一种发酵脱毒棉籽粕饲料蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种发酵脱毒棉籽粕饲料蛋白的制备方法。本发明涉及以棉籽粕为原料，利用微生物技术转化生产脱毒棉籽粕饲料蛋白的一种生产工艺，尤其涉及一种多菌种混合固体发酵制备脱毒棉籽粕的微生物发酵工艺。将扩大培养好的啤酒酵母菌(Saccharomyces crevisiae)1株、热带假丝酵母(Candida tropicalis)1株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1株以及乳酸菌(Lactobacillus)1株的发酵培养液按2∶1∶1∶1比例混合均匀，以5％的接种量接种到含水量为50％的棉籽粕(过40目筛)中，同时加入底物培养基(糖蜜5％，麸皮5％，硫酸铵0.5％，初始pH值为6.0)并混合均匀，于30℃温度下需氧发酵72小时，然后于60℃下干燥制样，最后对发酵前后棉籽粕进行营养成分分析；发酵棉籽粕成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6个月；发酵后的棉籽粕即可作为肉牛、鸡、罗非鱼等的饲料。

说明书

技术领域

本发明涉及以棉籽粕为原料，利用微生物技术转化生产脱毒棉籽粕饲料蛋白的一种生产工艺，尤其涉及一种多菌种混合固体发酵制备脱毒棉籽粕的微生物发酵工艺。

背景技术

近年来，我国畜牧业和饲料工业发展十分迅速，饲料资源紧缺的矛盾日益突出。据专家预测，2010～2020年，我国蛋白质饲料的差额为2400～4800万吨，饼粕类差额为2560万吨。长期以来，我国主要依赖的蛋白饲料原料豆粕，因受产量、气候、国内外市场价格波动等多种因素的影响，供应日趋紧张，价格不定期上涨及波动，对饲料企业成本影响较大。而现有的一些农副产品虽然其数量丰富且价格廉价，因含有抗营养因子或受限于传统加工工艺，限制了其有效利用。针对这些问题，国内外有关研究人员开展了很多方面关于蛋白质饲料的开发研究，其中有关棉籽粕的有效利用就是研究重点之一。

棉籽粕是我国除豆粕(饼)之外的另一种重要的饼粕类蛋白质饲料，但因含有对动物有毒害的游离棉酚及一些抗营养因子，其利用价值和使用量受到极大限制，为了扩大其应用范围，必须先进行脱毒处理以提高应用营养价值。目前棉籽粕的主要脱毒方法有物理法、化学法以及生物法。物理法和化学脱毒法虽可显著降低棉籽饼粕中游离棉酚含量，但都存在一定的缺点。用化学制剂、有机溶剂处理后残留的物质和色泽问题往往降低了棉籽饼粕的饲用价值。生物法包括酶解法和微生物发酵法，而酶解法脱毒效果不理想。微生物发酵法是20世纪80年代后期在中国首先发展起来的一种新的棉籽饼粕脱毒途径。此种方法不仅脱毒效果好，避免化学添加剂和物理法对棉籽蛋白功能性质的影响，还会改善适口性，增加蛋白质含量；微生物发酵产生的各种消化酶、氨基酸、维生素等也大大提高了棉籽饼粕的营养价值。因此，经微生物发酵处理后的棉籽粕，不仅可作为反刍动物和水产动物饲料，而且还可以部分代替畜禽日粮中的豆粕、鱼粉等蛋白质饲料，或与其它饼粕类饲料配合使用，既使用安全，又可降低成本，提高经济效益，具有很好的发展潜力。

本发明技术主要针对上述棉籽粕脱毒的关键问题，通过系统研究多菌种混合固体发酵的发酵工艺参数，最终获得了一种制备脱毒棉籽粕饲料蛋白的微生物发酵方法，这对于提高棉籽粕微生物发酵脱毒率及棉籽粕蛋白在畜牧业上的有效利用等方面均具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵脱毒棉籽粕饲料蛋白的制备方法，进一步促进棉籽饼粕在畜牧业上的有效利用，使其成为解决我国目前蛋白质饲料资源短缺的途径之一。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的一种发酵脱毒棉籽粕饲料蛋白的制备方法，其步骤为：

