选择性封闭肿瘤STAT3的新型溶瘤腺病毒构建体的获得及用途

摘要

本发明公开了一种通过人工改造人类5型腺病毒(Ad5)而获得选择性封闭肿瘤STAT3的新型溶瘤腺病毒的构建方案，以及用该方案获取的重组腺病毒构建体在肿瘤治疗中的具体用途，属于医学基因工程技术领域。用PCR扩增定点缺失、酶切、连接、克隆、同源重组、转染、腺病毒单克隆纯化等技术，获得的一种重组腺病毒构建体，其技术特征在于：Ad5基因组E1A保守序列2(CR2)区缺失27个碱基；E3区ADP基因的29477－29714 nt缺失；同时在该缺失区反向插入部分STAT3 cDNA片段。该构建体是一种具有更高的肿瘤选择性复制能力的新型溶瘤腺病毒载体。该构建体在肿瘤的生物治疗中具有独特的实用价值，也为肿瘤基因治疗提供了理想的基因靶点特异性治疗模式。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5，Ad5)重组体的构建方案，其技术特征在于：定向缺失Ad5基因组的第920-946nt，即GAT CTT ACC TGC CAC GAG GCTGGC TTT，该序列编码E1A蛋白121至129位氨基酸，在此基础上，进一步缺失Ad5 E3区29477-29714nt，在上述缺失区域引入一个ClaI酶切位点；在ClaI酶切位点中反向插入770bp的外源性STAT3 cDNA片段，相当于STAT3 mRNA的第960-190nt，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3。发明内容属于医学基因工程技术领域。

二、背景技术

恶性肿瘤正在成为危害人类健康的首要疾病。据国内最新流行病学调查资料显示：我国现有癌症病人300多万人，每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人，每年有160万到200万新发的恶性肿瘤病例，并以3％的速度递增，给我国人民的生活和健康造成巨大威胁。目前常规的肿瘤治疗手段都无法从根本上清除恶性肿瘤，多数常见肿瘤的治疗仍面临着严峻的挑战，恶性肿瘤的彻底治疗需要肿瘤治疗方法的革新。

在肿瘤发病内在分子机制日益明了的新历史条件下，肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤治疗模式的尝试，大量分子靶点特异性抗癌化合物进入临床试用，标志着肿瘤治疗的突破到了一个关键的转折点，并已获得阶段性成果，初步凸显出未来肿瘤问题解决的基本轮廓，其最为核心的解决方法之一就是要从肿瘤繁复的基因调控网络中分解出最为关键的分子靶标，实施分子靶向治疗。截止至2001年底，获美国FDA批准进入临床实验阶段的分子治疗品种已超过三千种，包括细胞传导阻断剂、血管生成抑制剂、肿瘤疫苗和单克隆抗体，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望，可以说，未来人类肿瘤的有效控制在根本上依赖分子治疗的发展和完善。

分子治疗的主要手段主要分为三类：单克隆抗体、小分子化合物和基因治疗，其中，基因治疗作为近年医学领域发展中最具有生命活力的部分之一，已广泛应用于多种肿瘤的临床试验性治疗，显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底，美国生物制品评价和研究中心(Center for Biologics Evaluations and Research，CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过350项，其中约有70％的项目为肿瘤基因治疗，部分已经进入III期临床试验，取得较好疗效，在巨大的医疗需求的推动下，基因治疗制剂将有可能在近年内正式上市成为临床治疗药物，成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分。

重组Ad5载体作为肿瘤基因治疗应用最为广泛的载体之一，其临床可行性和安全性已获公认，腺病毒基因治疗载体具有以下突出的生物学优势和临床应用优势：感染谱广；不整合入宿主基因组，无致突变、致癌的危险性；临床应用安全，副作用轻微；临床应用方便；腺病毒在细胞体内持续表达时间短，尤其适合肿瘤治疗；临床级数量、质量的病毒易于生产、纯化。

目前肿瘤临床试用的绝大部分载体为缺失了E1及E3区的复制缺陷性腺病毒，进入肿瘤病灶后，对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗病毒的输入，距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。为此，近年来，出现了从复制缺陷性腺病毒载体向条件复制性腺病毒载体(conditionally replicative adenovirus)转化的新的发展趋势，所谓条件性复制腺病毒载体是指载体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，将肿瘤细胞作为生产病毒的场所，最终达到裂解杀灭肿瘤细胞的治疗目的，肿瘤细胞裂解释放出高浓度的病毒后，可进一步感染距离注射点较远的病灶肿瘤细胞，形成新一轮的感染波，周而复始形成一种正反馈，达到最大的治疗效应。此类载体另一个非常理想的优势是它们不能在正常细胞内完成复制，因此对正常细胞无任何杀伤效应。在第21届美国肿瘤研究年会上，来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明：局部注射后，复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限，在一定程度上影响了疗效的发挥，与此形成鲜明的对比，能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015，通过在肿瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒，其构建特点是在wt-Ad5的基因组上，部分缺失E1B 55kDa的编码序列，并加入翻译终止信号，但保留19kDa E1B的编码序列。

作为条件复制性腺病毒载体代表产品的ONYX-015在1996年进入临床试验以来，已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效。目前，美国辉瑞(pifzer)药物公司已从ONYX生物技术公司购买使用专利，并已在多种肿瘤进行临床期试验，其中，对复发性，难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床III期试验，已取得非常满意的疗效，对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中。国内已有4例与ONYX-015类似原理的专利申请，其中专利申请(一种缺陷型病毒及其构建方法)99124030.8通过缺失E1B 55kDa位于2809-3329bp编码序列，并在缺失部位插入终止码的方法得到E1B 55kDa部分缺失的构建体。专利申请(缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用)96013494.7通过部分缺失E1B 55kDa编码序列，并在该缺失部位插入标志基因LacZ，得到E1B 55kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体，该构建体的另一特点是有E3区的缺失。另外两项为申请人领导的研究小组提交的申请，专利号01144628.5“一种缺失E1A编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途”，缺失E1A 382-1630nt序列，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体，专利号01144629.3“一种联合缺失19kDa、55kDa E1B编码序列重组腺病毒构建体的构建及用途”，筛选出不能表达E1B功能蛋白的重组腺病毒构建体。

国内外现有的条件复制性腺病毒载体发明与第一代Ad5基因治疗载体相比，无论在治疗原理上，还是在实际治疗效果上均具有明显的改进，并取得突破性进展，被称为第二代Ad5基因治疗载体。然而，第二代Ad5基因治疗载体均有一些共同的缺点：<1>、基于腺病毒生物学基础设计的载体虽然具备肿瘤条件复制性的治疗优势，由于设计上的种种不足，获取的腺病毒在肿瘤细胞中的复制、裂解肿瘤细胞的效力远远弱于wt-Ad5，如单用ONYX-015的抗癌有效率仅为0-14％。<2>、第二代Ad5基因治疗载体的应用仍以肿瘤局部注射为主，在应用中受到极大的限制，在绝大部分情况下，肿瘤是一种全身性疾病，需经静脉用药的途径，进行系统性治疗，以控制原发及转移病灶，因此，第二代Ad5基因治疗载体的选择性和对肿瘤细胞的杀伤效率须进一步加强，以适应改进用药途径的需要。<3>、第二代Ad5基因治疗载体均未携带有效的治疗性目的基因，使治疗效应的发挥受到限制。<4>、由于现有的分子靶点绝大部分缺乏肿瘤特异性，以第二代Ad5基因治疗载体结合外源性启动子、治疗基因的策略虽然具有相对的肿瘤选择性，但仍不能避免对正常组织细胞的毒性作用。<5>、现有的携带治疗基因的Ad5载体感染靶细胞后，携带的治疗基因即获得表达的能力，不能避免地产生对正常组织细胞的毒性作用，尤其毒性或杀伤力较大的外源基因。<6>、第二代Ad5基因治疗载体结合的外源性启动子在细胞中的活性不稳定或较低。<7>、即使现有Ad5基因治疗载体有强大的溶瘤效应，但对肿瘤细胞过早的裂解导致携带的治疗基因不能有效表达，加上体内免疫对病毒的清除，使得病毒的治疗效果较低。

另一方面，近年来已经确定了许多肿瘤分子药靶，针对这些分子药靶设计单克隆抗体、小分子化合物，已成为肿瘤治疗发展的主要趋势，其中部分已经成为处方药，尚有大量的分子治疗手段正在临床试用评估阶段，取得了较好的初步结果。尽管如此，由于这些新的分子靶点及其分子阻遏手段，绝大部分缺乏肿瘤特异性，由此产生的剂量限制性毒性，仍然是这些疗法目前普遍面临和亟待解决的关键问题，极大地限制了肿瘤问题的解决。

三、发明内容

基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种新的第三代AD5基因治疗载体的构建方案，通过该方案获得的构建体具有肿瘤特异性复制、高度肿瘤特异性大量表达外源性插入基因、强大的肿瘤特异性旁观者效应等明显的优势，并具备高度的治疗指数，适于静脉用药，可以解决目前肿瘤治疗技术和实践中关键的不足之处。

本发明的理论基础基于现有研究对Ad5病毒生物学的深入认识。当AD5进入细胞后1小时内，Ad5就会表达出E1A功能蛋白，其生物学效应主要包括两方面，首先，E1A蛋白结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)蛋白，使宿主细胞内源性转录因子E2F从Rb-E2F的复合物中释放出来，与此同时，E1A蛋白将激活Ad5表达出E1B功能蛋白，以此灭活宿主细胞内源性转录因子P53对细胞周期驱动激酶的抑制，在E1A、E1B和E2F的共同驱动下，宿主细胞进入DNA合成期，为病毒基因组的自我复制提供前提条件；其次，Ad5依赖E1A蛋白激活Ad5的早期基因(E1B，E2，E3，E4)和晚期基因(L1-6)的表达，为病毒基因组的自我复制、病毒颗粒的包装、逃避宿主细胞的免疫清除、裂解细胞、释放病毒颗粒、再感染等完整的生命周期提供允许环境。由此可见，Ad5依赖E1A蛋白启动其它蛋白的序贯性合成，完成病毒的生命周期，最终裂解宿主细胞。

功能蛋白E1A的编码序列位于Ad5基因组560-1112nt，1229-1545nt，包含三个重要序列，分别为677-799nt，此序列为E1A保守序列1(CR1)，用于结合转录辅助因子P₃₀₀，917-979nt为E1A保守序列2(CR2)，用于结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)，1007-1115nt为保守序列3(CR3)，为基因转录激活区。由于几乎所有的肿瘤均存在Rb调控径路的缺陷，如果对E1A 917-979nt的CR2区加以不同的缺失改造，达到灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果，由此获取的腺病毒重组体将有可能在肿瘤细胞内有效复制，最终杀灭肿瘤细胞，另一方面，正常细胞具有的Rb调控径路，可以有效遏止腺病毒重组体依赖E1A蛋白启动其序贯性的生命周期，最终仅形成流产感染。这一理论推测已经为近来两个独立的研究组的工作所证实，Fueyo等(Oncogene，2000，19：2-12)构建了缺失E1A923-946nt的腺病毒重组体，观察到该腺病毒重组体选择性地在肿瘤细胞内复制，其复制特性强于wt-Ad5，而对正常细胞无任何毒性作用，单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长；Heise等(Nature Medicine，2000，10：1134-1139)更深入地证实该构建体对肿瘤细胞具有高度选择性，从静脉单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长并抑制肿瘤转移。

