一种具有神经修复作用的基因，其编码蛋白质，与其相互作用的受体及其应用

摘要

本发明公开了一种具有神经修复作用的基因，该基因编码的蛋白质以及与其相互作用的受体，还公开了它们的应用。本发明的基因为一种脊髓损伤修复相关基因SCIRR 10，它的cDNA序列为690个碱基，其编码的蛋白质有171个氨基酸，含有Cyt－b5结构域，可能是一种分泌型蛋白质。本发明还公开了与上述SCIRR 10基因编码的蛋白质相互作用的受体，其受体为TRHR2，属于G蛋白偶联受体家族。本发明还公开了上述基因、蛋白质及其受体在神经修复中的应用。通过实验证明，本发明的基因编码蛋白SCIRR 10通过受体TRG R2具有强大的促进神经再生的功能，可以用于神经损伤的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有神经修复作用的基因，该基因的编码蛋白质，与该蛋白质相互作用的受体，以及它们在制备神经损伤修复药物中的用途。

背景技术

脊髓损伤后的修复是目前亟待解决的世界性难题。近年来，关于脊髓损伤修复分子机理的研究已经取得了很大进展[1.Bartholdi D，Schwab ME.Expression of pro-inflammatory cytokine and chemokine mRNA upon experimentalspinal cord injury in mouse：an in situ hybridization study.Eur J Neuroscirr.1997；9(7)：1422-1438.2.Nakamura M，Houghtling RA，MacArthur L，et al.Differencesin cytokine gene expression profile between acute and secondary injury in adultrat spinal cord.Exp Neurol.2003；184(1)：313-325.]，这些研究为重新认识脊髓损伤并提供有针对性的干预手段奠定了基础。由于脊髓损伤修复过程涉及相当多的基因，它们之间的相互作用错综复杂，虽然目前对损伤修复分子机理的认识有了较大进步，但脊髓损伤修复的分子机理还远远没有搞清楚[1.Profyris C，Cheema SS，Zang D，et al.Degenerative and regenerative mechanismsgoverning spinal cord injury.Neurobiol Dis.2004；15(3)，415-436.2.Seitz A，AglowE，Heber-Katz E.Recovery from spinal cord injury：a new transection model in theC57B1/6 mouse.J Neuroscirr Res.2002；67(3)，337-345.3.Beattie MS，Hermann GE.，Rogers RC.et al.Cell death in models of spinal cord injury.Prog.Brain Res.2002；137，37-47.]。近年来有些科学家尝试使用NGF进行脊髓损伤的修复，但其效果并不理想，目前尚未发现新的基因用于脊髓损伤修复的报道。

TRHR2是TRH的受体之一，是TRH的第二个结合受体，属于G蛋白偶联受体家族(rhodopsin-like GPCRs)[1.Sun Y，Lu X and M C Gershengorn G(2003)protein-coupled receptor signaling in neuroendocrine system，Thyrotropin-releasing hormone receptors-similarities and differences.Journal ofMolecular Endocrinology 30，87-97.2.O’Dowd BF，Lee DK，Huang W，et al.Gershengorn MC & George SR(2000)TRH-R2 exhibits similar binding and acutesignaling but distinct regulation and anatomic distribution compared with TRH R1.Molecular Endocrinology 14 183-193.3.Heuer H，Schafer MK，Bauer K(1999)Thyrotropin-releasing hormone(TRH)，a signal peptide of the central nervoussystem.Acta Med Austriaca.26(4)：119-22]，TRHR2主要在中枢神经系统中分布[1.Sun Y，Lu X and M C Gershengorn G(2003)protein-coupled receptor signalingin neuroendocrine system，Thyrotropin-releasing hormone receptors-similaritiesand differences.Journal of Molecular Endocrinology 30，87-97.2.0’Dowd BF，Lee DK，Huang W，et al.Gershengorn MC & George SR(2000)TRH-R2 exhibits similarbinding and acute signaling but distinct regulation and anatomic distributioncompared with TRH R1.Molecular Endocrinology 14 183-193.]，因此认为可能参与神经系统功能调节，后来证明TRH R2与认知功能有关联，在脊髓可能和肢体运动相关。[1.Sun Y，Lu X and M C Gershengorn G(2003)protein-coupled receptorsignaling in neuroendocrine system，Thyrotropin-releasing hormonereceptors-similarities and differences.Journal of Molecular Endocrinology 30，87-97.2.O’Dowd BF，Lee DK，Huang W，et al.Gershengorn MC & George SR(2000)TRH-R2 exhibits similar binding and acute signaling but distinct regulation andanatomic distribution compared with TRH R1.Molecular Endocrinology 14 183-193.3.Heuer H，Schafer MK，Bauer K(1999)Thyrotropin-releasing hormone(TRH)，asignal peptide of the central nervous system.Acta Med Austriaca.26(4)：119-22]，目前尚未见到TRH R2与神经损伤修复相关的报道。

