一种叶酸介导的5－氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种由叶酸介导的5－氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物，由以下重量比的组分制成：白蛋白∶5－氟尿嘧啶∶叶酸＝100∶1～10∶1～10。本发明还公开了所述前体药物的制备方法，包括以下步骤：制备叶酸偶联白蛋白；制备5－氟尿嘧啶－1－基乙酸；制备5－氟尿嘧啶－1－基乙酸活性酯；将叶酸白蛋白偶联物溶液加入到5－氟尿嘧啶－1－基乙酸活性酯溶液中，室温搅拌至透析液无吸收即得叶酸介导的5－氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物。本发明还公开了上述前体药物在制备抗癌前体药物纳米粒中的应用。本发明把“靶向概念”、“前体药物概念”、“递送载体概念”三者结合在一起，提供的前体药物大大减少了给药剂量，减少了毒副作用，为抗癌的研究开发提供了新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于抗癌的前体药物，具体地说是一种叶酸介导的5-氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物。

背景技术

长期以来，癌症始终严重威胁着人类的生命。癌症的预防与治疗任务十分艰巨。抗癌新药物及新剂型的研究开发具有重大的社会效益和经济效益。在抗癌药传统药物剂型中，包封率低、易渗漏、稳定性差、毒副作用大以及靶向性差等问题一直是药剂学者致力想要解决的。采用大分子前体药物可望解决这些问题。

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是一种常用的抗癌药物，主要用于治疗各种恶性肿瘤及恶性淋巴瘤转移的患者，疗效确切。但5-Fu的吸收不稳定，一般均静脉给药。由于静脉注入后血中半衰期仅为7.5～10min，消除极快，需静脉持续给药；并且由于5-Fu对机体正常组织和病理部位无选择性，有严重的骨髓抑制和胃肠道反应的毒副作用，这使临床应用受到影响。

近年来，国内外学者开展了许多对5-Fu的新剂型研究工作，包括骨架片、脂质体、复乳、微乳、微球、毫微粒、丝素蛋白膜、控释植入剂、药质体等。但均未解决靶向性或毒副作用，或在新剂型制备中包封率、产品贮存过程中渗漏等存在不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不良反应较小、肝靶向性强的由叶酸介导的5-氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物。

本发明的另一目的是提供上述前体药物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述前体药物的应用。

本发明通过下述技术方案实现上述目的：

一种由叶酸介导的5-氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物，由以下重量比的组分制成：白蛋白:5-氟尿嘧啶:叶酸＝100:1～10:1～10。

本发明由叶酸介导的5-氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物的制备方法包括以下步骤：

(1)制备叶酸偶联白蛋白：将叶酸溶于适量磷酸盐缓冲液(PBS)，加入适量1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化，再加入适量白蛋白，反应1～5h即得；

制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酸：将5-氟尿嘧啶在碱性溶液中溶解，水浴加热50～80℃持续10～30min，加入适量氯乙酸，搅拌2～10h，即得；

(2)制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酸活性酯：将上述制备的5-氟尿嘧啶-1-基乙酸溶于二甲基甲酰胺(DMF)，按摩尔比5-氟尿嘧啶-1-基乙酸：N-羟基琥珀酰亚胺：二环己基碳二亚胺＝0.5～2:1～4:2～6，反应0.5～2h即得；

(3)制备前体药物：将叶酸白蛋白偶联物溶液加入到5-氟尿嘧啶-1-基乙酸活性酯溶液中，室温搅拌至透析液无吸收即得叶酸介导的5-氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物。

上述步骤(1)中所述的碱性溶液为强碱溶液，如氢氧化钾溶液。

本发明还提供了上述前体药物的应用，是将由叶酸介导的5-氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物应用于制备抗癌前体药物纳米粒。

所述的制备抗癌前体药物纳米粒是将叶酸介导的5-氟尿嘧啶白蛋白大分子前体药物溶于碳酸盐缓冲液中，搅拌下加入适量乙醇和戊二醛，室温交联固化，去乙醇，冷冻干燥即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明把“靶向概念”、“前体药物概念”、“递送载体概念”三者结合在一起，利用叶酸受体在大多肿瘤细胞表面都有高度表达，同时在正常细胞的表达又高度保守作为立题科学依据，叶酸作为“导向基团”；将叶酸与大分子“载体”(牛血清白蛋白)连接，然后与药物(5-Fu)连接，组装成一个新的化学实体，最后制备成(PEG修饰)纳米粒。获得的新化学实体(5-氟尿嘧啶大分子前体药物)为药物与“导向基团”以及递送“载体”相连接，药物经过化学修饰，引入递送“载体”和“导向基团”，制备成PEG修饰的纳米粒给药后，通过“导向基团”锁定靶目标，将药物按预期目标聚集于靶组织(靶细胞)，进入细胞后通过降解去除运送“载体”和“导向基团”后，释放出具有活性的药物(5-Fu)，在靶部位积聚，最后只在作用部位释放活性药物，产生疗效，不对别的组织器官产生作用，大大减少给药剂量，减少毒副作用，为抗癌的研究开发提供了新的途径。