尽管Fueyo与Heise等的前期工作为发展第三代Ad5基因治疗载体提供了关键的理论线索，他们的工作仍有明显的不足之处，他们发展出的Ad5基因治疗载体不包含任何插入性外源性治疗基因，限制了抗肿瘤效应的发挥。为此，本发明在此基础上构建一种新型的Ad5重组体，其技术特征在于：定向缺失Ad5基因组的920-946nt序列，并进一步缺失Ad5E3区29477-29714nt，在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点；在ClaI酶切位点中反向插入770bp的外源性STAT3 cDNA片段，该片段相当于STAT3 mRNA的第960-190nt，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3。

STAT3基因全称为信号转导及转录活化因子3(signal transducer and activator oftranscription 3)，在大部分肿瘤细胞中异常表达或呈持续活化状态，其功能在于促进肿瘤细胞增值抑制其凋亡，促进肿瘤血管生成，使肿瘤细胞获得免疫逃避的能力，而正常细胞并不依赖于这些功能。因此，在本发明中被选为分子药靶。

与现有的重组腺病毒构建体相比，本发明达到了以下效果：

1、本重组腺病毒构建体缺失E1A蛋白的920-946nt序列，在理论和实际上达到了在灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果。更为重要的是，我们在Δ920-946 Ad5载体的E3 ADP区反向插入770bp的外源性STAT3 cDNA片段，该片段相当于STAT3 mRNA的第960-190nt，使反义STAT3 cDNA的表达依赖Ad5自身E3区转录单位的内源性启动子，该启动子具有类似CMV启动子的高活性，启动子的开放完全依赖于病毒基因组DNA在细胞内的复制，病毒如不复制，外源性反义STAT3 cDNA将不表达；并且由于ADP基因的缺失，重组腺病毒裂解细胞的能力相对降低，但细胞内病毒的扩增量显著增加，因而被病毒感染的细胞就成为治疗基因的加工厂。由于这种全新的设计，使这一新的构建体可通过三重机制达到选择性杀灭肿瘤细胞的治疗目的，即：构建体只在肿瘤细胞内复制且裂解细胞的时间相对滞后，可使外源性反义STAT3 cDNA拷贝数大大增加；构建体携带的反义STAT3 cDNA只在肿瘤细胞内表达，该表达完全依赖于病毒基因组DNA在细胞内的复制，因此能特异性封闭肿瘤细胞的STAT3基因表达，达到杀灭肿瘤细胞的目的，避免了对正常细胞的攻击；构建体以肿瘤细胞为复制宿主，在肿瘤局部可产生高浓度病毒，形成强效旁观者效应。构建体的免疫调节蛋白功能完整，一定程度上避免了机体对重组腺病毒的清除。此外，本发明也将为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。

2、进年来大量的研究表明，STAT3在大部分肿瘤细胞中异常表达或呈持续活化状态，且肿瘤细胞更依赖于这种活化而存活，对这种活化的抑制也更为敏感。因而为对STAT3短暂的部分封闭提供了较为理想的治疗窗。

3、对肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明，该重组腺病毒构建体对正常细胞STAT3基因的表达无明显影响，对细胞活性无明显影响，相反，它可特异性封闭肿瘤细胞内STAT3基因的表达，有显著的杀灭肿瘤细胞的效应。

4、对肿瘤动物模型的体内模型研究证实，通过肿瘤局部注射或静脉注射的用药途径，该重组腺病毒构建体对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性。

四、附图说明

附图1：Ad5 E3区结构图，该区域编码7种蛋白，要缺失的区域为29477-29714bp，为E3 ADP基因，在该区域反向插入770bp的外源性STAT3 cDNA片段，该片段相当于STAT3mRNA的第960-190nt。

附图2：组病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3结构示意图。

附录1：重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3序列及结构说明。

五、具体实施例

下列实施例中，除特别注明外，技术流程中所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司。

例1、pXC1系列突变体(Δ920-946pXC1)的构建

pXC1购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号：PD-01-03)，该质粒包含人类5型腺病毒(Ad5)21-5790nt序列。

采用3次PCR法缺失920-946nt，片段1的获取：引物1＝5′-CG GGA TCC GGG CCCCCA TTT CC-3′，相当于9883-9902nt，下划线部分为BamHI酶切位点；引物2＝5′-GTCACT GGG TGG ATC GAT CAC CTC CGG TAC-3′，相当于922-905nt，下划线部分为与引物3互补部分；

以pXC1为模板，行PCR反应，反应体系总体积为100μl包括：

含MgCl₂的10×PCR缓冲液         10μl

2mM dNTP                       10μl

10μM引物1                      1μl

10μM引物2                      1μl

pXC1 10ng/μl             1μl

pfu高保真Taq酶           2.5u

加水至                   100μl；

反应条件为：95℃ 30秒；95℃ 45秒、60℃ 1分钟、72℃ 2分钟共28循环；72℃延伸10分钟。PCR产物长940bp，形成片段1，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。

片段2的获取：引物3＝5′-GAG GTG ATC GAT CCA CCC AGT GAC GAC GAG-3′，相当于911-947nt，下划线部分为与引物2互补部分；引物4＝5′-TGC TCT AGA CAC AGGTGA TGT CG-3′，相当于1344-1325nt，下划线部分为XbaI酶切位点；

以pXC1为模板，行PCR反应，反应条件同上，产物长400bp，形成片段2，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。

片段3的获取：将50ng/2μl片段1与25ng/1μl片段2混合，作为模板行PCR反应，上游引物为引物1，下游引物为引物4，反应条件同上，产物约为1400bp，形成片段3，用QIAquick 8PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，German，Cat：28142)纯化后，用BamHI，XbaI双酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段用于克隆。

将pXC1用BamHI，XbaI双酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后产生2条带，约为1400bp和8500bp，回收8500bp酶切片段用于克隆。

取40ng的8500bp pXC1酶切片段及90ng片段3，用DNA T₄连接酶做连接反应，取1.5μl转化100μl DH5α感受态细菌，铺皿过夜培养，第二天挑取单个菌落克隆，提取其内扩增的质粒，DNA测序鉴定筛选得到缺失121-129AA 920-946nt的pXC1质粒突变体-Δ920-946pXC1，用于重组腺病毒的克隆。

例2、Δ920-946 Ad5重组腺病毒的构建

pBHGE3购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号：PD-01-12)，该质粒包含除ADd5包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列。

pBHGE3从Microbix Biosystem Inc.获取时，总量为10μg，先电转入感受态细菌，挑取阳性克隆，提取质粒，得到的质粒用CsCl₂-EB超速离心法纯化。

同源重组法获取Δ920-946 Ad5重组腺病毒构建体，方法如下：

在15cm培养皿中种入7.5×10⁵ 293细胞，培养液为10％ FBS DMEM，到第二天，细胞应为1-1.5×10⁶，大约70％的细胞融合；转染前3-4小时，换成新鲜培养液。

配制共转染DNA-磷酸钙溶液：将1600μl灭菌的2×HBS(280mM NaCl，43mMHEPES，10mM KCl，10mM Na₂HPO₄.7H₂O，2％ dextrose，pH7.05-7.15)/pBHGE3和Δ920-946pXC1各42μg/加灭菌的双蒸水至2840μl混匀，缓慢加入50μl 2.5M的CaCl₂，颠倒混匀，在室温下让DNA/CaCl₂沉淀45-60分钟，形成微混浊的沉淀。

加500μl上述混合液至含5ml 60mm培养皿的293细胞中，在37℃、5％ CO2中孵育4-6小时，吸去上述液体，用PBS洗一次。

用含15％的甘油/DMEM处理1-2分钟以促进转染效率，用PBS洗一次，换为完全培养液。

制备1.8％低溶点琼脂糖，高压灭菌，分装成5ml，用前在沸水中融化，保温在45℃，用时加入等量4％ FBS DMEM，即刻铺入培养皿中。

吸去培养液，加入5ml上述液体。每4-5天，加入3ml上述液体。

14-21天，噬斑出现，选定6-12个噬斑。将噬斑转移到含无血清DMEM培养基的1.5ml的EP管中，在37℃孵育24小时。

在24孔板培养皿中种入1×10⁵ 293细胞，培养液为10％ FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×10⁵，大约70％的细胞融合，吸去液体，从上述孵育液取100μl(大约为10³病毒)加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％ CO₂中孵育90分钟。

加入完全培养基至1ml，将细胞放置于37℃，5％ CO2中孵育5-10天，直至完全的CPE出现，所谓CPE，即细胞毒效应，细胞表现为变圆、漂浮、细胞以核仁为主。假如10天后，完全的CPE未出现，则提示病毒的效价太低，需进行第二轮的扩增。

将培养板进行三轮的冻/解冻的循环，释放出病毒，将裂解液收集于15ml试管，最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80℃，该液体称为第二代病毒，大约为5×10⁷/ml病毒。

对以上病毒进行再次扩增，在75cm²培养皿中种入5×10⁶ 293细胞，培养液为10ml10％ FBS DMEM，到第二天，细胞应为1×10⁷，大约70％细胞融合；

转染前3-4小时，换成新鲜培养液；

取1ml第二代病毒储存液加入完全培养基至1ml，用于转染；该MOI约为5；除去75cm2培养皿的液体，加入以上液体，轻轻摇动三次；在37℃、5％ CO2中孵育90分钟；加入9ml 2％ FBS DMEM，在37℃、5％ CO2中孵育4-7天，用于提取病毒DNA用于阳性病毒的筛选。

因为293细胞基因组包含完整的E1A基因，提取阳性病毒DNA时容易污染293细胞DNA，造成鉴定失败，为此将Δ920-946 Ad5在肿瘤细胞Hela中再扩增一次，用于鉴定，步骤如下：

在6孔板培养皿中种入1×10⁵Hela细胞，培养液为10％ FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×10⁵，大约70％的细胞融合，吸去液体，从上述滤过液取100μl(大约为10³病毒)加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％ CO₂中孵育90分钟。

加入完全培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％ CO2中孵育5-10天，直至完全的CPE出现，将细胞刮下，收集于1.5ml EP管，离心弃上清，加入300μl PBS溶液，进行三轮的冻/解冻的循环，释放出病毒，将裂解液最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80℃，用Qiagen公司试剂盒mini DNA isolationkit，参照试剂盒说明提取DNA。以病毒DNA为模板，行PCR反应，上游引物＝5′-CG GGA TCC GGG CCC CCA TTT CC-3′，下游引物＝5′-TGC TCT AGA CAC AGG TGA TGT CG-3′，反应体系总体积为100μl包括：含MgCl2的10×PCR缓冲液10μl/2mM dNTP 10μl/10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl/病毒DNA 10ng/pfu高保真Taq酶2.5u/加水至100μl。反应条件为：95℃ 30秒/95℃ 45秒、60℃ 1分钟、72℃ 2分钟共28循环/72℃延伸10分钟。PCR产物为1400bp，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于DNA测序，测序引物为：5′-AGCCGGAGCAGAGAGCCTTG-3′，挑出正确克隆用于构建Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒。