发明内容

为了对脊髓损伤进行更为有效的基因治疗，本发明公开了一种基因，该基因为脊髓损伤修复相关(spinal cord injury and regeneration related，SCIRR)第10号基因(SCIRR10)。本发明采用RACE加拼接技术，获得包含全编码框的SCIRR10的cDNA序列为690个碱基，如序列表中序列1所示。SCIRR10基因准确定位于大鼠染色体13q27上(图1)。

本发明还公开了上述基因编码的蛋白质，通过功能结构域分析发现SCIRR10编码171个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。它含有Cytochrome b5-like Heme/Steroid binding domain(Cyt-b5)结构域，这个家族的蛋白包括血红蛋白、类固醇、几丁质合酶结合区和孕烯醇酮受体区，在其N端有一个信号肽及α螺旋穿越跨膜区，N端的信号肽提示SCIRR10编码的可能是一种分泌型蛋白质(图2)。

本发明还公开了与上述基因编码的蛋白质的相互作用受体，该受体为促甲状腺激素释放激素受体TRHR2(thyrotropin releasing hormonereceptor-2)。(Sun Y，Lu X and M C Gershengorn G(2003)protein-coupled receptorsignaling in neuroendocrine system，Thyrotropin-releasing hormonereceptors-similarities and differences.Journal of Molecular Endocrinology 30，87-97.2.O’Dowd BF，Lee DK，Huang W，et al.Gershengorn MC & George SR(2000)TRH-R2 exhibits similar binding and acute signaling but distinct regulation andanatomic distribution compared with TRH R1.Molecular Endocrinology 14 183-193.)

本发明公开的基因和蛋白质可以通过本领域普通的方法进行制备。

本发明还公开了基因SCIRR10及其受体在神经损伤修复中的应用。该应用是通过以下方法进行研究的。

首先研究了SCIRR10在组织中的分布，本发明采用了半定量PCR及原位杂交技术，研究结果表明，SCIRR10 mRNA在成年大鼠组织中的表达较广泛，在大脑、小脑、脑干、脊髓、骨骼肌、心、肝、脾、肾、胃、肺、小肠和大肠都有表达，但在中枢神经系统以及骨骼肌、肾、肺内表达量较高，另外，在雄性大鼠睾丸中也有较高表达(图3)。