a.从原始出发菌种枯草杆菌属细菌和酵母菌属真菌中挑取一环菌体，分别接种到LB种子培养基和麦芽汁种子培养基中，于30℃-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养16-24小时后，直到OD₆₀₀＝0.7-0.9，停止培养，作为种子液。从原始出发菌种乳酸菌属细菌中挑取一环菌体，接种到乳酸菌属培养基中，于30℃-35℃温度下静止培养40-48小时，作为种子液。

b.在液体扩大LB培养基(枯草杆菌属细菌)和麦芽汁培养基(酵母菌属真菌)中以1—5％接种量接种种子液，于30℃-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养20—28小时。在液体扩大乳酸菌属培养基(乳酸菌属细菌)中以1—5％接种量接种种子液，于30℃-35℃温度下静止培养48小时。将啤酒酵母菌、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌的各种菌株发酵培养液按2：1：1：1比例混合均匀，作为棉籽粕发酵菌种液。

c.将b中棉籽粕发酵菌种液以5％的接种量接种到含水量为50％的棉籽粕(过40目筛)中，同时加入底物培养基(糖蜜5％，麸皮5％，硫酸铵0.5％，初始pH值为6.0)并混合均匀，于30℃温度下需氧发酵72小时，然后于60℃下干燥制样，最后对发酵前后棉籽粕进行营养成分分析。

d.发酵棉籽粕成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6个月。

e.发酵后的棉籽粕即可作为肉牛、鸡、罗非鱼等的饲料。

本发明步骤a中所述的菌种种子LB培养基按重量百分比含有0.3％—0.5％的氯化钠、0.3％—0.5％的蛋白胨和0.5％—1.0％酵母膏，乳酸菌属培养基含有0.2％-0.4％的胰蛋白胨、0.3％-0.5％的NaCl、0.2％-0.4％的葡萄糖、0.3％的KH₂PO₄、0.3％的K₂HPO₄、0.02％的MgCl₂、0.005％的CaSO₄和0.2％的淀粉，麦芽汁培养基含有10％的麦芽膏粉和0.01％的氯霉素。

本发明步骤a中所述的菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1株、乳酸菌(Lactobacillus)1株、啤酒酵母菌(Saccharomyces crevisiae)1株以及热带假丝酵母(Candida tropicalis)1株。

本发明步骤b中所述的三种液体扩大培养基的配方与步骤a相同。

本发明具有以下有益效果：本发明采用微生物发酵处理棉籽粕不仅脱毒效果好，避免了化学添加剂和物理法对棉籽蛋白功能性质的影响，还会改善适口性，增加蛋白质含量；发酵过程产生的各种消化酶、氨基酸、维生素等也大大提高了棉籽粕的营养价值。因此，经微生物发酵处理后的棉籽饼粕，即使在畜禽日粮中也可部分代替豆粕、鱼粉等蛋白质饲料，或与其它饼粕类饲料配合使用，既使用安全，又可降低成本，提高经济效益，具有很好的发展潜力。

具体实施方式

本发明提供的一种发酵脱毒棉籽粕饲料蛋白的制备方法的实施例如下：

本实施例所用的菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1株、乳酸菌(Lactobacillus)1株、啤酒酵母菌(Saccharomyces crevisiae)1株以及热带假丝酵母(Candida tropicalis)1株。其具体步骤为：

a.由5克蛋白胨、5克酵母膏、3克氯化钠和1升水(pH7.0)组成的LB液体培养基，倒入无菌三角瓶中，制成枯草芽孢杆菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由2克蛋白胨、5克NaCl、2克葡萄糖、3克KH₂PO₄、3克K₂HPO₄、0.2克MgCl₂、0.05克CaSO₄、2克淀粉和1升水(pH6.5)组成的乳酸菌属培养基，，倒入无菌三角瓶中，制成乳酸菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由100克麦芽膏粉、0.01克氯霉素和1升水(pH6.0)组成的麦芽汁培养基，倒入无菌三角瓶中，制成酵母菌种子液体培养基和液体扩大培养基。