例3、Ad5 E3区的亚克隆载体pCDNA3.1-ΔADP的构建

Ad5 E3区全称为Ad5早期区域3，该区域在内源性启动子的驱动下，编码7种蛋白，序列、结构、功能参见附图1：12.5k，27858-28179nt，功能未明；6.7k，27547-28736nt，和RID复合体一起抑制TRAIL受体1、2在细胞表面的表达；gp19k，28735-29215nt，结合MHC I类抗原，抑制其至细胞表面的呈递，逃避CTL的清除；ADP，29419-29770nt，裂解细胞，释放病毒；RIDα，29784-30057nt，与RIDβ形成复合物，防止TNF的裂解，清除FAS抗原；RIDβ，30062-30458nt及14.7k，30453-30837，抑制TNF的裂解。

本实验的目的是要缺失E3区29477-29714nt区域，并在重组腺病毒的E3ADP区域插入外源性治疗基因。

采用3次PCR法缺失Ad5 E3区29477-29714nt：

片段1的获取：引物1＝5′-ATACGCGCCCACCGAAAC-3′，相当于27306-27323nt；引物2＝5′-AATCTATGGATATCGAT AGGGTGGGTCGCTGTAGTT-3′，相当于29477-29495nt，(下划线部分为与引物3互补部分，ATCGAT为Cla I酶切位点)；

以Ad5 DNA为模板，行PCR反应，反应体系总体积为100μl包括：

含MgCl₂的10×PCR缓冲液         10μl

2mM dNTP                       10μl

10μM引物1                     1μl

10μM引物2                     1μl

Ad5 DNA 200ng/μl              1μl

pfu高保真Taq酶                2.5u

加水至                        100μl；

反应条件为：

94℃ 30秒；

94℃ 30秒、46℃ 1分钟、72℃ 1分钟共30循环；

72℃延伸10分钟。

PCR产物为2207bp(片段1)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。

片段2的获取：

引物3＝5′-CGACCCACCCTATCGATATCCATAGATTGGACGGACTG-3′(相当于29714-29734n)(下划线部分为与引物2互补部分，ATC GAT为Cla I酶切位点)引物4＝5′-ATGTCTTTGAGGCTTGGAGG-3′(相当于30137-30118nt)；PCR反应条件同上，产物为422bp(片段2)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。

片段3的获取：将片段1与片段2等量混合，作为模板行PCR反应，上游引物为引物1，下游引物为引物4，反应条件同上，产物约为2612bp(片段3)，用QIAquick 8 PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，German，Cat：28142)纯化后，用EcoRI酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，酶切片段用于后继连接反应。

将pCDNA3.1(Invitrogen，U.S.A.，Cat：V79020)用EcoRI酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段，去磷酸化后用于后继连接反应。

将PCR反应产物片段3与酶切、去磷酸化后pCDNA3.1连接，取1.5μl转入100μl DH5α感受态细菌，挑取阳性克隆，质粒小提，DNA测序鉴定筛选得到缺失29477-29714nt的pCDNA3.1质粒突变体-pCDNA3.1-ΔADP，用于插入外源性治疗基因的亚克隆。

例4、在载体pCDNA3.1-ΔADP的中反向插入770bp的外源性STAT3 cDNA片段

STAT3 cDNA片段从乳腺癌细胞系MDA-MB-231的RNA中扩增而来，逆转录条件：

5×MMLV缓冲液        4μl

10mM dNTP            1μl

OligdT(50ng/ml)      1μl

总RNA                2μl

Rnasin               0.5μl

MMLV逆转录酶         1μl

加无RNA酶水至        20μl；

逆转录反应产物用于PCR反应。上游引物为5′-CCATCGATGGCCTCTCGGCCTCTGCC-3′，该片段相当于STAT3 cDNA编码序列的第190-1207nt(下划线部分为Cla I酶切位点)；下游引物为5′-CC ATCGATTTGCCGCCTCTTCCAGTCAGC-3′，该片段相当于STAT3cDNA编码序列的第960-961nt(下划线部分为Cla I酶切位点)，扩增片段包括STAT3 cDNA编码序列的第960-190nt，全长约为770bp。

反应体系总体积为100μl包括：

含MgCl₂的10×PCR缓冲液           10μl

2mM dNTP                         10μl

10μM上游引物                     1μl

10μM下游引物                     1μl

逆转录反应产物                   2μl

pfu高保真Taq酶                   2.5u

加水至                           100μl；

反应条件为：

94℃ 30秒；

94℃ 30秒、52℃ 1分钟、72℃ 1分钟共30循环；

72℃延伸10分钟。

PCR产物为776bp，Cla I酶切后，常规电泳分离纯化，检测浓度用于后继PCR反应。载体pCDNA3.1-ΔADP用Cla I酶切线形化后，常规电泳分离纯化，去磷酸化后与770bp的外源性STAT3 cDNA片段连接，取1.5μl转入100μl DH5α感受态细菌，挑取阳性克隆，质粒小提，DNA测序鉴定筛选得到在Cla I酶切位点反向插入770bp的外源性STAT3 cDNA片段的质粒突变体-pCDNA3.1-ΔADP/ASSTAT3，用于后继重组腺病毒的克隆。

例5、重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3的获取

重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3的获取按照参考文献“Adenovirus methodsand protocol，edited by William S.M.Wold，construction of mutations in the adenovirus earlyregion 3(E3)transcription units，11-24”建立的连接法(ligation protocol)进行，主要步骤包括TPDNA的提取；用于重组腺病毒构建E3区DNA的准备；连接反应；共转染293细胞同源重组；噬斑的挑取和鉴定；阳性病毒的扩增和纯化。详细方法参见该文献。通过以上实验步骤得到重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3，该腺病毒缺失了Ad5 920-946nt序列(GATCTT ACC TGC CAC GAG GCT GGC TTT)，该序列编码E1A蛋白121至129位氨基酸，并缺失Ad5 E3区29477-29714nt，在ClaI酶切位点中反向插入770bp的外源性STAT3 cDNA片段，该片段相当于STAT3 mRNA的第960-190nt，其他基因组结构与wt-Ad5完全相同，其序列及结构见附图2及附录1。

例6、重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3特征鉴定

1、重组腺病毒构建体的体外肿瘤特异性复制的鉴定

本实验的目的在于鉴定Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒在一系列肿瘤及正常细胞中的复制特点，实验将以wt-Ad5为阳性对照，以复制缺陷型病毒Ad5CMV-GFP为阴性对照。选用细胞系为人肺癌细胞系A549(P53+，RB-)，人高转移性前列腺癌细胞系PC3M-1E8(P53-，RB-)，人成骨细胞瘤细胞系U-2OS(P53+，RB-)，人结肠癌细胞系HCT-8(P53+，RB+)，人乳腺癌细胞系MCF-7(P53+，RB+)。选用的细胞系具有不同的P53，RB基因表型；具有不同组织源性，因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、前列腺上皮细胞、骨髓单个核细胞，选用原则为：静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。

在24孔板培养皿中种入1×10⁵肿瘤或正常骨髓单个核细胞，培养液为10％ FBS DMEM或RIPM1640，到第二天大约70％的细胞融合，吸去液体，加入达到70％所需的MOI稀释至100μl加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％ CO₂中孵育90分钟。

加入含2％ FBS DMEM或RIPM1640培养基至1ml，将细胞放置于37℃ 5％ CO2中孵育3-10天，观察细胞出现完全CPE所需的时间。

实验结果表明，阳性对照wt-Ad5无选择性地裂解肿瘤和正常细胞；复制缺陷型腺病毒Ad5CMV-GFP不能裂解任何细胞，重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3选择性地杀伤肿瘤细胞，其效应显著强于wt-Ad5对细胞的裂解效应，同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3选择性杀灭肿瘤细胞，具体数据见下表：

 

wt-Ad5Ad5CMV-GFPAd5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3        A549第3天48％1％80％第6天100％2％100％第10天4％PC3M-1E8第3天62％1％90％第6天100％2％100％第10天4％U-2OS第3天61％1％89％第6天100％2％100％第10天4％HCT-8第3天63％1％91％第6天100％2％100％第10天4％PGBE1第3天60％1％89％第6天100％2％100％第10天4％MCF-7第3天55％1％82％第6天100％1％100％

 

第10天1％血管内皮细胞第3天58％1％1％第6天100％2％2％第10天4％3％肺小气管上皮细胞第3天61％1％1％第6天100％2％2％第10天4％3％前列腺上皮细胞第3天63％1％2％第6天100％2％3％第10天4％3％骨髓单个核细胞第3天52％1％1％第6天100％2％3％第10天4％4％

为进一步进行定量检测Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒构建体在肿瘤细胞中复制效率，进行了以下实验：

在24孔板培养皿中各种入1×10⁵各种肿瘤细胞或原代正常细胞，培养液为10％ FBSDMEM或RIPM1640，到第二天，大约70％的细胞融合，吸去液体，加入Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3 10MOI稀释至100μl加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％ CO₂中孵育90分钟。

加入含2％ FBS DMEM培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％ CO2中孵育3天。

加入300μl PBS溶液，进行三轮的冻/解冻的循环，释放出病毒，将裂解液最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80℃，TCID₅₀法检测病毒的滴度。

结果表明Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3在肿瘤细胞中复制后其效价强于起始的3000-5000倍，而在正常细胞中感染效价无明显变化，结果充分表明该重组腺病毒构建体具有在肿瘤细胞内特异性复制的特性。

2、重组腺病毒构建体的体外选择性灭活肿瘤细胞STAT3表达特性的鉴定

本实验的目的在于鉴定Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3重组腺病毒在对一系列肿瘤及正常细胞STAT3表达的影响，实验选用细胞系为人肺癌细胞系A549(P53+，RB-)，人成骨细胞瘤细胞系U-2OS(P53+，RB-)，人转移性前列腺癌细胞系PC3M-1E8(P53-，RB-)，人结肠癌细胞系HCT-8(P53+，RB+)，人乳腺癌细胞系MCF-7(P53+，RB+)。选用的细胞系具有不同的P53，RB基因表型；具有不同组织源性，因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、前列腺上皮细胞、骨髓单个核细胞，选用原则为：静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。

在24孔板培养皿中种入1×10⁵肿瘤或正常细胞，培养液为10％ FBS DMEM或RIPM1640，到第二天大约70％的细胞融合，吸去液体，加入达到70％所需的MOI稀释至100μl加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％ CO₂中孵育90分钟。

加入含2％ FBS DMEM或RIPM1640培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％ CO2中孵育3-10天，提取细胞总蛋白检测STAT3蛋白表达水平的变化。

实验结果表明，重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3能选择性封闭肿瘤细胞STAT3蛋白的表达，同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系STAT3蛋白表达无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3选择性灭活肿瘤细胞STAT3基因的表达。

3、重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3体内抗肿瘤效应的鉴定

肿瘤细胞动物模型：选择4～6周龄的BALB/c裸鼠，取对数生长期的胃癌细胞系MKN-45细胞，调整细胞密度1×10⁶/100μl，每只裸鼠右侧背部皮下接种200μl，待肿瘤平均直径达到0.4-0.6cm时，按肿瘤大小随机分为4组，即介质对照组、wt-Ad5组、Ad5CMV-GFP组和Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3组，每组10只裸鼠，分别瘤内注射PBS，wt-Ad5，Ad5CMV-GFP和Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3，每只2×10⁸pfu/(只·次)，每天一次，连续5天。每周观察并测量肿瘤体积2次，直至实验终点(100天或肿瘤体积大于1cm³)。