原位杂交技术研究SCIRR10mRNA在大鼠中枢神经系统中的分布：在脑中，边缘前区(PL)、扣带前皮质背部(ACAd)、第一躯体运动区(MOp)、第二躯体运动区(MOs)、第一躯体感觉区(SSp)、第二躯体感觉区(SSs)、视觉区(VISC)、味觉区(GU)、鼻周区(PERI)、鼻外区(ECT)、内嗅区外侧部(ENTI)、听觉区(AUD)、颞联合区(TEa)、前嗅核(AON)、嗅球粒细胞层(MOBgr)、嗅球僧帽细胞层(MOBmi)、室管膜下区(SEZ)、内侧缰核(MH)、丘脑菱形核(RH)、丘脑前背侧核(AD)、丘脑室旁核(PVT)、下丘脑室旁核后外侧大细胞部分(PVHpml)、下丘脑腹内侧核背内侧部(VMHdm)、下丘脑腹内侧核腹外侧部(VMHvl)、下丘背核(ICd)、下丘外核(ICe)、下丘脑室周核后部(PVp)、中央管周围灰质(PAG)、动眼神经核(III)、黑质(SN)、脚间核(IPN)、浦肯野细胞、绒球(FL)、脑桥灰质被盖网状核(TRN)、蓝斑(LC)、上橄榄核内侧部(SOCm)、三叉神经运动核大细胞部分(Vma)、脑桥网状核尾侧部(PRNc)、前庭上核(SUV)、蜗腹侧核前部(VCOa)、膝上核(SG)、斜方体核(NTB)、巨细胞网状核(GRN)、蜗背侧核(DCO)、齿状核(DN)、间核主体(IPm)、顶核(FN)、三叉神经脊束核头部(SPVO)、旁巨细胞网状核外侧部(PGRNI)、大细胞网状核(MARN)、小脑下脚(icp)、三叉神经脊纤维束(sptV)、三叉神经脊束核中部(SPVI)、副三叉神经核(PAT)、楔束核(CU)、疑核(AMB)、外侧网状核巨细胞部(LRNm)、巨细胞网状核(GRN)、独束核中部(NTSm)、迷走神经背运动核(DMX)、舌下核(XII)、橄榄下复合体(IO)、三叉神经脊束核尾部(SPVC)、薄束核主体(GR)、最后区(AP)、橄榄下核中副橄榄(IOma)(图4)；在脊髓，可见该基因广泛表达于脊髓灰质中，但其中颈段以第一层和第九层为多，胸段从T3开始以中间外侧细胞柱(IML)、第一层和第八、九层为多，腰段L1、L2、L3和L6以第一层和第九层为多，腰段L4，所有分层均多，L5以第一层、第七层和第九层为多。因此纵观所检测的代表性切面，该基因在脊髓胸段T3至腰段L5灰质中的表达最为广泛和显著，此外，该基因在后角区域的表达多集中于各分层的外侧边缘，即后角外侧轮廓区域(图5)。

本发明研究了SCIRR10与脊髓损伤、修复的关系：通过RT-PCR检测SCIRR10 mRNA在脊髓损伤前后的变化趋势表明：SCIRR10 mRNA在损伤1天后表达量就有所增加，从损伤后第3天表达量开始增加，直至在损伤第5天的表达量仍处于较高水平(图6)。Western blot结果显示：大鼠脊髓全横断后，SCIRR10蛋白在正常脊髓中的表达量较低，而在脊髓损伤3天后表达量就有所增加，提示该蛋白可能参与大鼠脊髓损伤后的修复过程(图6)。

本发明还进行了SCIRR10相互作用蛋白的筛选和证实：先构建SCIRR10原核表达载体，在大肠杆菌进行原核表达，用Pull down技术(chelateProFound pull-down PolyHis Protein-Protein Interaction Kit；Pierce)从损伤的大鼠脊髓提取液中钓取SCIRR10作用蛋白，质谱技术鉴定发现thyrotropin releasing hormone receptor-2(TRHR2)可特异性与SCIRR10结合。