附图说明

图1是实施例1的叶酸偶联白蛋白洗脱曲线图。

图2是实施例5中的纳米粒粒径分布图。

图3是实施例5空白白蛋白纳米粒的电镜照片(×60000)。

图4是实施例5载药白蛋白纳米粒电镜照片(×60000)。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

1.1 叶酸偶联白蛋白的合成及其分离

将10mg叶酸溶于500μl pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，搅拌溶解后加入25mgEDC后于磁力搅拌器上搅拌活化5min，再加入150mg牛血清白蛋白的PBS溶液3ml，搅拌下反应2h即得。将反应液过Sephadex G-25柱，收集前段淡黄色有乳光部，为适当稀释后的叶酸偶联白蛋白。通过Sephadex G-25柱分离可清楚看出叶酸偶联的白蛋白在柱最下端，而未反应的叶酸在柱的最上端，说明已经成功分离纯化，最上端仍有未反应的叶酸从侧面反应出白蛋白已完全反应，最下端为已经纯化的叶酸偶联白蛋白，由于叶酸在280和363nm处有两个紫外特征吸收峰，经参考文献后，选在363nm波长处对叶酸偶联白蛋白的洗脱过程进行紫外监测。利用洗脱曲线A-V(ml)确证即得。还可运用蛋白质电泳技术、酶降解方法等作进一步的确认叶酸是否已经成功偶联白蛋白。

1.2 叶酸偶联白蛋白的洗脱曲线

由于叶酸在280和363nm处有两个紫外特征吸收峰，经参考文献后，选在363nm波长处对叶酸偶联白蛋白的洗脱过程进行紫外监测。叶酸偶联白蛋白的洗脱曲线图见图1。

由洗脱曲线图所示，第一个峰对应的是分子量大的叶酸偶联白蛋白，第二个峰对应的是分子量较小的游离叶酸，两者通过葡聚糖凝胶柱效应得到了完全的分离。

1.3 叶酸白蛋白偶联物的紫外扫描分析

①偶联物在叶酸(363nm)和白蛋白(278nm)的吸收峰处产生位移，可见叶酸已经成功偶联白蛋白②为了鉴定叶酸与白蛋白的偶联效果，以蒸馏水为空白，分别对白蛋白(BSA)和偶联物(F-BSA)进行紫外扫描，叶酸(F)扫描光谱以pH7.4的磷酸缓冲液为空白，其中F、BSA和F-BSA三者的浓度分别为20μg/ml，100μg/ml，100μg/ml.通过紫外扫描图谱及吸光度测定表明，在叶酸与白蛋白重叠峰处，相同浓度的BSA和F-BSA吸光度存在明显差异，F-BSA吸光度值明显大于BSA的吸光度值，结果表明叶酸已成功偶联白蛋白。红外图谱显示：BSA在3419.9cm^-1(-COOH伸缩振动最大吸收峰)；1621.1cm^-1(C＝C伸缩振动最大吸收峰)；618.9cm^-1(-C-C伸缩振动最大吸收峰)分别有特征吸收峰，F-BSA在在3383.8cm^-1(-COOH伸缩振动最大吸收峰)；1643.6cm^-1(C＝C伸缩振动最大吸收峰)；1083.9cm^-1(-C-N伸缩振动最大吸收峰)；618.9cm^-1(-C-C伸缩振动最大吸收峰)分别有特征吸收峰。DTA数据显示：BSA在388.7℃有尖锐峰，F-BSA在371.2℃有尖锐峰，进一步补充叶酸成功偶联白蛋白。

1.4 叶酸偶联白蛋白偶联比的计算

①准确称量叶酸2.5mg，用PBS配制成25ml的储备液，然后分别吸取1，2，3，4，5，6ml置于100ml的容量瓶中，用PBS定容，使浓度成1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μg/ml，并分别进行紫外图谱扫描，从紫外图谱上获得叶酸的最大吸收峰处的吸光度A_λmax，结果见表1：

