一种用于抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物

摘要

本发明公开了一种用于抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物。该药物活性成分为抑制氨基酸序列如GenBank No.NM 006475所示的蛋白的编码基因表达的核酸。实验证明，本发明的抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物，使瘢痕疙瘩成纤维细胞中与瘢痕形成呈正相关的periostin基因的表达减少45％，下降到接近于正常皮肤成纤维细胞的水平；使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性有所降低，主要表现在DNA合成期(S期)细胞比例的下降；使periostin在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达受到抑制，从而使瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率增加。因此，本发明药物在抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞的增殖中具有显著的作用，从而对过度增生性瘢痕的形成具有抑制作用，适合于推广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物。

背景技术

创伤愈合与组织修复，是医学领域最古老的问题之一。瘢痕是皮肤组织创伤修复的必然产物。创伤愈合后，正常情况下在人体形成扁平瘢痕(flat scar，FS)；但在一部分人群可形成明显高于皮肤表面的过度增生性瘢痕，它包括瘢痕疙瘩(keloid，K)和增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)。过度增生性瘢痕不但影响患者的美观，甚至会影响患者的身体机能。特别是K，往往呈瘤样生长，超过原伤口界限而侵犯周围正常皮肤，手术切除后极易复发，有研究发现瘢痕疙瘩有家族聚集现象，提示它和遗传有密切关联；而HS与之不同，仅在原伤口界限内生长，可以发生退行性变，致挛缩，切除后不复发。当然，两者也有很多共同点，如组织学上均以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积和胶原降解减少为特征，都有好发部位，有色人种好发，青壮年较老年人好发等等。另外，瘢痕疙瘩可由细微损伤发展而来，也可能并无明显诱因造成。因此，亟待需要一种有效的手段来解决过度增生性瘢痕的生成问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物。

本发明所提供的用于抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物，其活性成分为抑制氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白的编码基因表达的核酸。

所述核酸可以为现有技术中的任一种，如抑制上述编码基因表达的反义DNA序列、抑制上述编码基因表达的shRNA、抑制上述编码基因表达的shRNA、含有编码上述shRNA的DNA序列的载体、能与上述氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示蛋白的编码基因发生同源重组的载体等。

其中，所述核酸具体可以为如下的shRNA；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc。所述环的序列具体可为ucucuugaa。

所述核酸具体可以为编码上述shRNA的DNA分子；所述DNA分子的核苷酸序列依次为编码上述茎I的DNA序列、编码所述环的DNA序列和编码上述茎II的DNA序列；编码所述茎I的DNA序列具体可为ttcaacattca cgttgctc，编码所述茎II的DNA序列具体可为gagcaacgt gaatgttgaa。所述编码所述环的DNA序列具体可为ttcaagaga。

所述核酸具体可为含有上述DNA分子的核苷酸序列的重组载体。具体可以是将上述DNA分子的核苷酸序列插入pGCsi载体的多克隆位点得到的重组载体。

实验证明，本发明的抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物，使瘢痕疙瘩成纤维细胞中与瘢痕形成呈正相关的periostin基因的表达减少45％，下降到接近于正常皮肤成纤维细胞的水平，同时使CollAI的表达减少43％、TGF-β的表达减少44％、MMP-1的表达增加75％，这些基因的表达均改变到接近于SFb水平；使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性有所降低，主要表现在DNA合成期(S期)细胞比例的下降；使periostin在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达受到抑制，从而使瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率增加。因此，本发明药物在抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞的增殖中具有显著的作用，从而对过度增生性瘢痕的形成具有抑制作用，适合于推广。

附图说明

图1为体外培养的人正常皮肤成纤维细胞形态(200×)。

图2为SFb、HFb及KFb的增殖曲线。

图3为KFb、HFb和SFb的periostin和GAPDH基因的PCR产物电泳图。

图4为Periostin蛋白在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达。

图5为双链oligo DNA电泳图。

图6为shRNA载体构建的流程示意图。

图7为shRNA载体PCR鉴定结果图。

图8为转染比例为质粒(ug)：Lipo(ul)＝1：1.25；转染后36h，KFb的生长情况(200×)。

图9为G418(300ug/ml)作用下成纤维细胞的变化，A、B、C、D分别显示成纤维细胞经G418作用后的第3、6、9、12天的变化。

图10为periostin shRNA质粒稳定转染后KFb生长情况(P₂，×200)。

图11为periostin shRNA质粒转染后KFb的凋亡变化。

图12为periostin shRNA质粒转染KFb后KFb的细胞周期变化。

图13为periostin表达干扰实验的KFb和SFb相关基因的PCR产物电泳图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中用到的试剂等来源如下：