然后构建TRH R2-RFP、SCIRR10-GFP表达载体，分别转染细胞进行培养，将含SCIRR10-GFP细胞的培养液加入到含TRH R2-RFP细胞继续培养，激光共聚焦显微镜观察。结果显示红色荧光蛋白标记的TRH R2受体可以在所转染细胞膜区域表达，而转染SCIRR10-GFP的细胞有弱绿色荧光标记，将含SCIRR10-GFP细胞的培养液加入到含TRH R2-RFP细胞后，可见含TRH R2-RFP细胞除红色荧光标记外，还有绿色荧光蛋白标记，而且两种荧光在同一细胞内标记区域和形态相同，说明TRH R2-RFP和SCIRR10-GFP发生了相互作用，预先使用TRH孵育TRH R2-RFP细胞，再加入含SCIRR10-GFP细胞的培养液，绿色荧光明显减弱，说明TRH占据了部分TRH R2受体，导致SCIRR10与TRHR2受体结合量下降，间接证实了SCIRR10确与TRH R2相互作用。

SCIRR10蛋白可能是一种分泌型具有营养活性的蛋白，它在体内合成后一方面可能通过CPE的协助被运至细胞外；另一方面，SCIRR10蛋白可能在其N端信号肽引导下被分泌至细胞外。但是，它在体内是如何发挥其生物功能的呢？经酵母双杂交筛选得到TRHR2能与SCIRR10发生相互作用，我们可以推测，SCIRR10被分泌到胞外后可能是通过TRH R2介导发挥生物活性的，至于其详细的作用机制仍需进一步的实验探讨。

本发明进行了信号转导研究：首先构建含SCIRR10的真核表达载体，转染细胞，收集上清夜并纯化后测定蛋白浓度。

TRH R2信号转导途径之一-MAPK。从大鼠皮层分离神经元进行培养，然后加入纯化的SCIRR10蛋白培养，对照组采用合成的TRH，阻断实验采用百日咳毒素和U0126，结果发现微量的SCIRR10即可使ERK磷酸化，该磷酸化过程可被PTX和U0126阻断或者抑制。

TRH R2信号转导途径之二-磷酸酯酶C。因为TRH R2活化磷酸酯酶C，可刺激4，5-phosphatidyl inosital biphosphate(PIP2)水解，进而产生inositol 1，4，5-triphosphosphate(InsP3)and 1，2-diacylglycerol(DAG)，用同位素标记，研究inositol phosphates(IPs)的浓度，来决定磷酸酯酶C活化情况。结果表明，像TRH一样，SCIRR10可以明确活化磷酸酯酶C信号通路(P<0.05)，SCIRR10和TRH的这种活化磷酸酯酶C信号通路可以分别被PTX和U73122抑制。

本发明进行了SCIRR10促进大鼠皮层和脊髓组织块长出神经纤维突的研究：将新生大鼠皮层和脊髓分离，分别用DMEM与不同浓度的SCIRR10、PTX、TRH和BDNF进行培养，计数组织块神经突的长度和密度，统计学处理。结果证明，对脊髓和皮层组织块，痕量的SCIRR10体外可明显促进原代皮层神经元的存活；SCIRR10具有强大的促进皮层和脊髓组织块神经再生作用，0.2ng的SCIRR10促进皮层组织块神经纤维再生作用远远大于20ng的NGF，SCIRR10促进新生动物脊髓组织块神经再生作用也远远大于等剂量的BDNF，SCIRR10这种强大的促进神经再生作用可以被PTX阻断，作用于相同受体的TRH则没有明确促进神经突生长的作用。

本发明进行了SCIRR10促进横断的大鼠坐骨神经再生的研究：将动物坐骨神经完全横断，于原位缝合两断端，在脊髓腰膨大处注射含SCIRR10表达质粒的细胞，以含空质粒的细胞作为对照。结果发现SCIRR10在体也具有明确的促进神经再生作用。

