宫容量也显著相关(Vallet等，2005)。促红细胞生成素受体与窝产仔数的关系在约克夏杂交猪群、长白猪和杜洛克杂交猪群中都得到证实(Vallet等，2005)。骨桥蛋白(0steopontin，OPN)基因参与了Ca²⁺从母体循环系统向孕体的转移和缓冲，被认为是窝产仔数的候选基因。Van der Steen(1997)等对梅山猪3个合成系的数据进行分析，表明OPN基因型影响总产仔数和产活仔数。备解素因子(properdin，BF)基因位于猪7号染色体7cM处。Buske等(2005)研究表明BF基因在商品猪群中与总产仔数和产活仔数呈显著的正相关，因此BF基因可作为产仔数的候选基因。BF基因是补体系统替代途径中一种血浆蛋白，在增加血管生成中起着重要的作用。

产仔数取决于妊娠过程，胚胎的植入是妊娠过程的第一步，直接影响到胚胎的存活。胚胎的植入需要一类重要的蛋白水解酶，即基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP)，其可以降解多糖以外的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的多种成分，在组织塑型过程中影响着ECM的代谢、新生血管的形成等过程，在胚胎植入、胎盘形成及子宫螺旋动脉重构中发挥重要作用。MMP在滋养层不同类型细胞中的分布存在特异性，在不同时期胎盘中的表达和活性也有所不同，妊娠期MMP的调控直接影响胎盘的发育，对维持正常妊娠至关重要。MMP家族依据蛋白结构的相似性以及降解底物不同分为5个亚类。通过研究，已经发现MMP2和MMP9在在胎盘植入中作用尤为重要，MMP9是胚胎滋养细胞侵入过程的限速酶(李向红等，2007)。到目前为止，MMP家族拥有26位成员，很多成员的功能尚不确定，基质溶解素MMP3便是其一。人的MMP3基因定位在染色体11q22.3位置，长度约7.8kb，包括10个外显子和9个内含子。由于猪MMP3基因与猪总产仔数性状间的关系尚不明确，而研究猪MMP3基因突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究该基因功能的一个非常有力的手段，因此对这个基因进行了多态研究和关联分析，以期能够得到与猪总产仔数性状相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种猪总产仔数性状相关基因MMP3的分离核酸序列。克隆出猪MMP3基因的部分基因组DNA序列，在猪的育种中应用进行辅助选择。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明分离核酸序列具有SEQ ID No：1所示的序列，其中包含猪MMP3基因部分外显子八，部分的外显子九和完整的内含子八的序列；序列表SEQ ID No：1的第816位碱基处有一个碱基突变(816T-816C)，导致TaaI-RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)多态性；第919位碱基处有一个碱基颠倒(919T-919G)，导致DraI-RFLP多态性；第1038位碱基处有一个碱基突变(1038T-1038A)，导致Ksp22I-RFLP多态性，突变均位于第8内含子中。

本发明分离猪MMP3基因第八外显子、第八内含子和第九外显子多态性位点的基因序列，所说的“分离”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增多态性位点的基因序列。通过对猪MMP3基因的突变位点的寻找，发现了3个突变位点，分别是SEQIDNo：1所示序列的第816位存在T→C多态性；第919位存在T→G多态性；第1038位存在T→A的多态性。并通过与猪总产仔数估计育种值的关联分析发现，SEQ ID No：1所示序列的第919位点与猪总产仔数估计育种值存在关联。

在所述的核酸序列显示了长度为20bp1对等位基因特异性的核酸引物，且特异性地杂交，并扩增出含有猪MMP3基因第八外显子、第九外显子和第八内含子的SEQ IDNo：1所示序列。

本发明的实施应用可以用以检测判断猪总产仔数的估计育种值的优劣，并在猪的育种中应用该分子标记进行标记辅助选择，从而克服繁殖性状常规选择的不足，具有重要的实际意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中的实验方法按照常规条件，注明具体条件的实验方法按照注明条件：

