林蛙抗菌肽及制备工艺和在抗病毒药物中的应用

摘要

本发明提供一种林蛙抗菌肽及其制备工艺，还进一步公开了该抗菌肽在制备抗病毒药物中的用途，该肽是一种碱性多肽，分子量范围在2－16KDa之间，等电点为8.9－9.5，由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨大多数酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Val、甲硫氨酸等组成，其中碱性氨基酸占总量的23.99％，酸性氨基酸占总量的19.08％。林蛙抗病毒抗菌肽是从天然资源得到的产物，具有很好的抗病毒能力，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可用于制备抗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病的药物。

说明书

技术领域：

本发明提供一种林蛙抗菌肽，同时还提供了该抗菌肽的制备工艺，本发明还进一步公开了该抗菌肽在制备抗病毒药物中的用途，属于生物化学与生物制药技术领域。

背景技术：

很多两栖类动物在中国属于传统重要和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufogargarizans)、大蹼铃蜍(Bombina maxima)、黑斑蛙(pelophylax nigromaculata)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有光谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。我国对两栖类药物的应用有着悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种林蛙抗菌肽，具有生物活性。

本发明的目的还在于提供一种林蛙抗菌肽的制备方法，适用于工业化生产。

本发明最终公开了在制备抗病毒药物中的应用，特别是该多肽在治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病药物中的应用。

本发明的林蛙抗菌肽，具有以下特征：是一种碱性多肽，分子量范围在2-16KDa之间，等电点为8.9-9.5；氨基酸组成为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Val、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸。其中碱性氨基酸占总量的23.99％，酸性氨基酸占总量的19.08％。

本发明的林蛙抗菌肽的制备方法是：

(1)将林蛙干蛙皮，用pH4.00.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液以料液比为1：8～12(m/v)的比例室温浸泡20～30h；将所得浸提液5000r.p.m离心30min，弃沉淀，留上清；

(2)将上清液煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。

根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12(MW1.3KDa)、胰岛素β链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C(MW13KDa)和胰蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白测定抗菌肽分子量范围。

将抗菌肽酸水解，进行氨基酸组成分析，采用氨基酸测序仪进行测定。

上述林蛙抗菌肽的抗病毒活性采用体外细胞实验法进行，实验结果表明：本发明的林蛙抗菌肽具有显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒及艾滋病病毒，可用于制备治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病治疗的药物。

本发明的积极效果在于：林蛙抗病毒抗菌肽是从天然资源得到的产物，具有很好的抗病毒能力，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可用于制备抗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病的药物。利用我国两栖类动物资源，为制备抗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病药物提供了新的选择。

附图说明：

图1：林蛙抗菌肽分子量分布范围图；

图2：林蛙抗菌肽氨基酸组成分析图。

Tab.1 The molecular weight of standard protein V_o＝41.4ml

根据公式：

$\mathrm{lgM}=a-b\frac{V_e}{V_0}$

式中：M—分子量，KDa；

V_e—洗膜体积，ml；

V₀—外水体积，ml。

以V_e/V₀为横坐标，lgM为纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量。

第一组分：V_e＝59.0ml V_e/V_o＝1.426，lgM＝4.201

根据标准曲线得MW＝15.9KDa

第五组分：Ve＝218.3ml Ve/Vo＝5.272，lgM＝3.302

根据标准曲线得MW＝2KDa

由以上结果可知，此林蛙抗菌肽分子量范围在2-16KDa之间。

Tab.2 The amino acid of antimicrobial peptide

由上表可知，在抗菌肽氨基酸组成中，碱性氨基酸占氨基酸总量的23.99％，酸性氨基酸氨基酸总量的19.08％。

具体实施方法：

下面实施例用来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

(一)林蛙抗菌肽的制备：

(1)称取20g的林蛙干蛙皮，用200ml pH4.0 0.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液浸泡24h。

(2)将所得浸提液5000r.p.m离心30min，弃沉淀，留上清。将上清液煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。于4℃条件下保存备用。