表1  不同浓度的叶酸的吸光度值

根据表1不同浓度叶酸所对应得A_λmax做校正标准曲线，并求得回归方程1为：y＝57.486x+0.0018 R²＝0.997。②准确称量BSA62.5mg，用蒸馏水配制成25ml的储备液，然后分别吸取1，2，3，4，5，6ml置于100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，使浓度成25，50，75，100，125，150μg/ml，并分别进行紫外图谱扫描，从紫外图谱上获得叶酸的最大吸收峰处的吸光度A_λmax，结果见表2：

表2  白蛋白不同浓度下对应的吸光度值

根据表2不同浓度叶酸所对应得A_λmax做校正标准曲线，并求得回归方程2为：y＝0.6697x-0.0089 R²＝0.9888。③将柱层析获得的F-BSA偶联物进行紫外扫描得到A_λmax3中白蛋白的浓度，因为在偶联过程中叶酸过量，加入的白蛋白全部参与反应，根据体积比计算出偶联物中的BSA浓度，将此浓度代入回归方程2得出A_λmax2④按照吸光度的可叠加原理，偶联物的总吸光值为叶酸和白蛋白的叠加吸光值，所以A_λmax1＝A_λmax3-A_λmax2代入回归方程一得出偶联物中叶酸的浓度。⑤偶联比＝(叶酸的浓度÷叶酸的分子量)/(白蛋白的浓度÷白蛋白的分子量)。

偶联物的吸光度值为0.232，根据体积比偶联物中BSA的浓度为114μg/ml，代入上述方程得到白蛋白的吸光度值为0.068，可知叶酸的吸光度值为0.165，代入方程一得偶联物中叶酸的浓度为0.0029，根据上述公式计算偶联比为4，即一个白蛋白分子偶联上4个叶酸分子，根据文献报道，每个蛋白质分子偶联上3个叶酸分子即具有靶向性。

实施例2

2.1  5-氟脲嘧啶-1-基乙酸(5-FUA)的制备

概述：在配有回流冷凝器的三颈烧瓶中，加入一定量的氢氧化钾水溶液，搅拌使其溶解后，加入5-氟尿嘧啶，水浴加热，搅拌一定时间，缓慢滴加含氯乙酸的水溶液，水浴加热，特定温度下搅拌5h，反应过程中用荧光薄层层析硅胶G板检测，待原料点消失后停止反应，冷却至室温，用浓盐酸调节pH，放入冰箱冷藏室中冷却，如有沉淀析出，滤除，再调pH，冷却，过滤，沉淀物用蒸馏水洗涤3次，用水重结晶，烘干得针状晶体，计算产率。同时用紫外、红外光谱等检测。

2.2  5-氟脲嘧啶-1-基乙酸(5-FUA)的制备结果

产物用水重结晶，除掉了未完全反应的5-FU和氯乙酸。产物熔点>270℃，产率为81.98％，紫外检测结果5-FU的紫外最大吸收峰在265nm，而合成的5-氟脲嘧啶-1-基乙酸(5-FUA)的最大吸收峰在273nm，红外数据显示：氟尿嘧啶在3134cm^-1(ν_N-H)、3069cm^-1(ν_C＝C)、3031cm^-1(ν_N-H)、1661cm^-1(ν_C＝O)、1430cm^-1(δ_N-H)、1223cm^-1(δ_C-F)、814cm^-1(δ_C-F)处分别有特征吸收峰，5-氟脲嘧啶-1-基乙酸在3197.8cm^-1(-COOH伸缩振动最大吸收峰)；1741.6cm^-1(C²＝O伸缩振动最大吸收峰)；1669.3cm^-1(C⁴＝0，C＝C伸缩振动最大吸收峰)，1425.3cm^-1(N³-H弯曲振动最大吸收峰)，通过上述紫外及红外图谱的比较可确认5-FUA的生成。

实施例3

3.1  5-氟脲嘧啶-1-基乙酸活性酯的制备

将0.465mg5-氟脲嘧啶-1-基乙酸溶于0.1mlDMF中，按摩尔比为5-氟脲嘧啶-1-基乙酸:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):二环己基碳二亚胺(DCC)＝1:2:4活化60min，活化后的以4000r/min离心15min，取上清，弃沉淀，即得，用薄层色谱监测反应。计算产率。测定熔点。