下列实施例注明条件具体如下：

在市售的宁乡猪、梅山猪、浦东白猪、美系大白猪和法系大白猪中各自随机挑选2个体，用发明中的引物进行PCR扩增，PCR产物回收后克隆测序；生物学软件对同一引物扩增的序列进行两两比对，发现3个突变位点；

下列实施例很多种技术方法可用于检测本发明中猪MMP3基因的3个所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(并不限于)：DNA测序、杂交测序、限制性酶切片段长度多态性、寡核苷酸阵列(或称DNA芯片)，变性高效液相色谱(DHPLC)等等。

下列实施例采用PCR-RFLP技术检测猪MMP3基因的突变位点，应用SAS(8.02版)的GLM程序进行突变位点与猪总产仔数估计育种值的关联分析。本发明为猪繁殖性状的选育提供了1个新的分子标记，为研究猪MMP3基因的功能奠定基础。

下列实施例用于寻找突变位点的，包括市售的宁乡猪(2头)、美系大白(2头)、梅山猪(2头)、浦东白猪(2头)和法系大白(2头)；用于分析分子标记与猪总产仔数性状关联的试验猪群是法系大白猪(164头)，产仔数资料和系谱资料均由上海市总猪场记录，DNA样品均由本实施例提取，DNA保存于—20℃，所述的DNA样品没有特别限制，对于检测突变位点而言，可以是从耳组织、血液等样品中抽提出的DNA。

下列实施例涉及到的大肠杆菌Dh5α为公开的技术信息，可以通过市售购买，如：购自天根生化科技有限公司。

在上述的基础上，下列实施例采用常规的PCR-RFLP技术检测3个突变位点在法系大白猪试验群体中的分布情况，并且进行标记性状关联分析。

实施例1

猪MMP3的部分基因组DNA序列的获得

(1)引物设计

利用同源性基因克隆原理，采用人MMP3基因cDNA(GenBank收录号：NM_002422)为模版用软件Primer1.0设计引物1对：

PL：5’-CTGGGCTATCAGAGGAAATG-3’

PR：5’-CAGCATCCACTTTTGGTTCA-3’

(2)PCR反应

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μ mol/L，引物终浓度为0.2μ mol/L，2U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 4min，然后循环30次94℃ 30s，56℃30s，72℃ 30s，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)测序

将PCR产物回收后同PMD18-T Vector(TaKaRa)相连接，连接反应总体积是10μl，其中包括5μl solution I，0.5μl的T载体，2.5μl的纯化PCR产物，最后加入2μl灭菌水置4℃水浴过夜。

转化：无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，振荡培养45min，取100μl涂布于琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单个Dh5α大肠杆菌，加入到装有800μlLB液体培养基(加有抗生素)的离心管中振荡培养8小时。

菌落PCR鉴定：以上述步骤中Dh5α大肠杆菌单菌落的LB培养液作为PCR扩增的模板，按照实施例1(1)中的引物及PCR扩增条件进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增条带与实施例1(2)中PCR产物大小相同的菌液测序，序列经拼接后为1346bp。

(3)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechNOlogyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。结果发现所克隆的猪MMP3基因的部分DNA序列与人的MMP3基因有高度同源性，为91％。

实施例2

猪MMP3基因组序列中突变位点的寻找

通过对不同来自不同猪品种的个体DNA的PCR扩增产物进行测序，使用生物分析软件对同一引物扩增的序列进行比对，发现MMP3基因的SEQ ID No：1所示序列的第816位有C和T两种等位基因，第919位处有T和G两种等位基因，第1038位处有A和T两种等位基因。

实施例3

猪MMP3突变位点的检测方法

(1)引物序列(同实施例1)

PL：5’-CTGGGCTATCAGAGGAAATG-3’(序列表SEQ ID No：2)

PR：5’-CAGCATCCACTTTTGGTTCA-3’(序列表SEQ ID No：3)

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μ mol/L，引物终浓度为0.2μ mol/L，2U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3~5μl，限制性内切酶NheI或EcoRV为0.5μl(5U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，酶切8h。