通过以上实验，本发明发现并证实SCIRRI0与脊髓损伤、修复关系密切：脊髓损伤后SCIRR10 mRNA和蛋白明显高调；SCIRR10可以与TRH R2相互作用，进一步证实TRH R2是SCIRR10的作用受体；SCIRR10通过TRH R2受体活化ERK-MAPK和磷酸酯酶C信号途径；SCIRR10是一个新型神经营养因子，促进皮质组织块神经突生长作用远远大于50倍剂量的NGF作用；SCIRR10促进培养脊髓组织块神经突生长作用远远大于相同剂量的BDNF作用；SCIRR10促进脊髓和皮质组织块神经突生长是通过TRH R2受体，合成的TRH没有神经营养作用；SCIRR10在动物体内也具有强大的神经营养作用，可明显加快完全横断的坐骨神经再生。

SCIRR10可能成为治疗神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经系统退行性变疾患模型动物的有效药物；根据SCIRR10结构，以及作用配体TRHR2，构建SCIRR10稳定表达细胞株和治疗病毒载体，可以用于神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经系统退行性变疾患模型动物的治疗；根据SCIRR10结构，以及作用配体TRH R2，设计相应的多肽，可以用于发展成为神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经系统退行性变疾患模型动物的治疗药物；可以根据SCIRR10结构，以及作用配体TRH R2，设计相应的化合物，用于发展成为神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经系统退行性变疾患模型动物的治疗药物；可以基于TRH R2受体结构，筛选、设计相应的结合配体，用于发展成神经损伤、老年痴呆、巴金森氏病等神经系统退行性变疾患的治疗药物。

附图说明

图1.本发明的基因SCIRR10定位于大鼠13号染色体图示。

图2.SCIRR10编码蛋白的结构分析图。

图3.SCIRR10 mRNA在成年大鼠多种组织中RT-PCR结果。

图4.低倍图展示SCIRR10 mRNA在脑组织中的表达，方框中的部分放大于图5。A，前嗅核(AON)，嗅球粒细胞层(MOBgr)，嗅球僧帽细胞层(MOBmi)，室管膜下区(SEZ)；B，梨状区(PIR)，味觉皮质(GU)，无粒岛皮质背侧区(Ald)，第一躯体运动区(MOp)，第二躯体运动区(MOs)，扣带前皮质背部(ACAd)，边缘前区(PL)；C，嗅结节(OT)，第一躯体感觉区(SSp)，灰被(IG)；D，视皮层(VISC)，第二躯体感觉区(SSs)，腹外侧视前核(VLP)，前腹侧视前核(AVP)，视上核(SO)，视前视交叉上核(PSCH)；E，丘脑菱形核(RH)，下丘脑室旁核后外侧大细胞部分(PVHpml)；F，内嗅区外侧部(ENTI)，鼻周区(PERI)，鼻外区(ECT)，颞联合区(TEa)，皮层听区(AUD)，杏仁侧核(LA)，杏仁基侧核后部(BLAP)，杏仁后核(PA)，海马CA1区锥体层(CA1sp)，海马CA2区角(CA2)，海马CA3区锥体层(CA3sp)，齿状回嵴(DGcr)，内侧缰核(MH)，丘脑室旁核(PVT)；G，中央管周围灰质(PAG)，内侧膝状体(MG)；I，下丘背核(ICd)，中央管周围灰质背侧区(PAGd)，脑桥被盖核背侧部(DTgC)，被盖核背外侧部(LDTg)，三叉神经脑桥核(Pr5)，斜方体(Tz)。Bar＝1mm

图5.SCIRR10 mRNA在脑干和脊髓中的分布，其中

A，三叉神经感觉主核(PSV)，橄榄上复合体(SOC)；B，蓝斑(LC)；C，绒球(FL)，蜗腹侧核前部(VCOa)，膝上核(SG)；D，小脑下脚(icp)，外侧网状核巨细胞部(LRNm)，迷走神经背运动核(DMX)，橄榄下复合体(IO)；E，楔束核(CU)