(3)根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12(MW1.3KDa)、胰岛素β链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C(MW13KDa)和胰蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白，与纯化样品混合溶解后上Sephadex G-25柱，测各组分洗脱体积。以Ve/V0为横坐标，lgM为纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量(见附图1)。

(4)林蛙抗菌肽氨其酸组成分析：将抗菌肽酸水解，进行氨基酸组成分析，采用氨基酸自动分析仪进行测定(见附图2)。

(二)林蛙抗菌肽抗病毒实验：

(1)林蛙抗菌肽抗流感病毒的实验

在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，流感病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×10⁴个C8166细胞和200TCID₅₀的流感病毒，每孔的总体积为200vL。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。感染后第二天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数流感病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。

(2)林蛙抗菌肽抗乙型肝炎病毒的实验

在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，乙型肝炎病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×10⁴个C8166细胞和300TCID₅₀的乙肝病毒，每孔的总体积为200vL。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数乙肝病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。

(3)林蛙抗菌肽抗艾滋病病毒的实验

在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，艾滋病病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×10⁴个C8166细胞和200TCID₅₀的艾滋病病毒，每孔的总体积为200vL。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数艾滋病病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。

表1  林蛙抗菌肽抑制流感病毒增殖的作用：

 

IC50(vg/ml)EC50(vg/ml)SI林蛙抗菌肽12.51.67.8

表2  林蛙抗菌肽抑制乙型肝炎病毒增殖的作用：

 

IC50(vg/ml)EC50(vg/ml)SI林蛙抗菌肽11.71.86.5

表3  林蛙抗菌肽抑制艾滋病病毒增殖的作用：

 

IC50(vg/ml)EC50(vg/ml)SI林蛙抗菌肽12.01.96.3

上述实验表明：本发明的林蛙抗菌肽具有显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒及艾滋病病毒，可用于制备治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病治疗的药物。

实施例2：

(一)林蛙抗菌肽的制备：

(1)称取10g的林蛙干蛙皮，用120ml pH4.0 0.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液浸泡30h。

(2)将所得浸提液5000r.p.m离心30min，弃沉淀，留上清。将上清液煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。于4℃条件下保存备用。

(3)根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12(MW1.3KDa)、胰岛素β链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C(MW13KDa)和胰蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白，与纯化样品混合溶解后上Sephadex G-25柱，测各组分洗脱体积。以Ve/V0为横坐标，lgM为纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量(见附图1)。

(4)林蛙抗菌肽氨其酸组成分析：将抗菌肽酸水解，进行氨基酸组成分析，采用氨基酸自动分析仪进行测定(见附图2)。

(二)林蛙抗菌肽抗病毒实验：

(1)林蛙抗菌肽抗流感病毒的实验

在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，流感病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×10⁴个C8166细胞和200TCID₅₀的流感病毒，每孔的总体积为200vL。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。感染后第二天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数流感病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。

(2)林蛙抗菌肽抗乙型肝炎病毒的实验

在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，乙型肝炎病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×10⁴个C8166细胞和300TCID₅₀的乙肝病毒，每孔的总体积为200vL。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数乙肝病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。

(3)林蛙抗菌肽抗艾滋病病毒的实验

在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，艾滋病病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×10⁴个C8166细胞和200TCID₅₀的艾滋病病毒，每孔的总体积为200vL。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数艾滋病病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。

表1  林蛙抗菌肽抑制流感病毒增殖的作用：

 

IC50(vg/ml)EC50(vg/ml)SI林蛙抗菌肽11.91.67.4

表2  林蛙抗菌肽抑制乙型肝炎病毒增殖的作用：

 

IC50(vg/ml)EC50(vg/ml)SI林蛙抗菌肽11.41.96.0

表3 林蛙抗菌肽抑制艾滋病病毒增殖的作用：

 

IC50(vg/ml)EC50(vg/ml)SI林蛙抗菌肽12.11.77.1

上述实验表明：本发明的林蛙抗菌肽具有显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒及艾滋病病毒，可用于制备治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病治疗的药物。