3.2  5-氟脲嘧啶-1-基乙酸活性酯的制备结果

利用碳二亚胺法(DCC，NHS)制备活性酯，生成的产物用乙醚洗涤纯化，熔点为200-201℃，产率为85.62％。

实施例4

4.1  叶酸白蛋白的偶联物与5-氟脲嘧啶-1-基乙酸活性酯的连接

将叶酸偶联白蛋白溶些许的磷酸缓冲液，完全溶解后慢慢加入到上述制备的5-氟脲嘧啶-1-基乙酸活性酯的DMF溶液中，室温搅拌，将反应液透析，直至透析液在265nm下无吸收，冷冻干燥得目标产物。利用酶降解、蛋白质电泳技术等方法可确定新化合物的生成与否。

4.2  5-FUA活性酯与BSA(BSA-F)的偶联结果

因为5-FUA的紫外吸收在273.5nm处，与BSA(278.5nm)或BSA-F(281.5)的紫外吸收产生重叠，通过紫外很难检验是否反应上。于是通过用胰蛋白酶水解偶联物的方法来检验是否已经反应上。将透析完全的偶联物5-FU-BSA-F(5-FU-BSA)水溶液与胰蛋白酶一起放入透析袋中，一段时间后检测到透析外液中有氟尿嘧啶的存在，即说明已经成功偶联

实施例5

5-Fu前体药物纳米粒制备

将F-BSA-5-Fu溶于不同pH的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，搅拌下加入乙醇和戊二醛适量，室温交联固化，减压浓缩除去乙醇，得纳米粒胶体溶液。最后采用冷冻干燥方法制备纳米粒。利用电子显微镜观察其形态以及粒径。

①药物浓度的考察，结果见表3：

表3  药物浓度考察结果

②pH的考察结果见表4：

表4  pH的考察结果

③交联剂用量的考察见表5

表5  交联剂用量的考察

纳米粒粒径分布图见图2。

未连接5-Fu的叶酸白蛋白偶合物(BSA-F)与连接5-Fu的叶酸白蛋白偶联物(5-FUA-BSA-F)初步摸索制备得到纳米粒。取一定量的纳米粒于吐温水溶液中超声分散后，在透射电镜下拍照，照片见图3、图4，形态圆整，粒径在200nm左右。

实施例6

体内靶向性分布观察

利用不同给药途径，观察5-Fu前体药物对小鼠肿瘤模型(肝癌)靶器官的靶向效率。利用纳米粒包裹荧光素，荧光定量法测定肿瘤实体与不同脏器的纳米粒分布情况，结果见表6和表7：

表6  未连接叶酸的5-Fu-白蛋白化合物的体内分布实验结果(μg，x±s，n＝3)

表6中显示药物为未连接叶酸的5-Fu-白蛋白化合物，在肿瘤实体部位的荧光定量与肺脏等器官相差无几，无显著性差异。

表7  连接叶酸的5-Fu-白蛋白化合物的体内分布实验结果(μg，x±s，n＝3)

表7为连接叶酸的5-Fu-白蛋白-叶酸化合物，腹腔注射给药后，在肿瘤部位荧光定量明显高于其他组织器官(统计学上具有显著性差异)，表明连接叶酸的5-Fu前体药物对肿瘤具有选择性靶向作用。

实施例7

对动物肿瘤模型的药效学观察

将H22肝癌细胞(1×10⁷个/ml)注入小鼠腹腔内，3个星期后处死小白鼠，取其体内腹水，于2000r/min离心2min后，吸取上清，前肢腋窝皮下注入0.02ml，建立小鼠肝癌实体模型，同时给予药物。10天后处死小白鼠，取其肝脏进行定性分析(病理切片)和抑瘤试验，比较不同剂量，不同组别5-Fu前体药物的作用。同时采用阳性对照组、无叶酸连接的前体药物(阴性对照组)等对比观察，结果见表8和表9：

表8  5-氟尿嘧啶前体药物纳米粒对荷瘤小鼠生长和肿瘤的影响

与生理盐水组相比，*P<0.05

动物肝癌肿瘤模型的药效学观察，结果显示连接叶酸的5-Fu前体药物具有明显的抑瘤效果，而未连接叶酸的5-Fu-白蛋白化合物抑瘤效果不显著；采用叶酸先阻断其受体，再给予5-Fu前体药物，抑瘤效果不显著，表明连接叶酸的-Fu前体药物通过叶酸的“导向”作用选择性作用在肿瘤细胞。

表9  5-氟尿嘧啶前体药物纳米粒对脾指数及胸腺指数的影响

与生理盐水组相比，*P<0.05