实验结果表明，在实验终点时，wt-Ad5组平均肿瘤抑制率为40％±2％；Ad5CMV-GFP组肿瘤抑制率为-2％±3％；Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3组三只裸鼠肿瘤完全消退，平均肿瘤抑制率为90％±3％，结果充分表明重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3具有确定的体内抗肿瘤效应。

体静脉用药对胃原位癌模型的治疗及对肿瘤微转移的抑制：当胃癌皮下肿瘤生长至0.7-0.8cm时，选择全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成1-2mm的瘤块，移植到胃小弯粘膜下。动物B超监测当肿瘤生长至3mm时，随机分为4组，即PBS对照组、wt-Ad5组、Ad5CMV-GFP组和Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3组，每组10只裸鼠，用2×10⁸pfu病毒静脉内注射，连续治疗5天。动物B超监测肿瘤体积。至实验终点(30天或肿瘤体积大于1.2cm³)，取出肺、肝、空、结肠及腹膜后、门静脉和肺门淋巴结，病理检测微转移。实验结果表明，在实验终点时，PBS对照组全部有多器官、组织肿瘤转移，wt-Ad5组肿瘤抑制率为25％±2％，10只裸鼠中8只发生肿瘤多器官转移；Ad5CMV-GFP肿瘤抑制率为-3％±4％；肿瘤转移的发生率为100％；ΔAD5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT31组3只裸鼠肿瘤完全消退，肿瘤抑制率为85％±4％，1只发生肿瘤空、结肠种植性转移。以上结果充分表明重组腺病毒构建体AD5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3静脉用药具有显著的体内抗肿瘤和抑制肿瘤转移的效应。

附件DNA序列表

<110>深圳市奥尼克斯基因技术有限公司

<110>马丁 周剑峰 王世宣 卢运萍 韩志强

<120>选择性封闭肿瘤STAT3的新型溶瘤腺病毒构建体的获得及用途

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210<1

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>misc_feature

<400>

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360

gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420

cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480

tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540

tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600

aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660

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cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780

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cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900

ccttgtaccg gaggtgatcg atcacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga 960

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gggtttggtg tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt 1200

attgtgattt ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg 1260

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cctttggact tgagctgtaa acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg 1560

tggttaacgc ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg 1620

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ctaatcttgg ttacatctga cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct 1740

gtgcgtaact tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg 1800

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gagcttttga aatcctgtgg tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt 1920

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ctattagggt atatgcaaag gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac 2580

ttgtaaatat caggaattgt tgctacatttctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata 2640

cggaggatag ggtggccttt agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca 2700

tggacggggt ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt 2760

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gggtggtgtg tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta 2940

ccttgggtat cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg 3000

gttgcttcat gctagtgaaa agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact 3060

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cagatggggg gatcatgtct acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc ggggtagggg 4860

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tttgtcgcga tcggcgcgct ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt cgcgcgcaac 6360

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ttacaagtgt cagccgcgcg ctggggcagg aggacacggg cagcctggag gcaaccctaa 13200

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tgtgggatat gctccagcgc tacaaccttg aagtcaggct tcctggatgt cagcatctga 29400

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cgcccgacca cccatctata gtcccatcat tgtgctacac ccaaacaatg atggaatcca 29700

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ctagaaagac gcagggcagc ggccgagcaa cagcgcatga atcaagagct ccaagacatg 30540

gttaacttgc accagtgcaa aaggggtatc ttttgtctgg taaagcaggc caaagtcacc 30600

tacgacagta ataccaccgg acaccgcctt agctacaagt tgccaaccaa gcgtcagaaa 30660

ttggtggtca tggtgggaga aaagcccatt accataactc agcactcggt agaaaccgaa 30720

ggctgcattc actcaccttg tcaaggacct gaggatctct gcacccttat taagaccctg 30780

tgcggtctca aagatcttat tccctttaac taataaaaaa aaataataaa gcatcactta 30840

cttaaaatca gttagcaaat ttctgtccag tttattcagc agcacctcct tgccctcctc 30900

ccagctctgg tattgcagct tcctcctggc tgcaaacttt ctccacaatc taaatggaat 30960

gtcagtttcc tcctgttcct gtccatccgc acccactatc ttcatgttgt tgcagatgaa 31020

gcgcgcaaga ccgtctgaag ataccttcaa ccccgtgtat ccatatgaca cggaaaccgg 31080

tcctccaact gtgccttttc ttactcctcc ctttgtatcc cccaatgggt ttcaagagag 31140

tccccctggg gtactctctt tgcgcctatc cgaacctcta gttacctcca atggcatgct 31200

tgcgctcaaa atgggcaacg gcctctctct ggacgaggcc ggcaacctta cctcccaaaa 31260

tgtaaccact gtgagcccac ctctcaaaaa aaccaagtca aacataaacc tggaaatatc 31320

tgcacccctc acagttacct cagaagccct aactgtggct gccgccgcac ctctaatggt 31380

cgcgggcaac acactcacca tgcaatcaca ggccccgcta accgtgcacg actccaaact 31440

tagcattgcc acccaaggac ccctcacagt gtcagaagga aagctagccc tgcaaacatc 31500

aggccccctc accaccaccg atagcagtac ccttactatc actgcctcac cccctctaac 31560

tactgccact ggtagcttgg gcattgactt gaaagagccc atttatacac aaaatggaaa 31620

actaggacta aagtacgggg ctcctttgca tgtaacagac gacctaaaca ctttgaccgt 31680

agcaactggt ccaggtgtga ctattaataa tacttccttg caaactaaag ttactggagc 31740

cttgggtttt gattcacaag gcaatatgca acttaatgta gcaggaggac taaggattga 31800

ttctcaaaac agacgcctta tacttgatgt tagttatccg tttgatgctc aaaaccaact 31860

aaatctaaga ctaggacagg gccctctttt tataaactca gcccacaact tggatattaa 31920

ctacaacaaa ggcctttact tgtttacagc ttcaaacaat tccaaaaagc ttgaggttaa 31980

cctaagcact gccaaggggt tgatgtttga cgctacagcc atagccatta atgcaggaga 32040

tgggcttgaa tttggttcac ctaatgcacc aaacacaaat cccctcaaaa caaaaattgg 32100

ccatggccta gaatttgatt caaacaaggc tatggttcct aaactaggaa ctggccttag 32160

ttttgacagc acaggtgcca ttacagtagg aaacaaaaat aatgataagc taactttgtg 32220

gaccacacca gctccatctc ctaactgtag actaaatgca gagaaagatg ctaaactcac 32280

tttggtctta acaaaatgtg gcagtcaaat acttgctaca gtttcagttt tggctgttaa 32340

aggcagtttg gctccaatat ctggaacagt tcaaagtgct catcttatta taagatttga 32400

cgaaaatgga gtgctactaa acaattcctt cctggaccca gaatattgga actttagaaa 32460

tggagatctt actgaaggca cagcctatac aaacgctgtt ggatttatgc ctaacctatc 32520

agcttatcca aaatctcacg gtaaaactgc caaaagtaac attgtcagtc aagtttactt 32580

aaacggagac aaaactaaac ctgtaacact aaccattaca ctaaacggta cacaggaaac 32640

aggagacaca actccaagtg catactctat gtcattttca tgggactggt ctggccacaa 32700

ctacattaat gaaatatttg ccacatcctc ttacactttt tcatacattg cccaagaata 32760

aagaatcgtt tgtgttatgt ttcaacgtgt ttatttttca attgcagaaa atttcaagtc 32820

atttttcatt cagtagtata gccccaccac cacatagctt atacagatca ccgtacctta 32880

atcaaactca cagaacccta gtattcaacc tgccacctcc ctcccaacac acagagtaca 32940

cagtcctttc tccccggctg gccttaaaaa gcatcatatc atgggtaaca gacatattct 33000

taggtgttat attccacacg gtttcctgtc gagccaaacg ctcatcagtg atattaataa 33060

actccccggg cagctcactt aagttcatgt cgctgtccag ctgctgagcc acaggctgct 33120

gtccaacttg cggttgctta acgggcggcg aaggagaagt ccacgcctac atgggggtag 33180

agtcataatc gtgcatcagg atagggcggt ggtgctgcag cagcgcgcga ataaactgct 33240

gccgccgccg ctccgtcctg caggaataca acatggcagt ggtctcctca gcgatgattc 33300

gcaccgcccg cagcataagg cgccttgtcc tccgggcaca gcagcgcacc ctgatctcac 33360

ttaaatcagc acagtaactg cagcacagca ccacaatatt gttcaaaatc ccacagtgca 33420

aggcgctgta tccaaagctc atggcgggga ccacagaacc cacgtggcca tcataccaca 33480

agcgcaggta gattaagtgg cgacccctca taaacacgct ggacataaac attacctctt 33540

ttggcatgtt gtaattcacc acctcccggt accatataaa cctctgatta aacatggcgc 33600

catccaccac catcctaaac cagctggcca aaacctgccc gccggctata cactgcaggg 33660

aaccgggact ggaacaatga cagtggagag cccaggactc gtaaccatgg atcatcatgc 33720

tcgtcatgat atcaatgttg gcacaacaca ggcacacgtg catacacttc ctcaggatta 33780

caagctcctc ccgcgttaga accatatccc agggaacaac ccattcctga atcagcgtaa 33840

atcccacact gcagggaaga cctcgcacgt aactcacgtt gtgcattgtc aaagtgttac 33900

attcgggcag cagcggatga tcctccagta tggtagcgcg ggtttctgtc tcaaaaggag 33960

gtagacgatc cctactgtac ggagtgcgcc gagacaaccg agatcgtgtt ggtcgtagtg 34020

tcatgccaaa tggaacgccg gacgtagtca tatttcctga agcaaaacca ggtgcgggcg 34080

tgacaaacag atctgcgtct ccggtctcgc cgcttagatc gctctgtgta gtagttgtag 34140

tatatccact ctctcaaagc atccaggcgc cccctggctt cgggttctat gtaaactcct 34200

tcatgcgccg ctgccctgat aacatccacc accgcagaat aagccacacc cagccaacct 34260

acacattcgt tctgcgagtc acacacggga ggagcgggaa gagctggaag aaccatgttt 34320

ttttttttat tccaaaagat tatccaaaac ctcaaaatga agatctatta agtgaacgcg 34380

ctcccctccg gtggcgtggt caaactctac agccaaagaa cagataatgg catttgtaag 34440

atgttgcaca atggcttcca aaaggcaaac ggccctcacg tccaagtgga cgtaaaggct 34500

aaacccttca gggtgaatct cctctataaa cattccagca ccttcaacca tgcccaaata 34560

attctcatct cgccaccttc tcaatatatc tctaagcaaa tcccgaatat taagtccggc 34620

cattgtaaaa atctgctcca gagcgccctc caccttcagc ctcaagcagc gaatcatgat 34680

tgcaaaaatt caggttcctc acagacctgt ataagattca aaagcggaac attaacaaaa 34740

ataccgcgat cccgtaggtc ccttcgcagg gccagctgaa cataatcgtg caggtctgca 34800

cggaccagcg cggccacttc cccgccagga accttgacaa aagaacccac actgattatg 34860

acacgcatac tcggagctat gctaaccagc gtagccccga tgtaagcttt gttgcatggg 34920

cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga 34980

aagcacatcg tagtcatgct catgcagata aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga 35040

aaaagacacc atttctctct caaacatgtc tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa 35100

taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata 35160

agcataagac ggactacggc catgccggcg tgaccgtaaa aaaactggtc accgtgatta 35220

aaaagcacca ccgacagctc ctcggtcatg tccggagtca taatgtaaga ctcggtaaac 35280

acatcaggtt gattcatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca 35340

tacccgcagg cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg 35400

agagaaaaac acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg 35460

ctccagaaca acatacagcg cttcacagcg gcagcctaac agtcagcctt accagtaaaa 35520

aagaaaacct attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta 35580

aaaaagggcc aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta acggttaaag 35640

tccacaaaaa acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc ccagaaacga aagccaaaaa 35700

acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtaact tcccatttta 35760

agaaaactac aattcccaac acatacaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc 35820

ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca 35880

atccaaaata aggtatatta ttgatgatg                                  35909

附录1：重组腺病毒构建体Ad5/ΔE1/ΔADP/ASSTAT3的序列及结构说明

  1 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt

 61 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt

121 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg

181 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag

241 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga

301 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg

361 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc

421 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg

481 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc

541 tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga

601 aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc

661 tcctagccattttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc

721 cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt

781 gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca

841 cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa

901 ccttgtaccg gaggtgatcg at                          ccac ccagtgacga

空缺部分为缺失部分

961 cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg

1021 caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg

1081 ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga

1141 tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa

1201 gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag

1261 ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga

1321 cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt

1381 ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt

1441 gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag

1501 cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga

1561 ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt

1621 gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg

1681 cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat

1741 ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg

1801 tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg

1861 gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac

1921 caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct

1981 gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg

2041 agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac

2101 aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag

2161 cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga

2221 gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga

2281 gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg

2341 gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc

2401 gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc

2461 tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt

2521 ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga

2581 tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg

2641 agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg

2701 tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg

2761 gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta

2821 acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct

2881 gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg

2941 aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct

3001 ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat

3061 gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc

3121 tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata

3181 acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc

3241 aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc

3301 tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc

3361 gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc

3421 tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt

3481 ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg

3541 tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg

3601 ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc

3661 gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc

3721 ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg

3781 agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg

3841 actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg

3901 acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt

3961 ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca

4021 atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt

4081 cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt

4141 cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat

4201 acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg

4261 gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt

4321 ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt

4381 taagctggga tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt

4441 tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag

4501 tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact

4561 tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg

4621 gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt

4681 ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg

4741 gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg

4801 ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg

4861 gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc

4921 cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg ggtgcaactg gtagttaaga gagctgcagc

4981 tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt

5041 ccctgaccaa atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag

5101 caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa

5161 gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat

5221 ctcctcgttt cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag

5281 acgggccagg gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac

5341 ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct

5401 ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt

5461 gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc

5521 gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga

5581 ttccggggag taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca

5641 ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt

5701 cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc

5761 cccgtataca gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag

5821 aaactcggac cactctgaga caaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg

5881 ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat

5941 gtcgccctct tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg

6001 tgttcctgaa ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc

6061 atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctgaaaag cgggcatgac

6121 ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc

6181 ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc

6241 aagcttggtg gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag

6301 ggtttggttt ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc

6361 gcgcgcaacg caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggtgcac

6421 gcgccaaccg cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag

6481 gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagggggtc

6541 tagctgcgtc tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc

6601 gtcgaagtag tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc

6661 aagcgcgcgc tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga

6721 ggcgtacatg ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt

6781 agggtagcat cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg

6841 agcgaggagg tcgggaccgaggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg

6901 cctgaagatg gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc

6961 gtctgtgaga cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac

7021 cagctcggcg gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc

7081 atacttatcc tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc

7141 tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta

7201 gaactggttg acggcctggt aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg

7261 cgcggccttc cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctgacca tgactttgag

7321 gtactggtat ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt

7381 gcgctttttg gaacgcggat ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc

7441 cgcgcgaggc ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt

7501 aattacctgg gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta

7561 aagttccaag aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt

7621 gagctcttca ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt

7681 ggaagcgacg aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc atttgcaggt ggtcgcgaaa

7741 ggtcctaaac tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg

7801 gtcttgttcc cagcggtccc atccaaggtt cgcggctagg tctcgcgcgg cagtcactag

7861 aggctcatct ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc

7921 ccccatccaa gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg

7981 cgagccgatc gggaagaact ggatctcccg ccaccaattg gaggagtggc tattgatgtg

8041 gtgaaagtag aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc

8101 gcagtactgg cagcggtgca cgggctgtac atcctgcacg aggttgacct gacgaccgcg

8161 cacaaggaag cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc gggtttggct ggtggtcttc

8221 tacttcggct gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac

8281 caccacgccg cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac

8341 aacatcgcgc agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg

8401 gagctcctgc aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg cgggctagat ccaggtgata

8461 cctaatttcc aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg

8521 cggcgcgact acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc

8581 atctaaaagc ggtgacgcgg gcgagccccc ggaggtaggg ggggctccgg acccgccggg

8641 agagggggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga gctggtgctg cgcgcgtagg

8701 ttgctggcga acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag

8761 acgacgggcc cggtgagctt gagcctgaaa gagagttcga cagaatcaat ttcggtgtcg

8821 ttgacggcgg cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc

8881 tcggccatga actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg

8941 gtggcggcga ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc

9001 tcgttccaga cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc

9061 tgcgcgagat tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt agtttcgcag gcgctgaaag

9121 aggtagttga gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgtcgc

9181 aacgtggatt cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc

9241 acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga

9301 cggatgagct cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct

9361 tcttcttcaa tctcctcttc cataagggcc tccccttctt cttcttctgg cggcggtggg

9421 ggagggggga cacggcggcg acgacggcgc accgggaggc ggtcgacaaa gcgctcgatc

9481 atctccccgc ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc ggccgttctc gcgggggcgc

9541 agttggaaga cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg gcggggggct gccatgcggc

9601 agggatacgg cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg taggtactcc gccgccgagg

9661 gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag

9721 tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg

9781 tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg

9841 gtcgacagaa gcaccatgtc cttgggtccg gcctgctgaa tgcgcaggcg gtcggccatg

9901 ccccaggctt cgttttgaca tcggcgcagg tctttgtagt agtcttgcat gagcctttct

9961 accggcactt cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg

10021 gcggcggagt ttggccgtag gtggcgccct cttcctccca tgcgtgtgac cccgaagccc

10081 ctcatcggct gaagcagggc taggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc

10141 acctgcgtga gggtagactg gaagtcatcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg

10201 ttgatggtgt aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc

10261 gagagctcgg tgtacctgag acgcgagtaa gccctcgagt caaatacgta gtcgttgcaa

10321 gtccgcacca ggtactggta tcccaccaaa aagtgcggcg gcggctggcg gtagaggggc

10381 cagcgtaggg tggccggggc tccgggggcg agatcttcca acataaggcg atgatatccg

10441 tagatgtacc tggacatcca ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cggaaagtcg

10501 cggacgcggt tccagatgtt gcgcagcggc aaaaagtgct ccatggtcgg gacgctctgg

10561 ccggtcaggc gcgcgcaatc gttgacgctc tagaccgtgc aaaaggagag cctgtaagcg

10621 ggcactcttc cgtggtctgg tggataaatt cgcaagggta tcatggcgga cgaccggggt

10681 tcgagccccg tatccggccg tccgccgtga tccatgcggt taccgcccgc gtgtcgaacc

10741 caggtgtgcg acgtcagaca acgggggagt gctccttttg gcttccttcc aggcgcggcg

10801 gctgctgcgc tagctttttt ggccactggc cgcgcgcagc gtaagcggtt aggctggaaa

10861 gcgaaagcat taagtggctc gctccctgta gccggagggt tattttccaa gggttgagtc

10921 gcgggacccc cggttcgagt ctcggaccgg ccggactgcg gcgaacgggg gtttgcctcc

10981 ccgtcatgca agaccccgct tgcaaattcc tccggaaaca gggacgagcc ccttttttgc

11041 ttttcccaga tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc ctcctcagca gcggcaagag