澳洲胎牛血清(FBS)          HyClone，美国

DMEM(高糖型)培养基         GIBCO-BRL公司，美国

Opti-MEM培养基             GIBCO-BRL公司，美国

青链霉素                   华北制药厂，中国

MTT                        Sigma，美国

DMSO(细胞冻存用)           Sigma，美国

Trizol RNA提取试剂盒       Invitrogen，美国

RT-PCR试剂盒               Invitrogen，美国

焦炭酸二乙酯(DEPC)         Sigma，美国；

胰蛋白酶                   GIBICO，美国

琼脂糖                     Biowest，西班牙

溴化乙锭                   Sigma，美国

溴酚蓝                     Genview，美国

二甲苯青FF                 Sigma，美国

Tris碱                     罗氏公司，美国

EDTA.Na.2 H₂O              Genview，美国

DAB显色试剂盒              ZYMED，美国

多聚赖氨酸处理的磨砂片子   北京鼎国生物公司，中国

引物合成                   上海生物工程技术有限公司，中国

periostin多克隆抗体        Abcam，英国

100bp marker I             北京普博欣生物技术有限公司，中国

HEPES                      DNN公司

Triton—X100               Sigma，美国

甘氨酸                     BBI，加拿大

通用型SP Kit(SP-9000)               YMED，美国

periostin过表达质粒                 本实验室构建

Lipofectamine 2000                  Invitrogen，美国

G418抗生素(25mg/ml)                 Keygen，中国南京

Annexin V-FITC凋亡试剂盒            Keygen，中国南京

细胞周期检测试剂盒                  Keygen，中国南京

pGCsi载体                           上海吉凯基因公司，中国

BamH I、Hind III限制性内切酶酶      New England Biolabs公司

大肠杆菌感受态细胞DH5a              Promega，美国

质粒抽提试剂盒                      Promega，美国

结合缓冲液(Binding buffer)          上海麦莎生物科技有限公司，中国

1.DMEM培养基：

DMEM                  1袋

HEPES                 2.38g

L-G                   0.2g

丙酮酸钠              0.33g

NaHCO₃                3.7g

加纯水至1000ml，搅拌2～6h，用1mol/l的HCl或NaOH调节PH值为7.0左右，滤过除菌(Φ0.22μm)，分装后-20℃保存，备用。

2.完全DMEM培养基：90％(V/V)的不完全DMEM培养基+10％(V/V)的胎牛血清(血清用前灭活：56℃，30min)+青-链双抗(终浓度为100u/ml)，补加L-G，每间隔一个月，宜补加半浓度。

3.双抗液(青-链霉素)：超净台内，青霉素80万U加入4ml高温灭菌水；链霉素100万U加入5ml高温灭菌水后取出4ml；混合二者为8ml，过滤，分装入1ml的EP管中，-20℃保存、备用。

4.细胞培养用0.01M PBS(PH7.0-7.2)

磷酸二氢钠(2H₂O)       0.2g

氯化钠                 8.5g

磷酸氢二钠(12H₂O)      3.12g

纯水              至1000ml

5.G418工作液：浓度为25mg/ml，依据实验需要配制成所需的工作浓度。

6.MTT工作液：MTT(sigma)250mg，纯水50ml，充分搅拌，使其溶解；过滤分装，-20℃保存，备用。

7.胎牛血清：用前需灭活：56℃，灭活30min。

8.DEPC水：

DEPC                       1ml

双蒸水                     1000ml

室温过夜，15磅高压15min

9.4％多聚甲醛：

多聚甲醛                   4g

双蒸水                     100ml

60℃搅拌，滴加少量1M NaOH，溶解后冷却，过滤，室温保存

10.0.2％Triton—X100制备

Triton—X100               0.2ml

1×PBS                     100ml

混匀后，室温静置24h后使用。

11.1.5％琼脂糖胶制备

琼脂糖                     0.34g

0.5×TBE(用5×TBE稀释)     22.5ml

EB(10ug/ul)                3ul

12.LB培养液1000ml：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加适量去离子水溶解，1M NaOH调pH值至7.0，去离子水定容至1000ml。

13.LA培养液1000ml：LB培养液1000ml，高压灭菌20min，待温度降至60℃以下时，加入氨苄青霉素至终浓度100μg/ml。

14.SOB：1ml250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液。

实施例1、氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白periostin及其编码基因periostin在人皮肤成纤维细胞中的表达

(一)人皮肤成纤维细胞的增殖周期

(1)实验材料

实验材料：人正常皮肤成纤维细胞(SFb)、人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)、人增生性瘢痕成纤维细胞(HFb)。

实验材料来源如下：

人正常皮肤成纤维细胞(SFb)：以正常皮肤组织为实验材料，通过组织块培养方法分离得到，所述正常皮肤组织取自美容手术或植皮修剪弃用组织，经过患者同意；

人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)：以瘢痕疙瘩皮肤组织为实验材料，通过组织块培养方法分离得到，所述瘢痕疙瘩皮肤组织取自离体的瘢痕疙瘩皮肤病变组织，经过患者同意；