(4)RFLP分型

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型。

TaaI酶切位点(ACN↓GT)，该基因座由两个等位基因控制，T等位基因只有1346bp一个片段，C等位基因有817bp+529bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型TT，TC，CC。

DraI酶切位点(TTT↓AAA)，该基因座由两个等位基因控制，G等位基因只有1346bp一个片段，T等位基因有919bp+427bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型GG，GT，TT。

Ksp22I酶切位点(T↓GATCA)，该基因座由两个等位基因控制，A等位基因只有1346bp一个片段，T等位基因有1038bp+308bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型AA，AT，TT。

实施例4

标记性状关联分析

利用上海市种猪场法系大白猪群试验群体做性状关联分析，164个DNA样品用于基因型检测。

所分析的繁殖性状，用GBS4.0软件计算总产仔数的EBV(估计育种值)，母猪繁殖性能育种值的估计模型如下：

y_ijk＝μ+hys_i+l_j+a_ijk+p_ijk+e_ijk

其中，y_ijk表示第i个场-年-季组、第k头母猪的总产仔数观察值；μ表示总平均数；hys₁表示母猪产仔时第i个场-年-季组固定效应；l_j表示母猪产仔时第j窝的窝效应，服从N分布，I为单位矩阵，为窝效应方差；a_ijk表示第i个场-年-季组、第j窝、第k头母猪的随机遗传效应，服从N分布，A指个体间分子亲缘系数矩阵，为性状的育种值方差；p_ijk表示第i个场-年-季组、第j窝、第k头母猪的永久环境效应，服从N分布，I为单位矩阵，为母猪永久环境效应方差；e_ijk表示第i个场-年-季组、第j窝、第k头母猪的随机剩余效应，服从N分布，I为单位矩阵，为随机误差方差。

考虑所有的多态位点，采用逐步回归中的前进法分析各位点对EBV的影响，构建了如下逐步回归模型：

y_i＝b₀+b₁x_i1+b₂x_i2+…+b_nx_in+e_i

其中，y_i是第i个个体的育种值，b₀为截据，b₁，b₂…b_n为基因型效应，x_i为基因型指示变量。e_i为随机误差，服从N分布。采用SAS(8.02)软件对数据进行统计分析。

在法系大白试验猪群中，按照实施例3所述，对猪MMP3基因的3个位点进行基因型检测。检测结果表明：在法系大白164个个体中，对于TaaI-RFLP多态性位点，CC基因型有29个，CT基因型有91个个体，TT基因型有44个个体；对于DraI-RFLP多态性位点，GG基因型有54个，GT基因型有82个个体，TT基因型有28个个体；对于Ksp22I-RFLP多态性位点，AA基因型有155个，AT基因型有9个个体，TT基因型有0个个体。

继而对猪MMP3基因3个位点进行与总产仔数EBV值的逐步回归分析，发现猪MMP3基因DraI-RFLP多态性对EBV值的影响极显著(P<0.01)，其余位点影响不显著。

表1  猪MMP3基因DraI-RFLP不同基因型与EBV值的关联分析

 

指标GGGTTTEBV值0.1837±0.1154^a0.3688±0.0570^a0.6647±0.0825^b

注：同一行字母不同者表示差异极显著(P<0.01)

由表可见TT基因型对应的EBV值明显高于GG基因型和GT基因型，GG基因型对应的EBV值最低，GT基因型居中；经统计检验，TT基因型个体EBV值与GG、GT基因型个体差异极显著，因此T等位基因为有利基因。

序列表

<110>上海交通大学

<120>猪总产仔数性状相关MMP3的分离核酸序列

<160>3

<210>1

<211>1346

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)...(1346)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(816)

<223>n＝t或c

<220>

<221>mutation

<222>(919)

<223>n＝g或t

<220>

<221>mutation

<222>(1038)

n＝t或a

<221>exon

<222>(1)...(150)

<223>

<220>

<221>intron

<222>(151)...(1257)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(1258)...(1346)

<223>

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(20)

<223>

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(20)

<223>

<400>3