11101 caagagcagc ggcagacatg cagggcaccc tcccctcctc ctaccgcgtc aggaggggcg

11161 acatccgcgg ttgacgcggc agcagatggt gattacgaac ccccgcggcg ccgggcccgg

11221 cactacctgg acttggagga gggcgagggc ctggcgcggc taggagcgcc ctctcctgag

11281 cggtacccaa gggtgcagct gaagcgtgat acgcgtgagg cgtacgtgcc gcggcagaac

11341 ctgtttcgcg accgcgaggg agaggagccc gaggagatgc gggatcgaaa gttccacgca

11401 gggcgcgagc tgcggcatgg cctgaatcgc gagcggttgc tgcgcgagga ggactttgag

11461 cccgacgcgc gaaccgggat tagtcccgcg cgcgcacacg tggcggccgc cgacctggta

11521 accgcatacg agcagacggt gaaccaggag attaactttc aaaaaagctt taacaaccac

11581 gtgcgtacgc ttgtggcgcg cgaggaggtg gctataggac tgatgcatct gtgggacttt

11641 gtaagcgcgc tggagcaaaa cccaaatagc aagccgctca tggcgcagct gttccttata

11701 gtgcagcaca gcagggacaa cgaggcattc agggatgcgc tgctaaacat agtagagccc

11761 gagggccgct ggctgctcga tttgataaac atcctgcaga gcatagtggt gcaggagcgc

11821 agcttgagcc tggctgacaa ggtggccgcc atcaactatt ccatgcttag cctgggcaag

11881 ttttacgccc gcaagatata ccatacccct tacgttccca tagacaagga ggtaaagatc

11941 gaggggttct acatgcgcat ggcgctgaag gtgcttacct tgagcgacga cctgggcgtt

12001 tatcgcaacg agcgcatcca caaggccgtg agcgtgagcc ggcggcgcga gctcagcgac

12061 cgcgagctga tgcacagcct gcaaagggcc ctggctggca cgggcagcgg cgatagagag

12121 gccgagtcct actttgacgc gggcgctgac ctgcgctggg ccccaagccg acgcgccctg

12181 gaggcagctg gggccggacc tgggctggcg gtggcacccg cgcgcgctgg caacgtcggc

12241 ggcgtggagg aatatgacga ggacgatgag tacgagccag aggacggcga gtactaagcg

12301 gtgatgtttc tgatcagatg atgcaagacg caacggaccc ggcggtgcgg gcggcgctgc

12361 agagccagcc gtccggcctt aactccacgg acgactggcg ccaggtcatg gaccgcatca

12421 tgtcgctgac tgcgcgcaat cctgacgcgt tccggcagca gccgcaggcc aaccggctct

12481 ccgcaattct ggaagcggtg gtcccggcgc gcgcaaaccc cacgcacgag aaggtgctgg

12541 cgatcgtaaa cgcgctggcc gaaaacaggg ccatccggcc cgacgaggcc ggcctggtct

12601 acgacgcgct gcttcagcgc gtggctcgtt acaacagcgg caacgtgcag accaacctgg

12661 accggctggt gggggatgtg cgcgaggccg tggcgcagcg tgagcgcgcg cagcagcagg

12721 gcaacctggg ctccatggtt gcactaaacg ccttcctgag tacacagccc gccaacgtgc

12781 cgcggggaca ggaggactac accaactttg tgagcgcact gcggctaatg gtgactgaga

12841 caccgcaaag tgaggtgtac cagtctgggc cagactattt tttccagacc agtagacaag

12901 gcctgcagac cgtaaacctg agccaggctt tcaaaaactt gcaggggctg tggggggtgc

12961 gggctcccac aggcgaccgc gcgaccgtgt ctagcttgct gacgcccaac tcgcgcctgt

13021 tgctgctgct aatagcgccc ttcacggaca gtggcagcgt gtcccgggac acatacctag

13081 gtcacttgct gacactgtac cgcgaggcca taggtcaggc gcatgtggac gagcatactt

13141 tccaggagat tacaagtgtc agccgcgcgc tggggcagga ggacacgggc agcctggagg

13201 caaccctaaa ctacctgctg accaaccggc ggcagaagat cccctcgttg cacagtttaa

13261 acagcgagga ggagcgcatt ttgcgctacg tgcagcagag cgtgagcctt aacctgatgc

13321 gcgacggggt aacgcccagc gtggcgctgg acatgaccgc gcgcaacatg gaaccgggca

13381 tgtatgcctc aaaccggccg tttatcaacc gcctaatgga ctacttgcat cgcgcggccg

13441 ccgtgaaccc cgagtatttc accaatgcca tcttgaaccc gcactggcta ccgccccctg

13501 gtttctacac cgggggattc gaggtgcccg agggtaacga tggattcctc tgggacgaca

13561 tagacgacag cgtgttttcc ccgcaaccgc agaccctgct agagttgcaa cagcgcgagc

13621 aggcagaggc ggcgctgcga aaggaaagct tccgcaggcc aagcagcttg tccgatctag

13681 gcgctgcggc cccgcggtca gatgctagta gcccatttcc aagcttgata gggtctctta

13741 ccagcactcg caccacccgc ccgcgcctgc tgggcgagga ggagtaccta aacaactcgc

13801 tgctgcagcc gcagcgcgaa aaaaacctgc ctccggcatt tcccaacaac gggatagaga

13861 gcctagtgga caagatgagt agatggaaga cgtacgcgca ggagcacagg gacgtgccag

13921 gcccgcgccc gcccacccgt cgtcaaaggc acgaccgtca gcggggtctg gtgtgggagg

13981 acgatgactc ggcagacgac agcagcgtcc tggatttggg agggagtggc aacccgtttg

14041 cgcaccttcg ccccaggctg gggagaatgt tttaaaaaaa aaaaagcatg atgcaaaata

14101 aaaaactcac caaggccatg gcaccgagcg ttggttttct tgtattcccc ttagtatgcg

14161 gcgcgcggcg atgtatgagg aaggtcctcc tccctcctac gagagtgtgg tgagcgcggc

14221 gccagtggcg gcggcgctgg gttctccctt cgatgctccc ctggacccgc cgtttgtgcc

14281 tccgcggtac ctgcggccta ccggggggag aaacagcatc cgttactctg agttggcacc

14341 cctattcgac accacccgtg tgtacctggt ggacaacaag tcaacggatg tggcatccct

14401 gaactaccag aacgaccaca gcaactttct gaccacggtc attcaaaaca atgactacag

14461 cccgggggag gcaagcacac agaccatcaa tcttgacgac cggtcgcact ggggcggcga

14521 cctgaaaacc atcctgcata ccaacatgcc aaatgtgaac gagttcatgt ttaccaataa

14581 gtttaaggcg cgggtgatgg tgtcgcgctt gcctactaag gacaatcagg tggagctgaa

14641 atacgagtgg gtggagttca cgctgcccga gggcaactac tccgagacca tgaccataga

14701 ccttatgaac aacgcgatcg tggagcacta cttgaaagtg ggcagacaga acggggttct

14761 ggaaagcgac atcggggtaaagtttgacac ccgcaacttc agactggggt ttgaccccgt

14821 cactggtctt gtcatgcctg gggtatatac aaacgaagcc ttccatccag acatcatttt

14881 gctgccagga tgcggggtgg acttcaccca cagccgcctg agcaacttgt tgggcatccg

14941 caagcggcaa cccttccagg agggctttag gatcacctac gatgatctgg agggtggtaa

15001 cattcccgca ctgttggatg tggacgccta ccaggcgagc ttgaaagatg acaccgaaca

15061 gggcgggggt ggcgcaggcg gcagcaacag cagtggcagc ggcgcggaag agaactccaa

15121 cgcggcagcc gcggcaatgc agccggtgga ggacatgaac gatcatgcca ttcgcggcga

15181 cacctttgcc acacgggctg aggagaagcg cgctgaggcc gaagcagcgg ccgaagctgc

15241 cgcccccgct gcgcaacccg aggtcgagaa gcctcagaag aaaccggtga tcaaacccct

15301 gacagaggac agcaagaaac gcagttacaa cctaataagc aatgacagca ccttcaccca

15361 gtaccgcagc tggtaccttg catacaacta cggcgaccct cagaccggaa tccgctcatg

15421 gaccctgctt tgcactcctg acgtaacctg cggctcggag caggtctact ggtcgttgcc

15481 agacatgatg caagaccccg tgaccttccg ctccacgcgc cagatcagca actttccggt

15541 ggtgggcgcc gagctgttgc ccgtgcactc caagagcttc tacaacgacc aggccgtcta

15601 ctcccaactc atccgccagt ttacctctct gacccacgtg ttcaatcgct ttcccgagaa

15661 ccagattttg gcgcgcccgc cagcccccac catcaccacc gtcagtgaaa acgttcctgc

15721 tctcacagat cacgggacgc taccgctgcg caacagcatc ggaggagtcc agcgagtgac

15781 cattactgac gccagacgcc gcacctgccc ctacgtttac aaggccctgg gcatagtctc

15841 gccgcgcgtc ctatcgagcc gcactttttg agcaagcatg tccatcctta tatcgcccag

15901 caataacaca ggctggggcc tgcgcttccc aagcaagatg tttggcgggg ccaagaagcg

15961 ctccgaccaa cacccagtgc gcgtgcgcgg gcactaccgc gcgccctggg gcgcgcacaa

16021 acgcggccgc actgggcgca ccaccgtcga tgacgccatc gacgcggtgg tggaggaggc

16081 gcgcaactac acgcccacgc cgccaccagt gtccacagtg gacgcggcca ttcagaccgt

16141 ggtgcgcgga gcccggcgct atgctaaaat gaagagacgg cggaggcgcg tagcacgtcg

16201 ccaccgccgc cgacccggca ctgccgccca acgcgcggcg gcggccctgc ttaaccgcgc

16261 acgtcgcacc ggccgacggg cggccatgcg ggccgctcga aggctggccg cgggtattgt

16321 cactgtgccc cccaggtcca ggcgacgagc ggccgccgca gcagccgcgg ccattagtgc

16381 tatgactcag ggtcgcaggg gcaacgtgta ttgggtgcgc gactcggtta gcggcctgcg

16441 cgtgcccgtg cgcacccgcc ccccgcgcaa ctagattgca agaaaaaact acttagactc

16501 gtactgttgt atgtatccag cggcggcggc gcgcaacgaa gctatgtcca agcgcaaaat

16561 caaagaagag atgctccagg tcatcgcgcc ggagatctat ggccccccga agaaggaaga

16621 gcaggattac aagccccgaa agctaaagcg ggtcaaaaag aaaaagaaag atgatgatga

16681 tgaacttgac gacgaggtgg aactgctgca cgctaccgcg cccaggcgac gggtacagtg

16741 gaaaggtcga cgcgtaaaac gtgttttgcg acccggcacc accgtagtct ttacgcccgg

16801 tgagcgctcc acccgcacct acaagcgcgt gtatgatgag gtgtacggcg acgaggacct

16861 gcttgagcag gccaacgagc gcctcgggga gtttgcctac ggaaagcggc ataaggacat

16921 gctggcgttg ccgctggacg agggcaaccc aacacctagc ctaaagcccg taacactgca

16981 gcaggtgctg cccgcgcttg caccgtccga agaaaagcgc ggcctaaagc gcgagtctgg

17041 tgacttggca cccaccgtgc agctgatggt acccaagcgc cagcgactgg aagatgtctt

17101 ggaaaaaatg accgtggaac ctgggctgga gcccgaggtc cgcgtgcggc caatcaagca

17161 ggtggcgccg ggactgggcg tgcagaccgt ggacgttcag atacccacta ccagtagcac

17221 cagtattgcc accgccacag agggcatgga gacacaaacg tccccggttg cctcagcggt

17281 ggcggatgcc gcggtgcagg cggtcgctgc ggccgcgtcc aagacctcta cggaggtgca

17341 aacggacccg tggatgtttc gcgtttcagc cccccggcgc ccgcgcggtt cgaggaagta

17401 cggcgccgcc agcgcgctac tgcccgaata tgccctacat ccttccattg cgcctacccc

17461 cggctatcgt ggctacacct accgccccag aagacgagca actacccgac gccgaaccac

17521 cactggaacc cgccgccgcc gtcgccgtcg ccagcccgtg ctggccccga tttccgtgcg

17581 cagggtggct cgcgaaggag gcaggaccct ggtgctgcca acagcgcgct accaccccag

17641 catcgtttaa aagccggtct ttgtggttct tgcagatatg gccctcacct gccgcctccg