人增生性瘢痕成纤维细胞(HFb)：以增生性瘢痕皮肤组织为实验材料，通过组织块培养方法分离得到，所述增生性瘢痕皮肤组织取自离体的增生性瘢痕皮肤病变组织，经过患者同意；

(2)细胞的分离及原代培养

下述细胞的分离及原代培养中，除特殊说明外，所用的细胞培养基均为含20％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM(高糖型)培养基。

在无菌操作下，将上述各种皮肤组织均去除皮下组织，用生理盐水冲洗，再将皮肤组织分别置于含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养液中(每毫升培养液含100IU青霉素和100IU链霉素)，放4℃冰箱中，24h内用组织块接种法分别进行成纤维细胞原代培养，具体方法如下：

1.将组织块用PBS液(每毫升含100IU青霉素和100IU链霉素)洗2次；

2.用眼科剪彻底清除表皮和皮下脂肪组织；

3.PBS液洗2次；

4.在少量DMEM中将组织剪成约0.5mm³大小碎块，PBS液漂洗5-10次，至液体不混浊、无油滴、清亮为止；

5.用弯头吸管吸取组织碎块，接种于装有细胞培养基的25cm²培养瓶，间距0.5cm，将组织块的切面贴于瓶底上，吸除多余液体。

6.轻翻培养瓶，使瓶底朝上。加入细胞培养基2ml，旋上瓶盖。在95％空气、5％二氧化碳、37℃饱和湿度条件下培养4-5h，使组织块较牢固地粘附于瓶壁上。

7.之后轻翻培养瓶，使培养液与组织块接触，勿晃，3-4天内不要观察和翻动，以免影响组织块贴壁及生长；

8.每3-5天换液一次，3-4周后长成的单层贴壁细胞即为原代人真皮成纤维细胞(人正常皮肤成纤维细胞或人瘢痕疙瘩成纤维细胞或人增生性瘢痕成纤维细胞)。

显微镜下观察细胞形态，其中人正常皮肤成纤维细胞的形态如图1所示，表明，贴壁生长的成纤维细胞镜下呈梭形，胞体较大，具有突起。

(3)细胞的传代培养

下述细胞的传代培养中，除特殊说明外，所用的细胞培养基均为含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM(高糖型)培养基。

1.传代前24h，用细胞培养基换液一次；

2.吸除培养瓶内旧培养液，PBS洗2次；

3.用0.25％胰蛋白酶消化液0.5ml消化细胞，在室温下，于倒置显微镜上观察细胞，待胞质回缩、胞体变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化；

4.加入新鲜配制的细胞培养基3ml，用吸管把细胞从瓶壁上轻柔吹打下来，使其成为细胞悬液，混匀；

5.细胞计数，调整细胞浓度为5×10⁵个/ml，1:2分种传代；

6.待细胞生长至90％融合时，再进行分种传代。传代前一天用细胞培养基换液一次，通常每3-4日分种传代一次。

(4)成纤维细胞的冻存

下述细胞的冻存中，除特殊说明外，所用的细胞培养基均为含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM(高糖型)培养基。

1.细胞冻存24h前，细胞培养基换液一次；

2.吸除培养瓶内旧培养液，PBS液洗2次；

3.用0.25％胰蛋白酶消化液0.5ml消化细胞，在室温下，于倒置显微镜上，观察细胞，待胞质回缩、胞体变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化；

4.加入新鲜配制的细胞培养基3ml，用吸管把细胞从瓶壁上轻柔吹打下来；

5.细胞计数，调整细胞浓度为5×10⁶～1×10⁷个/ml；

6.转移细胞至10ml离心管中，1000转/min，离心5min；

7.弃上清，加入细胞冻存液，使成纤维细胞浓度为5×10⁶～1×10⁷个/ml，将细胞悬液转移至细胞冻存管，做好标记；

8.4℃放置30min，-20℃放置30-40mim，-80℃放置可过夜，转入液氮。

(5)成纤维细胞的复苏

下述细胞的复苏中，除特殊说明外，所用的细胞培养基均为含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM(高糖型)培养基。

1.将成纤维细胞从液氮中取出，立即放入预热的37℃水浴锅中，使冰冻细胞重新形成细胞悬液；

2.转移细胞悬液至离心管，1000转/min，离心5min；

3.弃上清，加入细胞培养基清洗细胞2次；

4.转入细胞培养瓶，加细胞培养基，于95％空气、5％二氧化碳、37℃饱和湿度条件下培养，24h后换液一次；

(6)MTT法检测KFb、HFb、SFb的增殖周期

本实验中，除特殊说明外，所用的细胞培养基均为含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM(高糖型)培养基。