图6.损伤后不同时间，大鼠脊髓组织内SCIRR10mRNA(A)和蛋白(B)的变化，其条带灰度值之比用直方图表示(B和D)。

图7.左上图显示Pull down技术结合的蛋白条带，考马氏亮蓝染色标记。各个泳道分别是1.蛋白marker，2.纯化SCIRR10蛋白流出液，3.脊髓组织蛋白，4.5.6.分别为不同时相流出液。7.8.阴性对照流出液：箭头指示的是差异条带。左下图为MALDI-TOS鉴定的肽质量指纹图。右图是根据肽质量指纹图在数据库搜索结果。

图8.a1为转染SCIRR10-RFP质粒的COS7细胞，a2为转染SCIRR10-GFP质粒的COS 7细胞培养液孵育后，同一个细胞也被绿色荧光标记。A3为a1和a2的合并图。当加入TRH预先孵育转染SCIRR10-RFP质粒的COS7细胞(b1)后，再用转染SCIRR10-GFP质粒的COS7细胞培养液孵育，发现绿色荧光蛋白标记减弱(b2，b3)。

图9.信号转导发现SCIRR10可以活化MAPK-ERK1，MAPK-ERK2，PTX和U126可部分阻断SCIRR10对MAPK-ERK的磷酸化(上图)。下图为磷酸化的ERK1/2和未磷酸化的ERK1/2比值统计图。

图10.闪烁计数器测得的不同组别和不同时间放射活性的直方图表示，SCIRR10可以活化磷酸酯酶C，PTX和U73122可部分阻断SCIRR10对磷酸酯酶C的磷酸化。

图11.重组的SCIRR10对大鼠脊髓组织块神经突生长的影响。a.DMEMb.DMEM+SCIRR10，c.DMEM+SCIRR10+PTX，d.DMEM+TRH，e.DMEM+TRH+PTX，f.DMEM+BDNF1(0.000296nM)，g.DMEM+BDNF2(0.0296nM)

图12.重组的SCIRR10(全长)可促进大鼠脊髓组织块长出神经纤维。

图13.SCIRR10对大鼠皮层组织块神经纤维数量和长度的影响。

图14.转染pcDNA3.1-Scirr10的COS 7细胞中SCIRR10的表达。

图15.大鼠坐骨神经完全横断，然后连接两断端，在脊髓腰膨大注射转染pcDNA3.1-Scirr10的COS 7细胞，7天后坐骨神经内(a，b1-b6)不同节段内NF-160阳性神经纤维的数量，即使在远离连接处16mm，仍然有NF-160阳性神经纤维(b6，箭头)；c1-c5为对照，大鼠脊髓腰膨大处仅注射转染pcDNA3.1的COS 7细胞，在10mm节段，仅能看到单个神经纤维末梢(c4，箭头)

图16.直方图示两组动物不同节段坐骨神经内NF-160阳性神经纤维数量之比较。

具体实施方式

实施例一 SCIRR10基因的获得与命名

首先建立大鼠脊髓原代神经元损伤模型，通过改良的锚定消减杂交技术构建大鼠脊髓原代神经元损伤后4.5天的cDNA消减文库，然后随机挑取文库中的110个克隆进行酶切鉴定和测序，分析结果显示这些克隆代表了51个ESTs，进一步通过反向点杂交剔除假阳性克隆和重复序列，最终得到31个差异ESTs，其中24个代表已知基因，其余7个代表新基因[Li Xin，Que Haiping，Ma Zhenlian，et al.(2005)Rat spinal cord primary neuron injury-regeneration-related genescloned by improved subtractive hybridization.Medical journal of Chinesepeople’s librarytion army.30(12)：1072-1075；Ma Z，Liu T，Li X，et al.(2006)Identification of up-regulated genes after complete spinal cord transection inadult rats.Cell.Mol.Neurobiol 26(3)：277-288]，部分基因在国际数据库登录，其中SCIRR10登录号为：GeneBank accession #AY623793。此后，日本学者也对SCIRR10进行研究，并重新命名为Neudesin，他们发现SCIRR10对细胞分化有一定作用[Kimura I，Yoshioka M，Konishi M，et al.(2005)Neudesin，a novelsecreted protein with a unique primary structure and neurotrophic activity.JNeurosci Res.，79(3)：287-294；Kimura I，Konishi M，Miyake A，Fujimoto M，ItohN.(2006)Neudesin，a secreted factor，promotes neural cell proliferation andneuronal differentiation in mouse neural precursor cells.J Neurosci Res.83：1415-24.]。