17701 tttcccggtg ccgggattcc gaggaagaat gcaccgtagg aggggcatgg ccggccacgg

17761 cctgacgggc ggcatgcgtc gtgcgcacca ccggcggcgg cgcgcgtcgc accgtcgcat

17821 gcgcggcggt atcctgcccc tccttattcc actgatcgcc gcggcgattg gcgccgtgcc

17881 cggaattgca tccgtggcct tgcaggcgca gagacactga ttaaaaacaa gttgcatgtg

17941 gaaaaatcaa aataaaaagt ctggactctc acgctcgctt ggtcctgtaa ctattttgta

18001 gaatggaaga catcaacttt gcgtctctgg ccccgcgaca cggctcgcgc ccgttcatgg

18061 gaaactggca agatatcggc accagcaata tgagcggtgg cgccttcagc tggggctcgc

18121 tgtggagcgg cattaaaaat ttcggttcca ccgttaagaa ctatggcagc aaggcctgga

18181 acagcagcac aggccagatg ctgagggata agttgaaaga gcaaaatttc caacaaaagg

18241 tggtagatgg cctggcctct ggcattagcg gggtggtgga cctggccaac caggcagtgc

18301 aaaataagat taacagtaag cttgatcccc gccctcccgt agaggagcct ccaccggccg

18361 tggagacagt gtctccagag gggcgtggcg aaaagcgtcc gcgccccgac agggaagaaa

18421 ctctggtgac gcaaatagac gagcctccct cgtacgagga ggcactaaag caaggcctgc

18481 ccaccacccg tcccatcgcg cccatggcta ccggagtgctgggccagcac acacccgtaa

18541 cgctggacct gcctcccccc gccgacaccc agcagaaacc tgtgctgcca ggcccgaccg

18601 ccgttgttgt aacccgtcct agccgcgcgt ccctgcgccg cgccgccagc ggtccgcgat

18661 cgttgcggcc cgtagccagt ggcaactggc aaagcacact gaacagcatc gtgggtctgg

18721 gggtgcaatc cctgaagcgc cgacgatgct tctgaatagc taacgtgtcg tatgtgtgtc

18781 atgtatgcgt ccatgtcgcc gccagaggag ctgctgagcc gccgcgcgcc cgctttccaa

18841 gatggctacc ccttcgatga tgccgcagtg gtcttacatg cacatctcgg gccaggacgc

18901 ctcggagtac ctgagccccg ggctggtgca gtttgcccgc gccaccgaga cgtacttcag

18961 cctgaataac aagtttagaa accccacggt ggcgcctacg cacgacgtga ccacagaccg

19021 gtcccagcgt ttgacgctgc ggttcatccc tgtggaccgt gaggatactg cgtactcgta

19081 caaggcgcgg ttcaccctag ctgtgggtga taaccgtgtg ctggacatgg cttccacgta

19141 ctttgacatc cgcggcgtgc tggacagggg ccctactttt aagccctact ctggcactgc

19201 ctacaacgcc ctggctccca agggtgcccc aaatccttgc gaatgggatg aagctgctac

19261 tgctcttgaa ataaacctag aagaagagga cgatgacaac gaagacgaag tagacgagca

19321 agctgagcag caaaaaactc acgtatttgg gcaggcgcct tattctggta taaatattac

19381 aaaggagggt attcaaatag gtgtcgaagg tcaaacacct aaatatgccg ataaaacatt

19441 tcaacctgaa cctcaaatag gagaatctca gtggtacgaa actgaaatta atcatgcagc

19501 tgggagagtc cttaaaaaga ctaccccaat gaaaccatgt tacggttcat atgcaaaacc

19561 cacaaatgaa aatggagggc aaggcattct tgtaaagcaa caaaatggaa agctagaaag

19621 tcaagtggaa atgcaatttt tctcaactac tgaggcgacc gcaggcaatg gtgataactt

19681 gactcctaaa gtggtattgt acagtgaaga tgtagatata gaaaccccag acactcatat

19741 ttcttacatg cccactatta aggaaggtaa ctcacgagaa ctaatgggcc aacaatctat

19801 gcccaacagg cctaattaca ttgcttttag ggacaatttt attggtctaa tgtattacaa

19861 cagcacgggt aatatgggtg ttctggcggg ccaagcatcg cagttgaatg ctgttgtaga

19921 tttgcaagac agaaacacag agctttcata ccagcttttg cttgattcca ttggtgatag

19981 aaccaggtac ttttctatgt ggaatcaggc tgttgacagc tatgatccag atgttagaat

20041 tattgaaaat catggaactg aagatgaact tccaaattac tgctttccac tgggaggtgt

20101 gattaataca gagactctta ccaaggtaaa acctaaaaca ggtcaggaaa atggatggga

20161 aaaagatgct acagaatttt cagataaaaa tgaaataaga gttggaaata attttgccat

20221 ggaaatcaat ctaaatgcca acctgtggag aaatttcctg tactccaaca tagcgctgta

20281 tttgcccgac aagctaaagt acagtccttc caacgtaaaa atttctgata acccaaacac

20341 ctacgactac atgaacaagc gagtggtggc tcccgggtta gtggactgct acattaacct

20401 tggagcacgc tggtcccttg actatatgga caacgtcaac ccatttaacc accaccgcaa

20461 tgctggcctg cgctaccgct caatgttgct gggcaatggt cgctatgtgc ccttccacat

20521 ccaggtgcct cagaagttct ttgccattaa aaacctcctt ctcctgccgg gctcatacac

20581 ctacgagtgg aacttcagga aggatgttaa catggttctg cagagctccc taggaaatga

20641 cctaagggtt gacggagcca gcattaagtt tgatagcatt tgcctttacg ccaccttctt

20701 ccccatggcc cacaacaccg cctccacgct tgaggccatg cttagaaacg acaccaacga

20761 ccagtccttt aacgactatc tctccgccgc caacatgctc taccctatac ccgccaacgc

20821 taccaacgtg cccatatcca tcccctcccg caactgggcg gctttccgcg gctgggcctt

20881 cacgcgcctt aagactaagg aaaccccatc actgggctcg ggctacgacc cttattacac

20941 ctactctggc tctataccct acctagatgg aaccttttac ctcaaccaca cctttaagaa

21001 ggtggccatt acctttgact cttctgtcag ctggcctggc aatgaccgcc tgcttacccc

21061 caacgagttt gaaattaagc gctcagttga cggggagggt tacaacgttg cccagtgtaa

21121 catgaccaaa gactggttcc tggtacaaat gctagctaac tacaacattg gctaccaggg

21181 cttctatatc ccagagagct acaaggaccg catgtactcc ttctttagaa acttccagcc

21241 catgagccgt caggtggtgg atgatactaa atacaaggac taccaacagg tgggcatcct

21301 acaccaacac aacaactctg gatttgttgg ctaccttgcc cccaccatgc gcgaaggaca

21361 ggcctaccct gctaacttcc cctatccgct tataggcaag accgcagttg acagcattac

21421 ccagaaaaag tttctttgcg atcgcaccct ttggcgcatc ccattctcca gtaactttat

21481 gtccatgggc gcactcacag acctgggcca aaaccttctc tacgccaact ccgcccacgc

21541 gctagacatg acttttgagg tggatcccat ggacgagccc acccttcttt atgttttgtt

21601 tgaagtcttt gacgtggtcc gtgtgcaccg gccgcaccgc ggcgtcatcg aaaccgtgta

21661 cctgcgcacg cccttctcgg ccggcaacgc cacaacataa agaagcaagc aacatcaaca

21721 acagctgccg ccatgggctc cagtgagcag gaactgaaag ccattgtcaa agatcttggt

21781 tgtgggccat attttttggg cacctatgac aagcgctttc caggctttgt ttctccacac

21841 aagctcgcct gcgccatagt caatacggcc ggtcgcgaga ctgggggcgt acactggatg

21901 gcctttgcct ggaacccgca ctcaaaaaca tgctacctct ttgagccctt tggcttttct

21961 gaccagcgac tcaagcaggt ttaccagttt gagtacgagt cactcctgcg ccgtagcgcc

22021 attgcttctt cccccgaccg ctgtataacg ctggaaaagt ccacccaaag cgtacagggg

22081 cccaactcgg ccgcctgtgg actattctgc tgcatgtttc tccacgcctt tgccaactgg

22141 ccccaaactc ccatggatca caaccccacc atgaacctta ttaccggggt acccaactcc

22201 atgctcaaca gtccccaggt acagcccacc ctgcgtcgca accaggaaca gctctacagc

22261 ttcctggagc gccactcgcc ctacttccgc agccacagtg cgcagattag gagcgccact

22321 tctttttgtc acttgaaaaa catgtaaaaa taatgtacta gagacacttt caataaaggc

22381 aaatgctttt atttgtacac tctcgggtga ttatttaccc ccacccttgc cgtctgcgcc

22441 gtttaaaaat caaaggggtt ctgccgcgca tcgctatgcg ccactggcag ggacacgttg

22501 cgatactggt gtttagtgct ccacttaaac tcaggcacaa ccatccgcgg cagctcggtg

22561 aagttttcac tccacaggct gcgcaccatc accaacgcgt ttagcaggtc gggcgccgat

22621 atcttgaagt cgcagttggg gcctccgccc tgcgcgcgcg agttgcgata cacagggttg

22681 cagcactgga acactatcag cgccgggtgg tgcacgctgg ccagcacgct cttgtcggag

22741 atcagatccg cgtccaggtc ctccgcgttg ctcagggcga acggagtcaa ctttggtagc

22801 tgccttccca aaaagggcgc gtgcccaggc tttgagttgc actcgcaccg tagtggcatc

22861 aaaaggtgac cgtgcccggt ctgggcgtta ggatacagcg cctgcataaa agccttgatc

22921 tgcttaaaag ccacctgagc ctttgcgcct tcagagaaga acatgccgca agacttgccg

22981 gaaaactgat tggccggaca ggccgcgtcg tgcacgcagc accttgcgtc ggtgttggag

23041 atctgcacca catttcggcc ccaccggttc ttcacgatct tggccttgct agactgctcc

23101 ttcagcgcgc gctgcccgtt ttcgctcgtc acatccattt caatcacgtg ctccttattt

23161 atcataatgc ttccgtgtag acacttaagc tcgccttcga tctcagcgca gcggtgcagc

23221 cacaacgcgc agcccgtggg ctcgtgatgc ttgtaggtca cctctgcaaa cgactgcagg

23281 tacgcctgca ggaatcgccc catcatcgtc acaaaggtct tgttgctggt gaaggtcagc

23341 tgcaacccgc ggtgctcctc gttcagccag gtcttgcata cggccgccag agcttccact

23401 tggtcaggca gtagtttgaa gttcgccttt agatcgttat ccacgtggta cttgtccatc

23461 agcgcgcgcg cagcctccat gcccttctcc cacgcagaca cgatcggcac actcagcggg

23521 ttcatcaccg taatttcact ttccgcttcg ctgggctctt cctcttcctc ttgcgtccgc

23581 ataccacgcg ccactgggtc gtcttcattc agccgccgca ctgtgcgctt acctcctttg

23641 ccatgcttga ttagcaccgg tgggttgctg aaacccacca tttgtagcgc cacatcttct

23701 ctttcttcct cgctgtccac gattacctct ggtgatggcg ggcgctcggg cttgggagaa

23761 gggcgcttct ttttcttctt gggcgcaatg gccaaatccg ccgccgaggt cgatggccgc

23821 gggctgggtg tgcgcggcac cagcgcgtct tgtgatgagt cttcctcgtc ctcggactcg

23881 atacgccgcc tcatccgctt ttttgggggc gcccggggag gcggcggcga cggggacggg

23941 gacgacacgt cctccatggt tgggggacgt cgcgccgcac cgcgtccgcg ctcgggggtg

24001 gtttcgcgct gctcctcttc ccgactggcc atttccttct cctataggca gaaaaagatc

24061 atggagtcag tcgagaagaa ggacagccta accgccccct ctgagttcgc caccaccgcc

24121 tccaccgatg ccgccaacgc gcctaccacc ttccccgtcg aggcaccccc gcttgaggag

24181 gaggaagtga ttatcgagca ggacccaggt tttgtaagcg aagacgacga ggaccgctca

24241 gtaccaacag aggataaaaa gcaagaccag gacaacgcag aggcaaacga ggaacaagtc

24301 gggcgggggg acgaaaggca tggcgactac ctagatgtgg gagacgacgt gctgttgaag