1.取传代培养第2-5代(P_2～5)的KFb、HFb、SFb细胞进行实验，经复苏后，分别接种于装有细胞培养基的25cm²的细胞培养瓶中各自培养。

2.待细胞密度达70％时，吸除培养瓶内旧培养液，PBS洗2次；

3.用0.25％胰蛋白酶消化液0.5ml消化细胞，在室温下，于倒置显微镜上，观察细胞，待胞质回缩、胞体变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化；

4.铺板：收集此对数期细胞，调整细胞密度为(5～10)×10³个/ml，分于96孔板，每孔200μl，1000～2000个/孔。

5.置37℃、5％CO₂温箱培养使细胞贴壁，培养24小时。

6.吸去上清，加入80μl新鲜细胞培养基，每孔再加入20ul MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h。

7.吸掉上清，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm处测量当天三孔的吸光值。

8.其余各孔细胞继续培养，每个样本每天设三个平行复孔，连续检测7天。

实验设3次重复，结果取平均数，结果如表1所示。

表1、SFb、HFb和KFb的增殖变化

三种细胞的增殖变化见图2所示(A表示SFb，B表示HFb，C表示KFb)，表明，三种细胞都有1～2d的潜伏期，第5～6d达生长高峰，之后进入平台期；增殖活性表现为KFb>HFb>SFb。

(二)Periostin基因在人皮肤成纤维细胞中的表达量

1、实验方法：

实验材料：取实验(一)中第2-5代的各组细胞分别进行实验

(1)成纤维细胞总RNA的提取：

用Trizol试剂提取，按照博大泰克公司真核细胞总RNA提取试剂盒说明书提取各组中人真皮成纤维细胞总RNA。具体步骤如下：

1.收集P_2-5对数生长期的细胞，调整细胞密度为(1～2)×10⁶/ml；

2.将(1～2)×10⁶个细胞转移到无菌、无RNA酶的1.5ml的EP管中；

3.加入1.0mlTrizol试剂于此1.5mlEP管中，Vortex振荡器充分震荡混匀；

4.冰上静置5min；

5.按照350μl氯仿/1mlTrizol的比例加入适量氯仿，充分振摇，静置分层；

6.4℃，12000rpm离心10min；

7.将上清液移至另一无菌、无RNA酶的1.5mlEp管中；

8.上清液相中加入等体积异丙醇(4℃预冷)；

9.混匀，-20℃放置1h；

10.离心，4℃ 12000rpm 20min；

11.倒掉上清液异丙醇，加入250μl 75％乙醇(用DEPC水配制)，轻柔晃荡洗涤沉淀，倒掉乙醇，倒置小管，待乙醇蒸发干燥后加20μl DEPC水溶解沉淀；

12.用紫外分光光度计检测A260nm及A280nm光密度值，记录，按照公式：“RNA浓度＝A260×稀释倍数×40μg/μl”计算浓度。

(2)反转录得到cDNA：

反应体系如下：dNTPs 1μl，MMLV 1μl，5×MMLV buffer 4μl，Oligod(T)1μl，Rasin 0.4μl，RNA 1.5μg，补DEPC水至20μl。

(3)根据GenBank No.NM_006475所示的基因periostin序列设计PCR扩增Periostin基因的引物，所用的PCR引物如下：

1)periostin(705bp)

正向：5′-CTG CAA CGGAGA GAC TCA AGA-3′，

反向：5′-ACG GTC AAT GAC ATG GAC AAC-3′；

2)GAPDH(189bp)

正向：5′-GACACCCACTCCTCCACCTTTGA-3′，

反向：5′-CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′

每一反应管取10μl产物在0.5×TBE缓冲液中用1.5％琼脂糖凝胶电泳，100v，约30min。电泳结束后，用0.5μg/ml的EB染色45min，在紫外灯下观察到特异条带在预定位置。利用凝胶成像分析系统扫描每个目的条带的紫外光吸收量。测算每个标本扩增的目的条带的紫外光吸收量值与其相应内参照基因(GAPDH)条带的紫外光吸收量值的比值(R)，代表该样本细胞目的基因mRNA的相对表达量。

2、实验结果：

(1)periostin mRNA在细胞中表达量的结果：

基因PCR实验结果如图3所示(A表示HFb，B表示KFb，C表示SFb，I表示periostin基因(705bp)，II表示GAPDH基因(189bp))。

计算每一标本periostin基因电泳条带的紫外光吸收量与GAPDH基因条带的紫外光吸收量值的比值(R)及各组数据的均值，结果详见表2和表3所示。

表2、KFb、HFb和SFb中periostin mRNA的表达

单因素方差分析显示，periostin mRNA在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量比在正常皮肤成纤维细胞中的表达量高83％(P<0.01)，periostin mRNA在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量比在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达量高34％(P<0.05)；它在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达量比在正常皮肤成纤维细胞中的表达量高75％(P<0.01)(表2、表3)。