SCIRR10基因是中从大鼠脊髓原代神经元损伤文库中筛选到的并被证明与脊髓损伤和修复相关的基因，故命名为脊髓损伤和修复相关基因之一，因其克隆序号为10的得名。本发明公开的SCIRR10基因，可以通过本领域已知的常用方法例如化学合成等方法进行制备。

实施例二 SCIRR10相互作用蛋白的筛选和证实

先构建SCIRR10原核表达载体pET32a-Scirr10，转化E.coli，实现SCIRR10在大肠杆菌表达，进一步用Ni螯合柱纯化SCIRR10，用Pull down技术从损伤的大鼠脊髓提取液中钓取SCIRR10作用蛋白，质谱技术鉴定发现TRHR2可特异性与SCIRR10结合(图7)。

接着，构建了TRH R2-RFP、SCIRR10-GFP表达载体，分别转染COS 7细胞，培养16个小时后，将COS 7-SCIRR10-GFP的培养液加入到COS 7-TRHR2-RFP细胞继续培养4个小时，对照组采用在COS 7-TRH R2-RFP细胞中提前加入合成的过量TRH(10μM)，然后再加入COS 7-SCIRR10-GFP的培养液，同样培养4个小时后，激光共聚焦显微镜观察。结果发现分别转染TRH R2-RFP、SCIRR10-GFP表达载体的COS细胞中，红色荧光蛋白标记的TRH R2受体可以在COS 7细胞膜区域表达，而转染SCIRR10-GFP的COS 7细胞有弱绿色荧光标记，将COS 7-SCIRR10-GFP的培养液加入到TRH R2-RFP-COS 7细胞后，可见TRH R2-RFP-COS 7除红色荧光标记外，还有绿色荧光蛋白标记，而且两种荧光在同一细胞内标记区域和形态相同，说明TRH R2-RFP和SCIRR10-GFP发生了相互作用。在提前用TRH孵育的实验中，COS 7细胞中的红色荧光标记不受影响，绿色荧光大大减弱，说明TRH占据了部分TRH R2受体，导致SCIRR10与TRH R2受体结合力下降，间接证实了SCIRR10确与TRH R2相互作用(图8)。

实施例三 信号转导研究

构建pcDNA3.1-Scirr10真核表达载体，转染COS 7细胞，收集上清夜，用亲和柱(GE Healthcare Company，HisTrap FF 17-5319-01)纯化His-taggedC-terminal SCIRR10蛋白，并测定纯化后的蛋白浓度。

TRH R2信号转导途径之一-MAPK

从大鼠皮层分离神经元进行培养，然后加入纯化的His-taggedC-terminal SCIRR10蛋白(0.0000525nM)培养10分钟，对照组采用200nM的合成的TRH，阻断实验采用250ng/ml百日咳毒素(PTX，Sigma)和U0126，Western Blot技术检查ERK1/2磷酸化。结果发现微量的SCIRR10即可使ERK磷酸化，该磷酸化过程可被PTX和U0126阻断或者抑制(图9)。