24361 catctgcagc gccagtgcgc cattatctgc gacgcgttgc aagagcgcag cgatgtgccc

24421 ctcgccatag cggatgtcag ccttgcctac gaacgccacc tattctcacc gcgcgtaccc

24481 cccaaacgcc aagaaaacgg cacatgcgag cccaacccgc gcctcaactt ctaccccgta

24541 tttgccgtgc cagaggtgct tgccacctat cacatctttt tccaaaactg caagataccc

24601 ctatcctgcc gtgccaaccg cagccgagcg gacaagcagc tggccttgcg gcagggcgct

24661 gtcatacctg atatcgcctc gctcaacgaa gtgccaaaaa tctttgaggg tcttggacgc

24721 gacgagaagc gcgcggcaaa cgctctgcaa caggaaaaca gcgaaaatga aagtcactct

24781 ggagtgttgg tggaactcga gggtgacaac gcgcgcctag ccgtactaaa acgcagcatc

24841 gaggtcaccc actttgccta cccggcactt aacctacccc ccaaggtcat gagcacagtc

24901 atgagtgagc tgatcgtgcg ccgtgcgcag cccctggaga gggatgcaaa tttgcaagaa

24961 caaacagagg agggcctacc cgcagttggc gacgagcagc tagcgcgctg gcttcaaacg

25021 cgcgagcctg ccgacttgga ggagcgacgc aaactaatga tggccgcagt gctcgttacc

25081 gtggagcttg agtgcatgca gcggttcttt gctgacccgg agatgcagcg caagctagag

25141 gaaacattgc actacacctt tcgacagggc tacgtacgcc aggcctgcaa gatctccaac

25201 gtggagctct gcaacctggt ctcctacctt ggaattttgc acgaaaaccg ccttgggcaa

25261 aacgtgcttc attccacgct caagggcgag gcgcgccgcg actacgtccg cgactgcgtt

25321 tacttatttc tatgctacac ctggcagacg gccatgggcg tttggcagca gtgcttggag

25381 gagtgcaacc tcaaggagct gcagaaactg ctaaagcaaa acttgaagga cctatggacg

25441 gccttcaacg agcgctccgt ggccgcgcac ctggcggaca tcattttccc cgaacgcctg

25501 cttaaaaccc tgcaacaggg tctgccagac ttcaccagtc aaagcatgtt gcagaacttt

25561 aggaacttta tcctagagcg ctcaggaatc ttgcccgcca cctgctgtgc acttcctagc

25621 gactttgtgc ccattaagta ccgcgaatgc cctccgccgc tttggggcca ctgctacctt

25681 ctgcagctag ccaactacct tgcctaccac tctgacataa tggaagacgt gagcggtgac

25741 ggtctactgg agtgtcactg tcgctgcaac ctatgcaccc cgcaccgctc cctggtttgc

25801 aattcgcagc tgcttaacga aagtcaaatt atcggtacct ttgagctgca gggtccctcg

25861 cctgacgaaa agtccgcggc tccggggttg aaactcactc cggggctgtg gacgtcggct

25921 taccttcgca aatttgtacc tgaggactac cacgcccacg agattaggtt ctacgaagac

25981 caatcccgcc cgccaaatgc ggagcttacc gcctgcgtca ttacccaggg ccacattctt

26041 ggccaattgc aagccatcaa caaagcccgc caagagtttc tgctacgaaa gggacggggg

26101 gtttacttgg acccccagtc cggcgaggag ctcaacccaa tccccccgcc gccgcagccc

26161 tatcagcagc agccgcgggc ccttgcttcc caggatggca cccaaaaaga agctgcagct

26221 gccgccgcca cccacggacg aggaggaata ctgggacagt caggcagagg aggttttgga

26281 cgaggaggag gaggacatga tggaagactg ggagagccta gacgaggaag cttccgaggt

26341 cgaagaggtg tcagacgaaa caccgtcacc ctcggtcgca ttcccctcgc cggcgcccca

26401 gaaatcggca accggttcca gcatggctac aacctccgct cctcaggcgc cgccggcact

26461 gcccgttcgc cgacccaacc gtagatggga caccactgga accagggccg gtaagtccaa

26521 gcagccgccg ccgttagccc aagagcaaca acagcgccaa ggctaccgct catggcgcgg

26581 gcacaagaac gccatagttg cttgcttgca agactgtggg ggcaacatct ccttcgcccg

26641 ccgctttctt ctctaccatc acggcgtggc cttcccccgt aacatcctgc attactaccg

26701 tcatctctac agcccatact gcaccggcgg cagcggcagc ggcagcaaca gcagcggcca

26761 cacagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa tccacagcgg

26821 cggcagcagc aggaggagga gcgctgcgtc tggcgcccaa cgaacccgta tcgacccgcg

26881 agcttagaaa caggattttt cccactctgt atgctatatt tcaacagagc aggggccaag

26941 aacaagagct gaaaataaaa aacaggtctc tgcgatccct cacccgcagc tgcctgtatc

27001 acaaaagcga agatcagctt cggcgcacgc tggaagacgc ggaggctctc ttcagtaaat

27061 actgcgcgct gactcttaag gactagtttc gcgccctttc tcaaatttaa gcgcgaaaac

27121 tacgtcatct ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt cgtcagcgcc attatgagca

27181 aggaaattcc cacgccctac atgtggagtt accagccaca aatgggactt gcggctggag

27241 ctgcccaaga ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc gggaccccac atgatatccc

27301 gggtcaacgg aatccgcgcc caccgaaacc gaattctctt ggaacaggcg gctattacca

27361 ccacacctcg taataacctt aatccccgta gttggcccgc tgccctggtg taccaggaaa

27421 gtcccgctcc caccactgtg gtacttccca gagacgccca ggccgaagtt cagatgacta

27481 actcaggggc gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt gcggtcgccc gggcagggta

27541 taactcacct gacaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa cgacgagtcg gtgagctcct

27601 cgcttggtct ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg cgccggccgt ccttcattca

27661 cgcctcgtca ggcaatccta actctgcaga cctcgtcctc tgagccgcgc tctggaggca

27721 ttggaactct gcaatttatt gaggagtttg tgccatcggt ctactttaac cccttctcgg

27781 gacctcccgg ccactatccg gatcaattta ttcctaactt tgacgcggta aaggactcgg

27841 cggacggcta cgactgaatg ttaagtggag aggcagagca actgcgcctg aaacacctgg

27901 tccactgtcg ccgccacaag tgctttgccc gcgactccgg tgagttttgc tactttgaat

27961 tgcccgagga tcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg gcttaccgcc cagggagagc

28021 ttgcccgtag cctgattcgg gagtttaccc agcgccccct gctagttgag cgggacaggg

28081 gaccctgtgt tctcactgtg atttgcaact gtcctaacct tggattacat caagatcttt

28141 gttgccatct ctgtgctgag tataataaat acagaaatta aaatatactg gggctcctat

28201 cgccatcctg taaacgccac cgtcttcacc cgcccaagca aaccaaggcg aaccttacct

28261 ggtactttta acatctctcc ctctgtgatt tacaacagtt tcaacccaga cggagtgagt

28321 ctacgagaga acctctccga gctcagctac tccatcagaa aaaacaccac cctccttacc

28381 tgccgggaac gtacgagtgc gtcaccggcc gctgcaccac acctaccgcc tgaccgtaaa

28441 ccagactttt tccggacaga cctcaataac tctgtttacc agaacaggag gtgagcttag

28501 aaaaccctta gggtattagg ccaaaggcgc agctactgtg gggtttatga acaattcaag

28561 caactctacg ggctattcta attcaggttt ctctagaatc ggggttgggg ttattctctg

28621 tcttgtgatt ctctttattc ttatactaac gcttctctgc ctaaggctcg ccgcctgctg

28681 tgtgcacatt tgcatttatt gtcagctttt taaacgctgg ggtcgccacc caagatgatt

28741 aggtacataa tcctaggttt actcaccctt gcgtcagccc acggtaccac ccaaaaggtg

28801 gattttaagg agccagcctg taatgttaca ttcgcagctg aagctaatga gtgcaccact

28861 cttataaaat gcaccacaga acatgaaaag ctgcttattc gccacaaaaa caaaattggc

28921 aagtatgctg tttatgctat ttggcagcca ggtgacacta cagagtataa tgttacagtt

28981 ttccagggta aaagtcataa aacttttatg tatacttttc cattttatga aatgtgcgac

29041 attaccatgt acatgagcaa acagtataag ttgtggcccc cacaaaattg tgtggaaaac

29101 actggcactt tctgctgcac tgctatgcta attacagtgc tcgctttggt ctgtacccta

29161 ctctatatta aatacaaaag cagacgcagc tttattgagg aaaagaaaat gccttaattt

29221 actaagttac aaagctaatg tcaccactaa ctgctttact cgctgcttgc aaaacaaatt

29281 caaaaagtta gcattataat tagaatagga tttaaacccc ccggtcattt cctgctcaat

29341 accattcccc tgaacaattg actctatgtg ggatatgctc cagcgctaca accttgaagt

29401 caggcttcct ggatgtcagc atctgacttt ggccagcacc tgtcccgcgg atttgttcca

29461 gtccaactac agcgac(此处缺失29477-29714nt)

ATC GAT(人为加入的ClaI酶切位点)(以下大写部分为反义STAT3序列)TTGCCGCCTCTTCCAGTCAGCCAGCTCCTCGTCCGTGAGAGTTTTCTGCACGTACTCCATCGCTGACAAAAGCCCCGCCAGCTCACTCACGATGCTTCTCCGCATCTGGTCCAGCGCAGTGAGCATCTGTTCCAGCTGCTGCATCTTCTGCCTGGTCACTGACTGGTTGTTTCCATTCAGATCTTGCATGTCTCCTTGACTCTTGAGGGTTTTATAGTTGAAATCAAAGTCATCCTGGAGATTCTCTACCACTTTCATTTTCTGTTCTAGATCCTGCACTCTCTTCCGGACATCCTGAAGGTGCTGCTCCAGCATCTGCTGCTTCTCCGTCACCACGGCTGCTGTGGGGTGGTTGGCCTGGCCCCCTTGCTGGGCCGCAGTGGCTGCAGTCTGTAGAAGGCGTGATTCTTCCCACAGGCACCGGGCCACAATCCGGGCAATCTCCATTGGCTTCTCAAGATACCTGCTCTGAAGAAACTGCTTGATTCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAACATTCGACTCTTGCAGGAAGCGGCTATACTGCTGGTCAATCTCTCCCAGGAGATTATGAAACACCAAAGTGGCATGTGATTCTTTGCTGGCCGCATATGCCCAATCTTGACTCTCAATCCAAGGGGCCAGAAACTGCCGCAGCTCCATTGGGAAGCTGTCACTGTAGAGCTGATGGAGCTGCTCCAGGTACCGTGTGTCAAGCTGCTGTAGCTGATTCCATTGGGCCATCCTGTTTCTCCGGCAGAGGCCGAGAGGCC ATC GAT(人为加入的ClaI酶切位点)

29701   atgatgg aatccataga ttggacggac tgaaacacat gttcttttct

29761 cttacagtat gattaaatga gacatgattc ctcgagtttt tatattactg acccttgttg

29821 cgcttttttg tgcgtgctcc acattggctg cggtttctca catcgaagta gactgcattc

29881 cagccttcac agtctatttg ctttacggat ttgtcaccct cacgctcatc tgcagcctca

29941 tcactgtggt catcgccttt atccagtgca ttgactgggt ctgtgtgcgc tttgcatatc

30001 tcagacacca tccccagtac agggacagga ctatagctga gcttcttaga attctttaat

30061 tatgaaattt actgtgactt ttctgctgat tatttgcacc ctatctgcgt tttgttcccc

30121 gacctccaag cctcaaagac atatatcatg cagattcact cgtatatgga atattccaag

30181 ttgctacaat gaaaaaagcg atctttccga agcctggtta tatgcaatca tctctgttat

30241 ggtgttctgc agtaccatct tagccctagc tatatatccc taccttgaca ttggctggaa

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