表3、KFb、HFb和SFb中periostin mRNA的表达的统计分析

与SFb相比，^**p<0.01；与KFb相比，^#p<0.05

(三)periostin蛋白在人瘢痕成纤维细胞中的表达量及分布

本实验中所用的细胞培养基，除特殊说明外，均为含有10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养基。

(1)细胞爬片的制备：

1.传代前24h，用细胞培养基换液一次；

2.吸除培养瓶内旧培养液，PBS洗2次；

3.用0.25％胰蛋白酶消化液0.5ml消化细胞，在室温下，于倒置显微镜上，观察细胞胞质体回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；

4.加入新鲜配制的细胞培养基3ml，用吸管把细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，使其成为细胞悬液，混匀；

5.细胞计数，调整细胞浓度为5×10⁵个/ml；

6.灭菌盖玻片放入干净的小培养皿中，将浓度为5×10⁵个/ml的细胞悬液滴于盖玻片上；或将玻片铺在平皿里，细胞悬液滴于平皿中。

7.于95％空气、5％二氧化碳、37℃饱和湿度条件下培养24h；

8.24h后将小皿取出，用PBS洗3次；

9.4％多聚甲醛室温下固定15-30分钟，用纯水洗3次；

10.用树胶将细胞爬片细胞面朝上粘于载玻片上，室温干燥，4℃保存，备用。

(2)periostin免疫细胞化学染色

1.细胞爬片浸入纯水，不做抗原修复；

2.PBS洗5min；

3.0.2％Triton-x100破膜15min；

4.PBS洗5min×3次；

5.3％H₂O₂封闭20min；

6.蒸馏水洗5min×2次；PBS洗5min×3次；

7.3％羊血清室温封闭30min；

8.兔抗人periostin多克隆抗体(1:200，PBS稀释)孵育，4℃，过夜；阴性对照用PBS代替一抗；

9.PBS洗5min×3次；

10.生物素标记羊抗兔IgG孵育，30min；

11.PBS洗5min×3次；

12.辣根过氧化物酶标记链霉卵白素孵育，30min；

13.PBS洗5min×3次；

14.DAB显色：3～5min；

15.自来水冲洗10min，苏木精复染核(作数据统计分析的爬片无此步)；

16.常规脱水上行，透明，封片；

17.Olympus SH-2光学显微镜观察、摄像并分析；

18.结果观察，其中出现棕黄色显色者为阳性反应。

所有数据以均数±标准差表示。采用SPSS13.0分析软件进行统计学处理。单因素方差分析(ANOVA)用以检验组间差异，HC给药细胞与对照细胞的基因表达差异用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

光镜下(×400)倍，每例标本检测10个视野，计算每个视野中Periostin蛋白阳性成纤维细胞的百分比，然后求其平均值，结果见表4。

表4、Periostin蛋白阳性成纤维细胞的百分比

单因素方差分析显示，瘢痕疙瘩成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中Periostin蛋白表达阳性的细胞比例(分别为91.815±0.961和70.166±2.250)均高于正常皮肤成纤维细胞(41.011±1.576，均P<0.01)，详见表5和图4(A中箭头所示为DAB染色阳性的细胞(×200)，B中箭头所示为DAB染色阴性的细胞(×200))。表明，Periostin蛋白在所取的24例标本培养的成纤维细胞的胞浆中均有表达，其阳性反应主要集中在核周围。

表5、过度增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞Periostin的蛋白表达

^**与SFb组比较，P<0.01

实施例2、抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的过度增殖的药物及验证

本实施例中，除特殊说明外，所用的细胞培养基均为含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM(高糖型)培养基。

本实施例中是制备一种药物，以抑制Periostin基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达，从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的过度增殖，进而抑制过度增生性瘢痕形成。

本实施例中是用shRNA抑制上述基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达的。

所述shRNA根据Periostin基因的序列进行设计的，其作用的靶序列为GAGCAACGTGAATGTTGAA，该shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA，茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc，环的序列为ucucuugaa，茎I和茎II反向互补。

实验过程如下：

一、shRNA质粒的构建

1、shRNA质粒的构建方法：

(1)构建双链DNA oligo片段

人工合成DNA oligo片段的一条链的序列为GATCCCgaGAGCAACGTGAATGTTGAATTCAAGAGA TTCAACATTCACGTTGCTCtc TTTTTGGAT；另一条链的序列为AGCTATCCAAAAAgaGAGCAACGTGAATGTTGAA TCTCTTGAA TTCAACATTCACGTTGCTCtc GG(其中编码shRNA的茎I的序列为ttcaacattca cgttgctc，编码shRNA的茎II的序列为gagcaacgtgaatgttgaa，编码shRNA的环的序列为ttcaagaga)，然后在如下条件下退火合成双链DNA oligo片段：

反应体系如下：

将体系混匀，90℃温育4分钟，70℃温育10分钟，缓慢冷却至室温。得到双链DNA oligo片段。

12％PAEG非变性PAGE凝胶检测双链形成效率，结果如图5所示(A表示双链DNA，B表示单链DNA，其中第1泳道为单链DNA对照，第2泳道为双链DNA对照，第5泳道为本实验中构建的双链DNA)，表明，双链结构正确，可以准备连接。