b.从原始出发菌种枯草杆菌属细菌和酵母菌属真菌中挑取一环菌体，分别接种到LB种子培养基和麦芽汁种子培养基中，于30℃-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养16-24小时后，直到OD₆₀₀＝0.7-0.9，停止培养，作为种子液。从原始出发菌种乳酸菌属细菌中挑取一环菌体，接种到乳酸菌属培养基中，于30℃-35℃温度下静止培养40-48小时，作为种子液。

c.在液体扩大LB培养基(枯草杆菌属细菌)和麦芽汁培养基(酵母菌属真菌)中以1—5％接种量接种种子液，于30℃-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养20—28小时。在液体扩大乳酸菌属培养基(乳酸菌属细菌)中以1—5％接种量接种种子液，于30℃-35℃温度下静止培养48小时。将啤酒酵母菌、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌的菌株发酵培养液按2：1：1：1比例混合均匀，作为棉籽粕发酵菌种液。

d.将棉籽粕发酵菌种液以5％的接种量接种到含水量为50％的棉籽粕(过40目筛)中，同时加入底物培养基(糖蜜5％，麸皮5％，硫酸铵0.5％，初始pH值为6.0)并混合均匀，于30℃温度下需氧发酵72小时，然后于60℃下干燥制样。

e.对发酵前后棉籽粕进行营养成分分析。

f.发酵棉籽粕成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6个月。

g.步骤f中发酵后的棉籽粕即可作为肉牛、鸡、罗非鱼等的饲料。

经上述实例中微生物发酵法制备的棉籽粕成品的抗营养因子明显减少，粗蛋白和可溶蛋白含量得以增加，中小分子量蛋白质明显增多，大大提高了适口性，氨基酸含量趋于平衡，维生素丰富，且含有有益菌及未知生长因子，营养价值大大提高。可较明显地提高了棉籽粕在动物生产上的使用量及使用范围。其效果如下：

选择健康活泼的21日龄商品岭南黄肉鸡480羽，采用单因子试验设计，设4组，每组设4个重复，每个重复30羽。对照组为添加3％普通棉籽粕的典型日粮，试验组1、2、3分别添加5％、8％和10％发酵棉籽粕替代基础日粮中的普通棉籽粕和部分豆粕配制而成。26日龄进入正式试验，试验期22天。最后测定试验肉鸡的生长性能指标、屠宰性能、消化道重量指数、免疫指标、血液生化指标。结果为：

(1)肉鸡日粮中分别添加5％、8％和10％的发酵棉籽粕对肉鸡的平均日采食量、平均日增重和饲料转化率差异均不显著(p>0.05)(表1)；(2)肉鸡日粮中分别添加5％、8％和10％的发酵棉籽粕对肉鸡的全净膛率、半净膛率、胸肌率和腿肌率差异均不显著(p>0.05)，产肉性能良好。日粮中添加10％的发酵棉籽粕，屠宰率显著高于添加5％的发酵棉籽粕，且随着日粮中添加发酵棉籽粕比例的升高，屠宰率和半净膛率有升高的趋势(表2)；(3)日粮中添加5％的发酵棉籽粕极显著(p<0.01)降低了肉鸡的腹脂率，但随着日粮中发酵棉籽粕比例的升高，肉鸡腹脂率有升高的趋势(表2)；(4)肉鸡日粮中分别添加5％、8％和10％的发酵棉籽粕对肉鸡的消化道、免疫器官以及血液生化指标方面均无负面影响(表3-5)；(5)采用本试验条件及方式发酵的棉籽粕，在肉鸡日粮中添加比例可达10％，但以添加5％比例的发酵棉籽粕饲喂效果最好。

表1 添加不同比例的发酵棉籽粕对肉鸡生长性能的影响

注：同行肩注大写字母不同代表差异极显著(p<0.01)，同行肩注小写字母不同代表差异显著(p<0.05)，同行肩注相同小写字母代表差异不显著(p>0.05)，不标注者代表差异不显著，下同。

表2 日粮中添加不同比例的发酵棉籽粕对肉鸡屠宰指标的影响

表3 添加不同比例的发酵棉籽粕对肉鸡消化道重量指数的影响

表4 添加不同比例的发酵棉籽粕对肉鸡免疫器官的影响

表5 添加不同比例的发酵棉籽粕对肉鸡血液生化指标的影响