TRH R2信号转导途径之二-磷酸酯酶C

原代培养的皮层神经元在含有myo-[³H]inositol(2μCi/ml)的DMEM中培养24小时，再加入10mM LiCl，继续培养30分钟，接着加入His-taggedC-terminal SCIRR10蛋白(0.0000525nM)，分别培养5、10、30、60分钟，使用合成的TRH作为对照，阻断实验采用PTX和U73122(10μM；Sigma)提前培养2小时，放射活性用闪烁计数器(wallac 1450 MicroBeta TriLux，Perkin Elmer)测量，数据用T检验分析，结果表明，像TRH一样，SCIRR10可以明确活化磷酸酯酶C信号通路(P<0.05)，SCIRR10和TRH的这种活化磷酸酯酶C信号通路可以分别被PTX和U73122抑制(表1，图10)。

表1.闪烁计数器测得的不同组别和不同时间的放射活性

 

timenSCIRR10SCIRR10+U73122TRHTRH+U731220551.6±2.993344.4±3.763052±1.414242±3.63325min556±4.980054.4±5.741156.8±5.314144±2.449510min554.4±10.665847.6±3.059450±6.957046±4.289530min551.75±5.632944±1.264948.8±4.673348±6.35611h550.8±5.817242.4±4.791751.6±5.706139.2±4.3635

实施例四 SCIRR10促进大鼠皮层和脊髓组织块长出神经纤维突

将新生大鼠皮层和脊髓分离，剪成0.8mm见方的组织块，种植于培养皿上，分别用DMEM(皮层和脊髓)、DMEM+SCIRR10(0.000183nM，脊髓和0.0012nM，皮层)、DMEM+PTX(250ng/ml)+SCIRR10(皮层和脊髓)、DMEM+TRH(0.4nM，皮层和脊髓)、DMEM+PTX+TRH(皮层和脊髓)、DMEM+BDNF(0.000296nM，脊髓)、DMEM+BDNF(0.0296nM，脊髓)或者DMEM+NGF(0.078nM，皮层)培养，分别在16(脊髓)和12(皮层)小时后，计数组织块神经突的长度和密度，统计学处理。结果证明，无论是脊髓(图11，表2，图12)还是皮层(表3，图1)组织块，痕量的SCIRR10体外可明显促进原代皮层神经元的存活；SCIRR10具有强大的促进皮层和脊髓组织块神经再生作用，0.2ng的SCIRR10促进皮层组织块神经纤维再生作用远远大于20ng的NGF，SCIRR10促进新生动物脊髓组织块神经再生作用也远远大于等剂量的BDNF，SCIRR10这种强大的促进神经再生作用可以被PTX阻断，作用于相同受体的TRH则没有明确促进神经突生长的作用。

表2.SCIRR10对大鼠脊髓组织块神经突数量和长度的影响

表3.SCIRR10对大鼠皮层组织块神经纤维数量和长度的影响

实施例五 SCIRR10促进横断的大鼠坐骨神经再生

先用pcDNA3.1-Scirr10转染COS 7细胞，检测并确认转染后的COS 7细胞表达SCIRR10的情况(图14)，将成年大鼠坐骨神经完全横断后，与原位缝合两断端在脊髓腰膨大处注射pcDNA3.1-Scirr10转染的COS 7细胞，动物存活7天后，灌注固定，NF-160免疫标记横断远侧端的坐骨神经，于坐骨神经横断点远侧不同节段的NF-160免疫阳性神经纤维计数，统计学处理，以空pcDNA3.1载体作为对照。

结果发现，距离横段点4mm处，两组的神经纤维数量几乎没有差别，随着距离增加，对照组神经纤维数量明显减少，统计学差异明显(P<0.05)，并且随着距离增加，两组神经纤维数量差距越明显(p<0.005或者0.0001)，到12mm处，对照组的NF-160阳性神经纤维消失，而在pcDNA3.1-Scirr10组，于16mm处仍可以看到NF-160阳性神经纤维(图15，图16)，结果说明SCIRR10在体也具有明确的促进神经再生作用。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120>一种具有神经修复作用的基因，其编码蛋白质，与其相互作用的受体及其应

     用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>690

<212>DNA

<213>

<400>1

<210>2

<211>171

<212>PRT

<213>

<400>2