(2)重组载体构建

构建流程图如图6所示。

用限制性内切酶BamH I和Hind III酶切pGCsi载体(上海吉凯生物技术有限公司)，回收目的载体片段，酶切反应体系如下：

酶切反应体系20ul：纯化的DNA质粒(1ug/ul)1ul，10×buffer(10×)2ul，ddH20 15ul，BamH I(10U/ul)1ul，Hind III(10U/ul)1ul。将上述混合的反应物置于37℃，1h；加人0.5mol/L EDTA(pH8.0)使终浓度达10mmol/L，终止反应。

将上述酶切后的载体与步骤(1)中合成的双链DNA oligo片段进行连接，连接反应体系表6(其中，对照1指没有加退火的DNA片段的连接，用来判断载体的自连情况，对照2指没有加载体DNA，应该是没有克隆形成的，以判断体系是否有污染。)；于4℃，12小时连接反应，制备克隆连接液，准备转化。

表6、连接反应体系

将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a，挑选阳性克隆；用菌液PCR法对阳性克隆进行鉴定，所用的引物序列为：Up：5’-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3’，Down：5’-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3’，以空载体pGCsi载体为阴性对照，以NC载体为阳性对照(克隆如果条带大小和阳性对照一致，则说明已构建进入载体。)，挑选出含有DNA oligo片段的阳性克隆；提取阳性质粒，测序(Invitrogen公司进行377型测序仪进行测序分析)，测得的序列如序列表中SEQ ID №.1所示(自5’末端第224-289位核苷酸与oligoDNA的序列相符)，结果表明，得到了正确插入DNA oligo片段的阳性质粒，备用。

PCR检测结果如图7所示(泳道1表示ddH₂O阴性对照；泳道2表示marker：5，3，2，1.5，1Kb，750，500，250，100bp)；泳道3表示空载体阴性对照；泳道4表示NC载体阳性对照；泳道5-9表示本发明构建的重组载体)。

二、shRNA质粒转染瘢痕疙瘩成纤维细胞

(一)转染条件摸索

1、转染中质粒与Lipofectamine 2000最佳比例的确定

1).取一瓶P₃代的生长良好、融合度在80-90％的未经任何处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞KFb，弃去培养基上清液，加2ml PBS洗两次，去除细胞碎片和细胞生长代谢物。

2).加入1ml胰酶(0.25％)室温消化1-2分钟；

3).弃去胰酶，加3-4ml完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)小心吹打均匀，注意吹打力度不能伤及细胞。显微镜下观察细胞呈单个球形，即可接种。

4.调整细胞密度为2×10⁵/ml，按每孔500μl将细胞悬液接种到24孔板中。依实验设计，质粒(ug)与Lipofectamine 2000(ul)的比值取五个比值(如表2.2.1)，每个比值设2个平行复孔，共接种10个孔。

5).接种的细胞在Opti-MEM培养基中培养24小时，使其融合度达70-80％。

6).每孔中将0.8μg RNAi质粒与50ul Opti-MEM轻轻混匀，室温下孵育5分钟；

7).每孔中，将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，按不同浓度与50μlOpti-MEM混合，在室温下孵育5分钟。

8).把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

9).混匀后，在室温下孵育20分钟，以便形成质粒DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。

10).把质粒DNA与Lipofectamine 2000的混合液加入到24孔板中细胞，混匀液体。然后将培养板送入细胞培养箱。

11).在转染满8小时后可以更换新鲜的含血清的完全培养液。

12).转染后36小时或者48小时荧光显微镜下观察。

表7、转染时质粒与脂质体的最佳比例

实验设3次重复，结果如表7和图8所示。

结果表明，质粒与Lipofectamine 2000的比值为1ug:1.25ul和1ug:2.5ul时，两孔的转染效率要高于其它比例下的转染效率，约15％左右；但在1:2.5时，细胞死亡较多，故确定二者比例最佳为1：1.25。

2、G418抗生素在稳定转染中的最佳浓度筛选

1.取一瓶P₃的生长良好、融合度在80-90％的KFb，弃去培养基上清液，加2mlPBS洗两次，去除细胞碎片和细胞生长代谢物；

2.加入1ml胰酶(0.25％)室温消化1-2分钟；

3.弃去胰酶，加3-4ml细胞培养基小心吹打均匀，注意吹打力度不能伤及细胞。显微镜下观察细胞呈单个球形，即可接种；

4.调整细胞密度为10⁴/ml，按每孔500μl将细胞悬液接种到24孔板中；

5.将24孔板送入培养箱中培养6小时；

6.按下表所示，配制8个不同的浓度的G418(25mg/ml)培养基，开始筛选。

7.筛选时间为10～14天，期间换细胞培养基。

表8、G418浓度筛选实验

结果如表8所示。经筛选，2周后细胞全部死亡的G418最低浓度是300ug/ml。在此浓度下，瘢痕疙瘩成纤维细胞在G418作用的第3、6、9和12天的变化分别如图9中A、B、C、D所示。

(二)转染步骤如下：

1.将2×10⁵个瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于装有细胞培养基的6孔板中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24～36h，细胞生长密度达70％～80％融合后，换成无血清DMEM。

2.每孔要添加的shRNA质粒与Lipofectamine如下配置，在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：

管A：2.0μg shRNA质粒溶于100μl无血清高糖DMEM培养基中，室温孵育5min；

管B：2.5μl Lipofectamine溶于97μl无血清高糖DMEM培养基中，室温孵育5min。

3.将管A和管B混匀，其中shRNA质粒与Lipofectamine的比例为1ug质粒；1.25ul Lipo，室温下置20min。

4.吸去6孔板中的细胞培养液，用无血清高糖DMEM培养基洗涤细胞2次。

5.加1ml无血清高糖DMEM培养基至Lipofectamine-DNA混合物中轻轻混匀，再将混匀后溶液滴加至细胞培养板内，各孔补加1ml无血清高糖DMEM培养基。

6.在CO₂培养箱培养6h。

7.吸出转染液，加4ml细胞培养基继续培养24h。

8.弃去培养液，更换含有浓度为300ug/ml的G418的细胞培养基继续培养。

9.8～10天后运用倍比稀释对能够生长的单个细胞集落进行克隆筛选，获得的即为转入shRNA质粒的细胞。

镜下观察转入shRNA质粒的细胞的生长情况，如图10所示，表明转染细胞生长良好，荧光显微镜下观察已经有绿色荧光蛋白表达，说明干扰序列片段已在转染细胞内表达。

将如上获得的转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞进行扩大培养，再用600ug/ml的G418进行筛选，将能在高浓度G418的环境中稳定生长的细胞克隆进行传代，用于体外表达的研究。

三、成功转染的细胞的性能检测

(一)转入shRNA质粒的KFb细胞的凋亡变化

1.调整转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞的浓度为5×10⁵～1×10⁶个/ml；

2.取1ml细胞悬液，1000r/min，4℃离心10min，弃上清；

3.加1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；

4.1000r/min，4℃离心10min，弃上清；

5.重复3、4步一次；

6.用500ul Binding buffer将细胞重悬；

7.加10ulAnnexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15min或4℃反应30min；

8.再加入5ul PI；

9.用流式细胞仪检测；

10.用流式仪自带的分析软件分析Annexin V阳性并且PI阴性细胞所占百分比。

正常对照组：未经转染的正常皮肤成纤维细胞(SFb)，

自身对照组：未经转染的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)，

阴性对照组：转入空载体pGCsi载体的瘢痕疙瘩成纤维细胞(K^-Fb)，

实验组：转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞(K⁺Fb)。

实验设3次重复，结果如表9和图11所示(A表示K⁺Fb，B表示SFb，C表示KFb，D表示K^-Fb)。

表9、KFb Periostin表达干扰后细胞凋亡变化

^**与自身对照组(KFb)比较，p<0.01；^##与阴性对照组(K^-Fb)比较，p<0.01；

^ΔΔ与正常对照组(SFb)比较，p<0.01。

图11表明，K⁺Fb组凋亡有所增加，KFb比SFb的凋亡率低38％；K^-Fb与KFb的凋亡率比较无明显变化；K⁺Fb与KFb相比凋亡率增加84％有统计学意义(p<0.01)，达到正常皮肤成纤维细胞的凋亡水平。说明，转入shRNA质粒后，periostin在细胞中的表达受到抑制，从而使细胞的凋亡率增加。

(二)KFb转染了shRNA质粒后的细胞周期变化

1.取P_2-5处于对数生长期的KFb、SFb细胞，其中KFb分为实验组(K⁺Fb)(转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞)、自身对照组(KFb)(未经任何转染处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞)、阴性对照组(K^-Fb)(转入空质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞)，SFb作为未经任何处理的正常对照组。

2.用PBS洗涤细胞一次，2000rpm，离心5min，收集并调整细胞浓度为1×10⁶个/ml；

3.制备的单细胞悬液用70％乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；

4.加100ulRNAase 37℃水浴30min；

5.再加入400ulPI染色混匀，4℃避光30min；

6.流式细胞仪检测，用细胞周期分析软件记录每例细胞的G₀-G₁期、S期和G₂-M期所占的百分比。

实验设3次重复，结果如表10和图12所示(A表示SFb，B表示K⁺Fb，C表示KFb，D表示K^-Fb；纵坐标为细胞数目，横坐标为通道，Debris表示细胞碎片，Aggregates表示细胞团块，Dip G1：DNA复制前期，Dip G2：DNA复制后期，Dip S：DNA复制期)。

表10、KFb Periostin表达干扰后细胞周期变化

^**与自身对照组(KFb)比较，p<0.01；^##和阴性对照组比较，p<0.01

^ΔΔ与正常对照组(SFb)比较，p<0.01

结果表明，未经任何处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)的S期细胞比例比正常皮肤成纤维细胞高207％；空质粒转染的瘢痕疙瘩成纤维细胞(K^-Fb)的细胞周期，与未经任何处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)相比，并未改变；转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞(K⁺Fb)的细胞周期发生明显改变，与未经任何处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)相比，其S期细胞比例减少61％，G₀～G₁期细胞比例增加32％，两者均有统计学意义(p<0.01)，均已接近正常皮肤成纤维细胞水平。表明，转入shRNA质粒后，瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性有所降低，主要表现在DNA合成期(S期)细胞比例的下降。

(三)RT-PCR法检测转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞中periostin的表达情况

1.取P_2-5处于对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞、正常皮肤细胞，其中瘢痕疙瘩成纤维细胞的每一例分为实验组(转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞，K⁺Fb)、自身对照组(未经任何转染处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞，KFb)、阴性对照组(转入空载体的瘢痕疙瘩成纤维细胞，K^-Fb)，正常皮肤细胞作为正常对照组(未经任何处理的正常皮肤细胞，SFb)。

2.提取各组细胞的总mRNA，并分别反转录成cDNA；

3.分别以上述cDNA为模板，分别采用以下引物进行PCR扩增：

Periostin(705bp)基因PCR扩增引物：

正向：5′-CTG CAA CGGAGA GAC TCA AGA-3′，

反向：5′-ACG GTC AAT GAC ATG GAC AAC-3′；

Coll α1(I型前胶原)基因(407bp)PCR扩增引物：

正向：5′-AGCCAGCAGATCGAGAACATCC-3′，

反向：5′-ACGCTGTTCTTGCAGTGGTAGG-3′；

MMP-1(基质金属蛋白酶-1)基因(518bp)PCR扩增引物：

正向：5′-CCTGGAATTGGCCACAAAGTTG-3′，

反向：5′-CGGCAAAGACTCATGTCTCCTG-3′；

TGF-β基因(340bp)PCR扩增引物：

正向：5′-CAG CAA CAA TTC CTG GCG ATA C-3′，

反向：5′-GCT GAA GCA ATA GTT GGT GTC C-3′；

GAPDH基因(189bp)PCR扩增引物：

正向：5′-GACACCCACTCCTCCACCTTTGA-3′，

反向：5′-CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′；

每一反应管取10μl产物在0.5×TBE缓冲液中用1.5％琼脂糖凝胶电泳，100v，约30min。电泳结束后，用0.5μg/ml的EB染色45min，在紫外灯下观察到特异条带在预定位置。利用凝胶成像分析系统扫描每个目的条带的紫外光吸收量。测算每个标本扩增的目的条带的紫外光吸收量值与其相应内参照基因(GAPDH)条带的紫外光吸收量值的比值(R)，代表该样本细胞目的基因mRNA的相对表达量。

所有数据以均数±标准差表示。采用SPSS13.0分析软件进行统计学处理。单因素方差分析(ANOVA)检验组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

实验设3次重复，结果如表11和图13所示(A表示SFb，B表示KFb，C表示K^-Fb，D表示K⁺Fb，I表示基因periostin(705bp)，II表示基因TGF-β1(340bp)，III表示基因CollAI(407bp)，IV表示基因MMP-1(518bp)，V表示基因GAPDH(250bp))。

表11、periostin表达干扰实验中periostin、TGF-β、CollAI和MMP-1mRNA的表达情况

^**与KFb比较，p<0.01；^##和K^-Fb组比较，p<0.01

^ΔΔ与SFb比较，p<0.01

结果表明，未经任何处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞比较，periostin基因表达上调约87％，CollαI基因增高78％，TGF-β1基因增多86％，MMP-1基因下调45％。转入空质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞与未经任何处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞相比，其中periostin基因的表达量并未改变。转入shRNA质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞(K⁺Fb)与未经任何处理的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)相比，其中，periostin基因的表达确实减少45％，下降到接近于正常皮肤成纤维细胞的水平，说明periostin表达干扰成功；其中CollAI的表达减少43％，TGF-β的表达减少44％，MMP-1的表达增加75％，这些基因的表达均改变到接近于SFb水平。periostin表达受干扰后，periostin、TGF-β和CollAI各基因在K⁺Fb组的表达均有下降的趋势，MMP-1的表达呈上升趋势。

序列表

<110>北京大学第三医院

<120>一种用于抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物

<130>CGGNARC81961

<160>1

<210>1

<211>984

<212>DNA

<220>

<223>

<400>1